环状RNA在肠息肉分子标志物中的应用的制作方法

环状rna在肠息肉分子标志物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，特别涉及环状rna在肠息肉分子标志物中的应用。


背景技术：

2.肠息肉是一种广泛且常见的疾病，通常起病隐匿，且容易复发。因此寻找新型标志物，对肠息肉辅助筛查、防治复发具有积极意义。环状rna(circular rna、circrna)广泛存在于真核细胞内，由可变剪切产生，多具有高度保守序列，不具有5’末端帽子及3’末端ploy a尾巴结构，呈闭合环状结构，因而不易被rna外切酶降解，较线性rna表达更为稳定
1.。绝大多数环状rna是非编码rna，在转录或转录后水平发挥调控作用，但也有少数可以翻译为多肽。
3.研究表明，环状rna在人类多种疾病中存在差异表达，发挥重要作用。环状rna可调节转录、剪接和染色质相互作用，参与转录的调控、选择性剪接和染色质环化；可发挥竞争性内源性rna的作用，海绵状吸附微小rna进而调节靶基因表达。circrna还可与不同蛋白质结合，充当蛋白支架，或竞争性结合蛋白
2.。此外，环状rna在人外周血中表达也具有较高丰度，可成为疾病早期诊断和疾病病程相关的新型标志物
3.。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供环状rna在制备防治肠息肉的药物、早期筛查和/或辅助诊断肠息肉的工具中的应用。
5.本发明的第二个目的在于提供用于检测血浆中环状rna表达水平的试剂在制备防治肠息肉的药物、早期筛查和/或辅助诊断肠息肉的工具中的应用。
6.本发明的第三个目的在于提供环状rna作为分子标志物(药物靶标)在筛选防治肠息肉的药物、及防治肠息肉复发和/或恶变的药物中的应用。
7.本发明的第四个目的在于提供环状rna在制备诊断肠黏膜损伤的工具中的应用。
8.本发明的第五个目的在于提供环状rna在制备促进肠黏膜损伤修复的药物中的应用。
9.本发明的目的通过下述技术方案实现：
10.环状rna在制备防治肠息肉的药物、早期筛查和/或辅助诊断肠息肉的工具中的应用；其中，所述的环状rna为circhadha，即hsa_circ_0053063。
11.所述的防治肠息肉的药物包括用于预防和治疗肠息肉的药物，以及用于预防(防止)和治疗肠息肉复发、恶变的药物。
12.所述的circhadha(circbase数据库circrna id:hsa_circ_0053063)呈封闭环状结构，在外周血中稳定存在，该环状rna分子含微小rna应答元件，可充当竞争性内源rna，与微小rna
‑
361结合，进而调节靶基因的表达水平。
13.所述的circhadha在肠上皮细胞中通过调节mir
‑
361提高细胞自噬相关基因atg13的表达水平，抑制肠上皮细胞中细胞炎症因子的表达水平，实现防治肠息肉或肠息肉复发、
恶变的目的。
14.所述的细胞炎症因子包括但不限于il
‑
1β、il
‑
17a、il
‑
1α、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
4、il
‑
6、il
‑
9、il
‑
10、il
‑
12、il
‑
13、ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
γ、tnf
‑
α、tnf
‑
β和tgf
‑
β。
15.所述的circhadha可以是天然的或人工合成的，或者使用可以表达circhadha的dna片段的载体转染细胞获得；如血浆中的circhadha，更适用于临床检测，使操作更具可行性。
16.所述的载体包括病毒载体、真核载体。
17.所述的病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体。
18.所述的疱疹病毒包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒、eb病毒等。
19.所述的真核表达载体可以是任何适当的载体，包括但不限于plcdh
‑
cir表达载体、pcmt
‑
myc表达载体、pcdna3.0表达载体、pcdna6.0表达载体、pegfp表达载体、pef bos表达载体、ptet表达载体、ptre表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，如pbin438、pcambia1301等。
20.所述的工具包括但不限于试剂盒、试纸、芯片、高通量测序平台。
21.所述的工具包括用于检测circhadha表达水平的试剂。
22.所述的试剂盒包括检测circhadha的引物和/或探针。
23.进一步的，所述的试剂盒中用于检测circhadha的引物和/或探针还可包括针对现有技术中已经报道的可以用于检测所述环状rna表达水平的引物和/或探针。
24.所述的芯片包括固相载体以及固定在所述固相载体上的环状rna探针。
25.所述的环状rna探针为fish探针，其序列如下所示：
[0026]5’‑
caagcggctaacatgccaggggt
‑3’
。
[0027]
进一步的，所述的芯片上固定的环状rna探针还可包括诊断现有技术中已报道的可用于检测circhadha的表达水平的环状rna探针。
[0028]
进一步的，所述的环状rna探针包括特异性的对应于circhadha的部分或全部序列。
[0029]
进一步的，所述的固相载体可采用基于芯片领域的各种常规材料，包括但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
[0030]
所述的试纸包括针对检测circhadha的引物和/或探针。
[0031]
所述的高通量测序平台包括针对检测circhadha的引物和/或探针。
[0032]
所述的检测circhadha的引物序列包括pcr检测引物、发散性引物以及pcr产物测序引物中的至少一种；其中，
[0033]
(1)pcr检测引物如下所示：
[0034]
上游引物：5
’‑
aaaatgggactggttgaccaact
‑3’
；
[0035]
下游引物：5
’‑
ctgtgcttcttgtgatagctgtg
‑3’
；
[0036]
(2)发散性引物(divergent primers)如下所示：
[0037]
上游引物：5
’‑
tggtggaacccctggcatgt
‑3’
；
[0038]
下游引物：5
’‑
caggcaggatccattgatggc
‑3’
；
[0039]
(3)pcr产物测序引物如下所示：
[0040]
上游引物：5
’‑
ggacatgatgctgactggtaga
‑3’
；
[0041]
下游引物：5
’‑
atggcaacctcaagtcctcctc
‑3’
。
[0042]
所述的检测circhadha的探针为fish探针，其序列如下所示：
[0043]5’‑
caagcggctaacatgccaggggt
‑3’
。
[0044]
所述的环状rna在制备提高细胞自噬相关基因atg13的表达的药物中的应用其中。
[0045]
所述的环状rna(circhadha)在肠上皮细胞中可通过调节mir
‑
361促进细胞自噬相关基因atg13的表达水平。
[0046]
用于检测血浆中所述环状rna的表达水平的试剂在制备防治肠息肉的药物、早期筛查和/或辅助诊断肠息肉的工具中的应用。
[0047]
所述的环状rna作为分子标志物(药物靶标)在筛选防治肠息肉的药物、及防治肠息肉复发和/或恶变的药物中的应用。
[0048]
在得知所述的circhadha与肠息肉的密切相关性后，可以基于该特征来筛选调节circhadha表达的物质，进而可从所述的物质中找到对于预防和治疗肠息肉复发与恶变真正有用的药物，因此，本发明还提供了一种促进肠黏膜损伤修复的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候选物质处理损伤状态下的肠上皮相关细胞体系，若所述候选物质可促进前面所述的circhadha表达或提高其活性，则表明该候选物质是促进肠上皮损伤修复的潜在物质。
[0049]
所述的防治肠息肉的药物包括用于预防和治疗肠息肉的药物，如抑制肠息肉生长的药物等。
[0050]
所述的细胞体系可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等；优选的，对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以进一步选择和确定对于促进肠黏膜损伤修复真正有用的物质。
[0051]
所述的环状rna在制备诊断肠黏膜损伤的工具中的应用。
[0052]
所述的诊断肠黏膜损伤的工具包括但不限于试剂盒、试纸、芯片、高通量测序平台。
[0053]
所述的诊断肠黏膜损伤的工具包括用于检测circhadha表达水平的试剂。
[0054]
所述的环状rna在制备促进肠黏膜损伤修复的药物中的应用。
[0055]
进一步的，所述的药物包括有效剂量的circhadha的促进剂；所述促进剂能够促进circhadha的表达、或能够提高circhadha的活性、或能够促进circhadha有效作用时间、或能提高circhadha稳定性。
[0056]
进一步的，所述的促进剂的靶标不限于circhadha本身，还包括circhadha的上下游，例如：编码circhadha的基因组序列，circhadha的调控的基因或蛋白、调控circhadha的基因或蛋白。
[0057]
进一步的，所述的促进剂包括蛋白质、寡核苷酸、小分子化合物、表达质粒(包括寡核苷酸表达载体)、慢病毒液、和/或小干扰rna。
[0058]
进一步的，所述的药物还可以包括有效剂量的circhadha的抑制剂；所述抑制剂能够抑制circhadha的降解。
[0059]
进一步的，所述的抑制剂的靶标不限于circhadha本身，还包括circhadha的上下
游，例如：编码circhadha的基因组序列，circhadha的调控的基因或蛋白、调控circhadha的基因或蛋白。
[0060]
进一步的，所述的抑制剂包括蛋白质、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体。
[0061]
所述的用于寡核苷酸表达的载体包括病毒载体、真核载体。
[0062]
进一步的，所述的病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体。
[0063]
进一步的，所述的疱疹病毒包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒、eb病毒等。
[0064]
进一步的，所述的真核表达载体可以是任何适当的载体，包括但不限于plcdh
‑
cir表达载体、pcmt
‑
myc表达载体、pcdna3.0表达载体、pcdna6.0表达载体、pegfp表达载体、pef bos表达载体、ptet表达载体、ptre表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，如pbin438、pcambia1301等。
[0065]
所述的药物还包括药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体等。
[0066]
所述的药物可按照药物学领域的常规方法制成各种剂型，包括但不限于显微注射技术、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊剂。
[0067]
所述的药物可以单独施用，或者与其他能够防治肠息肉生长的药物，或是防治肠息肉复发与恶变的药物，或促进肠黏膜损伤修复的药物组合施用；所述的受试者可以是人类或者其他哺乳动物；更具体的，所述的受试者是器官、组织、细胞。
[0068]
所述的药物可以离体施用；所述的离体施用通过如下方式实现：将circhadha的表达载体在体外导入或转染人体自身或异体细胞(或异种细胞)，经体外细胞扩增后，输回人体。
[0069]
所述药物也可以体内施用；所述的体内施用通过如下方式实现：将circhadha的表达载体直接导入体内；所述的表达载体可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸dna或rna。
[0070]
本发明使用的“有效剂量”是指可对人体和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本发明所述的circhadha有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效剂量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述circhadha促进剂的药代动力学参数例数生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病严重程度、患者的体重、患者的免疫状态、给药途径等。
[0071]
本发明中分析环状rna表达谱的方式包括但不限于以下几种：反转录聚合酶链式反应方法(rt
‑
pct)、实时荧光定量聚合酶链式反应方法(real
‑
time pcr)、原位杂交方法(in situ hybridization)、rna
‑
seq测序技术(rna sequencing)和生物芯片。在本发明的具体实施方式中，采用了反转录聚合酶链式反应方法(rt
‑
pct)和实时荧光定量聚合酶链式反应方法(real
‑
time pcr)。
[0072]
本发明中使用的“环状rna”与“circular rna”、“circrna”通用。
[0073]
本发明中使用的“肠息肉早期诊断和/或辅助筛查”包括对肠息肉病变的预判，即判断受试者是否存在患有肠息肉的风险；也包括对肠息肉病变的预判，即判断受试者是否
需要接受结肠镜检查明确诊断的时机判断；也包括对肠息肉复发的诊断，即判断受试者是否存在复发的可能性或者预判受试者已经复发。
[0074]
本发明中使用的“预防和治疗肠息肉复发和/或恶变”包括疾病的好转、延缓、缓解、治愈。
[0075]
本发明使用体外培养的肠上皮细胞来研究circhadha对促进肠黏膜损伤修复、防治肠息肉复发治疗的作用。
[0076]
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0077]
(1)本发明利用实时荧光定量pcr实验证明circhadha，即circrna id:hsa_circ_0053063在肠息肉患者与正常人血浆中，存在表达差异，在肠上皮细胞中稳定表达circhadha，可促进lps诱导发生炎症损伤的肠上皮细胞中自噬相关基因的表达，因此，认为circhadha是一个肠息肉早期筛查和/或辅助诊断的分子标志物与防治复发和/或恶变的药物靶标，可为临床医师制定个性化治疗方案提供理论基础、具有临床应用前景。
[0078]
(2)本发明首次发现circhadha与肠息肉相关，通过检测受试者circhadha的表达，可以辅助判断受试者是否患有肠息肉、接受结肠镜检查的时机或判断受试者是否存在患有肠息肉复发风险，从而指导临床医师给受试者提供筛查或治疗方案。
[0079]
(3)本发明将circhadha作为分子标志物，相比传统的检测手段，外周血环状rna诊断具有无创、经济、便捷等特性，能够实现肠息肉的早期筛查和/或辅助诊断，circhadha具有促进肠上皮损伤修复的作用，能够实现防止肠息肉复发，因此，可用于制备肠息肉早期筛查和/或辅助诊断工具、防止肠息肉复发制剂或促进肠黏膜损伤修复的药物。
附图说明
[0080]
图1是circhadha在肠上皮细胞中通过调节mir
‑
361促进细胞自噬相关基因表达情况图。
[0081]
图2是circhadha抑制lps诱导炎症损伤的肠上皮细胞中细胞炎症因子表达水平图。
具体实施方式
[0082]
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用于与本领域熟练人员所熟悉的用意相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料均可应用于本发明中。
[0083]
实施例1：circhadha血浆筛选及其在肠上皮细胞中调节细胞自噬相关基因表达检测
[0084]
1.样本收集及制备
[0085]
在无症状人群中进行结肠镜检查，收集10例肠息肉患者和10例健康志愿者，各抽
取全血4ml，分别于4℃12,000
×
g离心10分钟，去除可能存在的杂质，收集血浆标本。分别将所收集的血浆标本于
‑
80℃冰箱储存待用。
[0086]
2.rna提取
[0087]
将上述血浆标本于冰上溶解，分别加入750μl的trizol ls reagent试剂和20μl冰醋酸，手动剧烈振荡管体至混匀。匀浆后样品于室温孵育5分钟，使核酸蛋白复合体完全解离，加入0.2ml的氯仿，手动剧烈振荡管体15秒后，室温孵育2～3分钟。4℃下12,000
×
g离心15分钟。离心后留取上层的无色水相，加入500μl异丙醇，混匀以沉淀其中的rna。室温孵育10分钟后，于4℃12,000
×
g离心10分钟，rna沉淀在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。移去上清液，加入1ml的75％(v/v)的乙醇，清洗rna沉淀。振荡后，4℃7,500
×
g离心5分钟。去除乙醇溶液，空气中干燥rna沉淀5～10分钟。加入rnase
‑
free水溶解rna，60℃孵育10分钟。获得的rna溶液保存于
‑
80℃。
[0088]
3.cdna合成
[0089]
按如下体系配置配制退火混合物：rna模板600ng，基因特异引物mix(10um)(购于invitrogen公司)1μl，dntps mix(2.5mm each)1.6μl，加rnase
‑
free水至总体积13.5μl，混合液在65℃水浴5分钟，冰上放置2分钟。随后，按如下体系加入rt反应液：5
×
first
‑
strand buffer 4μl，0.1m二硫苏糖醇(dtt)1μl，rnase inhibitor 0.5μl，superscript iii rt 1μl。混合均匀后，37℃恒温1分钟，50℃温育60分钟，70℃温育15分钟。获得cdna置冰浴待用或
‑
20℃保存。
[0090]
4.real
‑
time pcr
[0091]
按如下体系配置配制real
‑
time pcr反应体系：2
×
arraystar pcr master mix 5μl，10um pcr特异上游引物0.5μl，10um pcr特异下游引物0.5μl(上游引物：5'
‑
aaaatgggactggttgaccaact
‑3’
；下游引物：5
’‑
ctgtgcttcttgtgatagctgtg
‑3’
)，加rnase
‑
free水至总体积为8μl，轻弹管底将溶液混合，短暂离心。将8ul混合液加到384孔pcr板对应的每个孔中，再分别加入对应的cdna 2μl。封口并短暂离心混合，置于realtime pcr仪上，按如下条件进行pcr反应：95℃，10min；95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光)；95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒，40个循环；缓慢加热到99℃(仪器自动进行
‑
ramp rate为0.05℃/秒)。
[0092]
5.circhadha表达载体构建与慢病毒包装
[0093]
以pcr扩增circhadha/hsa_circ_0053063全长362bp序列(circrna id:hsa_circ_0053063，circbase数据库：http://www.circbase.org/)，连接到修改后含有成环元件的慢病毒过表达载体plcdh
‑
cir中(plcdh
‑
cir购于geneseed公司)。将所构建载体转染293t细胞，提取细胞样品总rna，逆转录后进行qpcr检测(上游引物：5
’‑
tggtggaacccctggcatgt
‑3’
；下游引物：5
’‑
caggcaggatccattgatggc
‑3’
)；同时应用测序引物，进行pcr后回收条带，进行测序验证环化位点接头(上游引物：5
’‑
ggacatgatgctgactggtaga
‑3’
；下游引物：5
’‑
atggcaacctcaagtcctcctc
‑3’
)。测序峰图正常，无杂峰或叠带，序列对比吻合，表明circhadha成功插入plcdh
‑
cir中，过表达载体构建成功。使用293t细胞，同时转染(lipo2000，invitrogen)过表达质粒和辅助包装质粒(pspax.2、pmd2.g)(包装质粒购于geneseed公司)。6小时后更换培养基，转染后一天观察细胞，培养箱继续培养1天后，收集所有的上清。离心10分钟，除去脱落的细胞和大的细胞碎片，收集circhadha慢病毒液，浓缩后使用或
‑
80℃保存。
1μl，引物2μl，总rna 1μg，用rnase
‑
free水将总体系配至20μl。
[0111]
按如下条件进行第一链cdna合成反应：25℃10min，42℃15min，85℃5min。
[0112]
4.qpcr实验
[0113]
按如下体系配制qpcr反应体系配制：geneseed qpcr sybr green master mix 10μl，上游引物(10μm)0.5μl，下游引物(10μm)0.5μl，50x rox reference dye 2 0.4μl，模板dna 2μl，用rnase
‑
free水将总体系配至20μl。
[0114]
按如下条件进行qpcr反应程序设置：95℃，5min；95℃，10秒，60℃，34秒(采集信号)，40个循环；95℃，15秒，60℃，60秒，95℃，15秒。
[0115]
qpcr引物序列如下：
[0116]
①
gapdh：
[0117]
上游引物：5'
‑
agaaggctggggctcatttg
‑
3'；
[0118]
下游引物：5'
‑
gcaggaggcattgctgatgat
‑
3'；
[0119]
②
il
‑
1β：
[0120]
上游引物:5'
‑
aggaagatgctggttccctg
‑
3'；
[0121]
下游引物:5'
‑
gcatcgtgcacataagcctc
‑
3'；
[0122]
③
il
‑
17a：
[0123]
上游引物:5'
‑
caagaacttcccccggactg
‑
3'；
[0124]
下游引物:5'
‑
ctctcagggtcctcattgcg
‑
3'。
[0125]
5.结果
[0126]
结果如图2所示，circhadha可抑制lps诱导发生炎症损伤的肠上皮细胞中细胞炎症因子表达水平。
[0127]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0128]
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