本发明总的来说涉及表面上生物污染物的检测的领域，具体地涉及包括以下步骤的方法：提供一块或多块无菌且无核苷酸的黏着纤维材料，将所述一块或多块纤维材料附着到所述表面，从所述表面收集所述一块或多块纤维材料，在溶剂中温育所述一块或多块纤维材料，并对所述溶剂进行生物污染物的存在的分析。本发明进一步涉及无菌载体和包括无菌载体和用于微生物的长期监控的像说明书那样的进一步部件的部件试剂盒。
背景技术
食物传染病原体可导致严重疾病和死亡。进一步地，召回可能污染的物品导致显著的经济损失。一个突出的例子是单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes），一种革兰氏阳性、兼性厌氧和普遍存在的人病原体，其具有黏着到食物加工环境中通常遇到的表面的能力（Silva S等人, J Food Prot. 2008;71(7):1379-1385）。李斯特菌病的爆发继续零星发生，且死亡率高达20%。由于单核细胞增生李斯特氏菌能够在冷藏条件下生长（4℃，Gandhi M等人, Int J Food Microbiol. 2007;113(1):1-15）并且由于临床症状常常只有在延误后才搜集，所以李斯特菌病是尤其严重的诊断。由于这些原因，对于清洗、消毒和监控食物传染病原体的国家和国际标准和规定对现成可食的食物中的单核细胞增生李斯特氏菌执行零容忍（Public Health England. Detection and Enumeration of Bacteria in Swabs and Other Environmental Samples.; 2017；Pueyo a E等人, Guidelines on sampling the food processing area and equipment for the detection of Listeria monocytogenes. 2012:15 www.anses.fr.）。然而，只有具有最低检出限的最可靠的方法将实现所述目标。用于监控病原体的常用测定包括基于生长的常规微生物学方法，且因此执行起来耗时（作者不详; Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs—Horizontal Methods for Sampling Techniques from Surfaces Using Contact Plates and Swabs. International Organization for Standardization: Geneva, 瑞士; 2004）。为了减少处理时间和成本，正在研究更快且更可靠的备择检测方法。
相对于基于生长的方法有希望的改变是定量聚合酶链反应（qPCR），其提供更快的结果。理论上，所述方法的检出限接近靶基因的一个拷贝（Rossmanith P和Wagner M., J Food Prot. 2011;74(9):1404-1412）。实际上，其是在过去几年中已经历了巨大的发展进步的尤其灵敏的工具。尽管qPCR不能区别活细胞和死细胞，但结果反映了（现在或过去）污染的发生，包括活的但不可培养的细胞（VBNC）的存在。
然而，对于准确微生物学数据的先决条件是有效取样。在食物生产设施中，作为标准方法的常规擦拭只能暴露瞬时快照（momentary snapshot）。例如，在执行清洗后重建关于昨天状态的信息是不可能的。此外，当使用润湿的拭子或接触皿（contact-plate）取样方法时，它们将生长培养基与它们一起带入按照推测干净的环境中，从而使得后来的消毒成为必需的。为获得可比较的结果，应参考ISO 18593（作者不详，2004）或FSIS指令在规定的区域内进行擦拭。在复杂的表面，例如门把手、灯开关和其他典型传染物的情况下，这不是非常切实可行。方法本身固有地具有从干燥表面采取细菌的低的能力，并且与平均20%的高度可变的回收率有关（Witte AK等人, LWT - Food Sci Technol. 2018;90, 186-192）。
因此，本领域显然需要改进的取样方法，其允许有效和彻底的取样，特别是用于长期监控，并且优选地仍然具有成本效益。
技术实现要素：
病原体检测在生产区域中是关系重大的。这种污染物可能在环境中使用的设备或其他表面上找到，包括食物加工厂、药物生产设施、医院、兽医办公室和饭馆。关于多种环境中残留污染物质的存在向清洁和检查人员提供反馈的需要是充分确定的。例如，当残留的食物残余物可能导致一些个体中的细菌污染和变态反应时，对污染物监控的需要在食物安全计划中有许多文件证明的作用。有效的清洁还降低病原体污染后来的食物产物的危险。多种设备和方法已被用于污染物测试。类似地，需要确保医院、医生办公室、临床实验室或兽医办公室的表面和设备已被充分清洁，以保护患者和工作人员。虽然是充分确定的，但作为现有技术取样方法的擦拭在得率、标准化、全面处理和长期监控方面呈现了几个缺点。
本发明的目的是提供改进的用于检测微生物的方法，其采用高度灵敏、易于使用、快速且廉价的方法。
本发明解决了所述目的。
根据本发明，提供了一种用于检测表面上的生物污染物的方法，包括以下顺序步骤：
i. 提供包括一块或多块无菌纤维材料和黏着部分的载体，优选黏着层、线或点，
ii. 将所述载体附着至所述表面，
iii. 使所述载体附着至所述表面达合适的时间
iv. 从所述表面收集所述载体，
v. 在溶剂中温育至少所述载体的纤维材料，和
vi. 对溶剂进行生物污染物的存在的分析。
具体地，使用至少2块纤维材料，具体地使用至少3、4、5或6块纤维材料。
根据具体实施方案，纤维材料包括在能够黏着到表面的黏着支持体上。
具体地，表面是非生物表面。
具体地，纤维材料包括在纸层或像塑料层那样的另一种材料层上，其黏着到能够黏着到表面的黏着支持体。
根据本发明的实施方案，黏着载体包括至少两个部分，任选地由穿孔线分开，其中至少一个部分包括一块或多块无菌且优选无核苷酸的黏着纤维材料，并且其中至少一个部分不包括纤维材料。
根据本发明的进一步的实施方案，黏着载体包括由穿孔线分开的至少两个部分并且一块或多块纤维材料位于穿孔线上，并且其中黏着载体任选地包括至少一个非-黏着部分。
根据一个实施方案，可以通过如本文所述的方法检测的生物污染物是细菌，具体地单核细胞增生李斯特氏菌或大肠杆菌（E. coli），真菌，如例如酵母，或病毒及其任何组合。
根据一个实施方案，用于本文所述方法的溶剂具体选自缓冲液，具体选自具有溶剂、表面活性剂、去污剂的缓冲液，不具有溶剂、表面活性剂、去污剂的缓冲液；Tris/EDTA；离液溶剂，有机溶剂，离子液体。
根据本发明的实施方案，对溶剂进行选自蛋白质、肽和核酸分子，具体地DNA或RNA的生物污染物的部分的分析。
根据具体实施方案，通过使用PCR、qPCR、下一代测序（NGS）、酶联免疫吸附测定（ELISA）或任何其他免疫测定来应用对生物污染物或生物污染物的部分的分析。
具体地，生物污染物是单核细胞增生李斯特氏菌，且对溶剂进行单核细胞增生李斯特氏菌基因prfA的存在的分析。
根据备择的实施方案，生物污染物是大肠杆菌并且对溶剂进行大肠杆菌基因sfmD的存在的分析。
具体地，根据本文所述的方法，将纤维材料附着至表面达至少1小时、6小时、8小时或12小时，优选至少24小时。
在备择的实施方案中，将纤维材料附着至表面达至少一周，优选至少2周。总的说来，载体保持附着至表面的时间取决于应执行的监控的类型。短期监控可能仅包括一次生产轮班（production shift）或两次清洁之间的时间，例如1-12小时。中期监控可能包括4-48小时，且长期监控可能包括48小时一直到2-4周。
根据具体的实施方案，载体使用物理或化学灭菌方法灭菌，具体选自紫外辐射、γ辐射、电子束辐射、X射线辐射、用亚原子粒子辐射、等离子体、干热、高压灭菌、臭氧、过氧化氢、过乙酸、二氧化氮、环氧乙烷、次氯酸盐和DNA酶。
具体地，纤维材料为无机或有机纤维材料，具体选自活性炭、微孔陶瓷、多孔金属、氧化铝、玻璃纤维、纸、纤维素、纤维素酯、纤维素醚、乙酸纤维素、黏胶、玻璃纸、藻酸盐、尼龙膜、聚酯（PETE）、聚丙烯、聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏1,1-二氟乙烯、聚偏氟乙烯（PVDF）、聚碳酸酯（PCTE）、聚醚醚酮（PEEK）、聚丙烯腈（PAN）、聚芳酰胺（KEVLAR）和聚醚砜（PES）。
具体地，黏着载体选自胶带，具体地选自聚乙烯膜、聚丙烯膜、聚酯膜、聚氯乙烯（PVC）、纤维素膜、塑料石蜡膜和金属箔。
在具体实施方案中，一块或多块纤维材料包括至少10 mm2，优选约50-300 mm2，更优选约50-100 mm2的表面面积。
具体地，一块或多块纤维材料、任选的纸层或另一种材料和/或黏着支持体补充有杀菌剂或抑菌组合物。
在本发明的具体实施方案中，方法用于长期监控生物污染物，具体地长期监控食物工业或医疗或药物区域中的生物污染物。
本文进一步提供了部件试剂盒，其包括至少以下部件：
i. 至少一个包括无菌载体的贴纸（sticker），所述载体包括第一和第二表面，其中所述第一表面是黏着的并且所述第二表面包括至少一块无菌且无核苷酸的黏着纤维材料，且其中所述贴纸由顶部和底部无菌保护层覆盖，和
ii. 包括用于根据本文所述方法检测生物污染物的规程的说明书散页。
附图说明
图1：在宽动态范围内来自人为污染的贴纸的单核细胞增生李斯特氏菌和大肠杆菌的定量。提取来自用四种10-倍对数稀度（对于大肠杆菌从80 cfu开始，且对于单核细胞增生李斯特氏菌从10 cfu开始）人为污染的贴纸的DNA并使用qPCR进行定量（y轴）。同时提取和分析对照 DNA（输入，应用于贴纸上）作为参考（x轴）。符号和误差棒分别表示标准化均数差（standardized mean difference）和标准差（n=3个独立实验，每个实验重复3次）。为了清楚起见，仅显示正y-误差棒（负y-误差棒值与正值相同）。
图2. 人为污染的贴纸方案（setup）的示意表示。通过添加所期望的浓度的稀释的细菌悬浮液，人为污染UVC-处理的贴纸。在各自的温育时间后，提取来自贴纸和对照的DNA，并使用qPCR进行分析。并行地，将细胞铺平板在TSA平板上作为对照。
图3. 清洗和消毒后的回收。表面或应用于表面的贴纸被103-104 cfu的单核细胞增生李斯特氏菌ΔprfA人为污染。干燥后，洗涤表面，接着取样，并提取DNA，且用qPCR进行分析。条表示一式两份进行的五个独立实验的具有标准误的回收的总平均值（结果（qPCR）/输入（qPCR））。
图4. 随着时间的过去贴纸上合成IAC的累积。从应用于门把手的贴纸中提取的DNA的qPCR（IAC测定）显示了分布在所述房间中的贴纸上合成DNA随着时间的过去的累积。结果代表三个独立实验。
图5. 随着时间的过去的回收的稳定性。贴纸用单核细胞增生李斯特氏菌ΔprfA人为污染，且在0、1、3、7和14天后提取DNA并用qPCR进行分析。条和误差棒代表四个（第0、3天）或三个（1、7、14天）独立实验的回收的总平均值（结果（qPCR）/输入（qPCR））和标准误，包括一式两份的两个不同的细菌浓度。
图6. 贴纸的汇集。a. 汇集方法的示意表示显示了不同的样品：一单个污染的贴纸、单个具有1/6污染水平的贴纸、含有六个污染的贴纸的集合体和含有一个污染的贴纸和五个空贴纸的集合体。b. 结果表明，汇集六个贴纸不导致信息的显著丧失。BCE（细菌细胞当量（bacterial cell equivalents））使用qPCR测定。条表示四个独立实验的具有标准差的标准化均数差。
图7. 部件试剂盒的示意表示：
具有位置指示符（1）和非黏着部分（2A）（2B）的上保护层（图7A）；自黏着纤维材料（3）（图7B）；具有非黏着部分（5A）（5B）和穿孔线（6）的黏着载体（图7C）；具有层分离导引物（7）的下保护层（图7D）。
具体实施方式
除非另外指出或定义，否则本文中使用的所有术语均具有其在本领域中的通常含义，其对技术人员来说将是清楚的。例如参考标准手册，例如Sambrook等人, \"Molecular Cloning: A Laboratory Manual\" (第2版), 第1-3卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)；Lewin, \"Genes IV\", Oxford University Press, New York, (1990)，和Janeway等人, \"Immunobiology\" (第5版, 或更新版本, Garland Science, New York, 2001)。
如本文所用的术语“包含”、“含有”、“具有”和“包括”可以同义使用并且应被理解为开放定义，从而允许进一步的成员或部分或要素。“组成”被认为是封闭的定义，没有组成定义特征的进一步的要素。因此，“包括”更宽，且含有“组成”定义。
如本文所用的术语“约”指相同的值或相差给定值的 /-5％的值。
本文所述的方法指生物污染物的检测，包括但不限于食物加工厂、药物制备设施、医院、医疗办公室、兽医办公室和饭馆。
本文所提及的生物污染物可以是任何可能伤害动物和人并危及食物安全和适合性的活生物或产物，包括微生物如细菌、病毒、像酵母和霉菌那样的真菌以及寄生物。
生物污染物的例子可以是，但不限于，贾第鞭毛虫属（Giardia），例如蓝氏贾第鞭毛虫（G. lamblia）、小肠贾第鞭毛虫（G. duodenalis）和肠贾第鞭毛虫（G. intestinalis）；隐孢子虫属（Cryptosporidium），例如微小隐孢子虫（C. parvum）、C. Jells、小鼠隐孢子虫（C. muris）、火鸡隐孢子虫（C. meleagridis）、猪隐孢子虫（C. suis）、犬隐孢子虫（C. canis）和人隐孢子虫（C. hominis）；沙门氏菌属（Salmonella），志贺氏菌属（Shigella），弯曲杆菌属（Campylobacter），棒杆菌属（Corynebacterium），假丝酵母属（Candida），大肠杆菌，耶尔森氏菌属（Yersinia），气单胞菌属（Aeromonas），微孢子虫属（Microsporidia）或其他小致病生物。具体在食物工业中，沙门氏菌属、葡萄球菌属（Staphylococcus）和李斯特氏菌属（Listeria）是高度相关的污染物。生物污染物也可以是食物传染病毒，例如，但不限于甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、诺如病毒（norovirus）、人轮状病毒、尼帕病毒（Nipah virus）、高致病性禽流感病毒、引起SARS的冠状病毒、弯曲杆菌属物种和链球菌属（Streptococcus）。根据本公开内容的一方面，可以用本文描述的方法捕获和检测一种或多种物种的存在。特别地，所述方法非常适合于检测一种或两种病原体，但也可以靶向和分析更多或不同类型的生物。
如本文所详细说明的，包含黏着部分和纤维材料的无菌且优选无核苷酸的载体用于检测方法。
术语“纤维材料”指无机或有机纤维材料，其包含合适的孔以固定、截留、捕获或黏着生物污染物，所述生物污染物在材料与合适的溶剂接触时可被释放。材料可以是，但不限于，无机材料如活性炭、炭、微孔陶瓷、多孔金属、氧化铝、玻璃纤维，或有机材料如纸、纤维素、纤维素酯、纤维素醚、乙酸纤维素、黏胶、玻璃纸、藻酸盐、尼龙膜、聚酯（PETE）、聚丙烯、聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏1,1-二氟乙烯、聚偏氟乙烯（PVDF）、聚碳酸酯（PCTE）、聚醚醚酮（PEEK）、聚丙烯腈（PAN）、聚芳酰胺（KEVLAR®）和聚醚砜（PES）。在具体实施方案中，纤维材料是纸。
优选地，使用的材料应该是抑菌的并且对湿气或磨损广泛不敏感。其还可以结合细胞膜的黏着机制。其应既不抑制DNA-提取又不抑制qPCR的性能。因此，其优选不含有任何可能妨碍或影响污染物分析的核酸，或者其根本不含有任何核酸。
可通过本领域已知的任何方法对纤维材料进行灭菌并去除核酸，并对于相应的纤维材料进行调整。这种方法可以是，但不限于，物理灭菌，例如辐射（UV-C、γ、电子束、X射线、亚原子粒子），等离子体（电离气体），干热，高压灭菌（蒸气）；化学灭菌方法，例如用臭氧、过氧化氢、过乙酸、二氧化氮、环氧乙烷、次氯酸盐和DNA酶处理纤维材料。
纤维材料可以附着至任何假定被污染或将处于污染危险之中的表面。术语“附着”指将纤维材料以使所述材料可以从所述表面取出用于进一步分析的方式粘附、附着或固定到表面。一般，纤维材料附着至表面，从而使得纤维材料面向房间内部，向离开表面的方向。纤维材料块可以被附着至表面达任何被认为适合于检测生物污染物的时间段。时间段可以持续1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多小时，优选至少24小时。其中纤维材料附着至表面的时间段也可以更长，例如1、2、3、4、5、6或更多周。由于材料的纤维组成，生物污染物被固定，并且即使表面被反复清洁，至少污染物的残余物或痕量也被保存用于分析。
如本文所用的，术语“非生物表面”指非活表面，例如惰性物体或结构的表面。
在具体实施方案中，纤维载体可以补充有杀菌剂或抑菌组合物。制菌剂或抑菌剂是生物或化学试剂，其终止细菌繁殖，尽管不必定另外杀死它们。取决于它们的应用，可以区分抑菌抗生素、消毒剂、防腐剂和保存剂。杀细菌剂或杀菌剂是杀死细菌的物质。杀细菌剂可以是消毒剂、防腐剂或抗生素。
根据本发明，纤维材料可以直接附着至黏着部分。因此，材料在其底侧包括能够黏着至表面的黏着材料或支持体。具体地，纤维材料可以是纸，其在可以附着且从表面去除的一侧或在一侧的一部分上包括作为黏着部分的黏着胶。具体地，纸片可以包括因报事贴（post-it®）贴纸而众所周知的低粘性压敏粘合剂。黏着部分也可以是例如具有粘合剂的纸、金属或塑料的片或层。粘合剂可以覆盖所述层的一整侧，或者其可以仅应用到所述层的一部分，例如以线或一个或多个点的形式。
根据本发明的黏着部分也是在其为黏性的意义上本身不是黏着性的但通常可附着到表面的部分。例如，它可以是可以以其他方式固定至表面的固定装置或支撑物。在这种情况下，载体例如包括纤维材料和例如金属或塑料支撑物，其可以永久附着至表面，例如，用粘合剂或用其他固定装置，如钉子、螺钉等。在其中纤维材料应附着至表面的时间段之后，可以将其从支撑物中取出并可以在支撑物保持附着至表面时进一步分析，并且可以随时插入新的纤维材料。所述实施方案确保纤维材料在表面的位置永久相同，甚至在几轮分析期间。此外，在一个实施方案中，纤维材料仅需要在温育时间段之后从固定至表面的支撑物中取出并且可以在没有黏着部分的情况下进一步分析，所述黏着部分否则可能干扰进一步的分析。
纤维材料块的尺寸不是最重要的，且可以适应于要进行污染测试的表面的尺寸。相应的表面越小，纤维材料块被限定的越小。纤维材料可具有至少约5 mm2，约10 mm2，具体地约50-300 mm2，更具体地约50-100 mm2的表面面积。
纤维材料块可以是任何形状，例如但不限于矩形、正方形、三角形、圆形或椭圆形。
根据备择方案，纤维材料可以固定到黏着部分。所述黏着部分可以是任何材料，例如但不限于众所周知的胶带、压敏胶带、聚乙烯膜、聚丙烯膜、聚酯膜、聚氯乙烯（PVC）、纤维素膜、塑料石蜡膜或金属箔。
根据备择的方法，载体包括具有两个或更多个部分的黏着部分，任选地由穿孔线分开，其中一个或多个部分包括一块或多块无菌且无核苷酸的黏着纤维材料，并且其中至少一个部分不包括纤维材料。
根据进一步备择的方法，载体包括由穿孔线分开的两个或更多个部分并且一块或多块纤维材料放置在穿孔线上，并且其中载体任选地包括至少一个非-黏着部分。
整个载体或纤维材料的穿孔可便于收集纤维材料用于进一步分析并降低污染危险。因此，可以更方便地收集材料并且可以避免材料取出过程中的污染。如果纤维材料例如被分成两个或更多个区段，例如通过穿孔线，并且只有一个区段直接与黏着部分接触，取决于区段的设计和位置，可以取出不是与黏着部分直接接触的区段的单个区段，并进一步在其他区段保持在原位时进行分析。例如，可以将区段定位成一排，其中在所述排一端的区段通过黏着剂部分附着至表面。其他区段不直接附着至表面。然后可以从另一端的一个开始从所述排中取出单个区段，而剩余部分通过与黏着部分连接的区段保持附着至墙壁。有了这个，可以通过在一定时间后在不需要完全替换载体的情况下取出一个或多个区段来执行几个污染测定。
具体地，黏着载体可以包括含有纤维材料的2、3、4、5、6、7、8、9、10个区段，每个区段由穿孔线分开以允许取出一个区段，从而允许其他区段被附着至表面用于进一步收集污染物。
在优选实施方案中，载体还包括编码。编码可以是任何种类的ID、标签或代码，其使得可追溯性（traceability）成为可能或提供关于载体的任何类型的信息，如其组成、批号、制造商、位置、应用时间等。编码可以是条形码、RFID代码、数字代码、文字、颜色代码等形式。其还可以是载体上的空闲位置（free spot），用户可以向其应用额外的信息，例如以文字或贴纸。其也可以是为用户提供关于载体已经暴露的时间的信息的标签，例如，通过随着时间的过去显示颜色变化或褪色。
优选地，编码用于提供可追溯性。编码可以直接应用到纤维材料上，或者其可以附着至纤维材料和/或黏着部分。
载体还可包括覆盖物。覆盖物可用于覆盖纤维材料。这可能例如在运输期间是有利的、对于长期取样或对于研究是有利的。优选地，覆盖物覆盖整个纤维材料。它可能是塑料层或塑料片，其永久固定到例如载体的一侧且可以放在纤维材料上用于覆盖，并且任选地固定到载体的一个或多个其他侧用于稳定覆盖。它也可以是不永久固定至载体但可以如果需要就附着至载体的覆盖物片，例如通过将其附着在顶部侧和底部侧以确保足够的保护。
载体也可以是试剂盒的一部分，所述试剂盒进一步包括说明书散页，其包括用于如本文所述检测生物污染物的规程，和/或用于进行检测的试剂，
在收集纤维材料块后，将所述材料在溶剂中温育用于分析污染物。可以使用适合从纤维材料分离污染物或其部分或片段的任何溶剂。所述溶剂可以是，但不限于，缓冲液，例如含有溶剂、表面活性剂、去污剂的缓冲液，或不具有溶剂、表面活性剂、去污剂的缓冲液，Tris/EDTA；离液溶剂，有机溶剂，离子液体。
术语“温育”指使纤维材料与溶剂接触以从材料分离污染物的时间。温育时间的范围可以为1、2、3、4、5或更多分钟，但如果样品被贮存用于进一步分析，则可以为几天或几周。
然后对溶剂进行微生物或其部分的分析，例如蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、小分子、细胞有机和无机化合物和核酸分子，具体地DNA或RNA及其任何组合。还可以进一步处理微生物及其部分用于进行分析。
污染物的存在可以通过聚合酶链反应（PCR）来确定。PCR方法是本领域众所周知的并且被广泛使用。它们包括定量PCR、半定量PCR、多重PCR、数字PCR 或其任何组合。在特别优选的实施方案中，使用定量PCR（q-PCR）。Schmittgen等人, 2008, Methods. 1月; 44(1): 31–38给出了实时PCR定量方法的概述。
例如，一旦收集了样品，就从样品中分离和提取DNA或RNA。可将分离的DNA分成小部分并放置于反应容器中，如例如具有适当PCR试剂的PCR管。每个反应容器还可接收一对引物、一对寡核苷酸探针、内部对照（IC）构建体和用于内部对照和靶的一对探针。引物和探针可能对在检查中的单个物种具有特异性。PCR试剂、引物、探针和IC可以以混合物或现成可用的形式提供，例如，以溶液或作为冷冻干燥的混合物。内部对照也可以通过物种特异性引物进行扩增，但它是用自己独特的探针检测的。由于对于多个物种的引物和探针对的可用性，可以对来自单个样品的分离物进行多个感兴趣的物种的存在的测试。
根据备择的方法，可以进行下一代测序（NGS）、酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他免疫测定。
本方法为区域的长期监控提供了高度有效且灵敏的工具。因此，可以通过将如本文所述的纤维材料块应用于选择的表面并执行如本文所述的方法来重复或连续地监控设施内的区域。
进一步提供了现成可用的载体，其包括至少一个具有无菌、优选无核苷酸的纤维材料的表面。在一个实施方案中，载体被像贴纸那样制备并且包括部分或完全黏着的第二相对表面。为了在使用前进行贮存和处理，所述载体由顶部和底部无菌保护层覆盖和/或在像袋那样的无菌包装内。图7给出了示例性示意图。这种贴纸允许在没有由于处理而污染的情况下应用纤维材料。另外，如果作为现成可用的试剂盒提供，则包括说明书散页，其包括用于如本文所述检测生物污染物的规程。试剂盒还可包括用于进行检测的试剂。根据具体实例，这种现成可用的贴纸包括具有位置指示符（1）和非黏着部分（2A）（2B）的上保护层，自黏着纤维材料（3），具有非黏着部分（5A）（5B）和穿孔线（6）的黏着载体，和具有层分离导引线（7）的下保护层。在应用贴纸之前去除下保护层，以允许将黏着载体粘附到取样表面。具体地，在去除上保护层时开始污染监控。具体地，可以例如用镊子卡住非黏着部分（5A）和（5B），用于从取样表面取出贴纸。具体地，穿孔线（6）允许黏着载体的折缝用于更容易取出纤维材料（3）。
以下项目是本文描述的特定实施方案。
1. 一种用于检测表面上的生物污染物的方法，包括以下顺序步骤：
i. 提供具有一块或多块无菌且无核苷酸的黏着纤维材料和黏着部分的载体，
ii. 将所述载体附着至所述表面，
iii. 从所述表面收集至少一块所述纤维材料。载体可以作为整体或部分收集，或者可以收集纤维材料的整体或部分。
iv. 在溶剂中温育所述至少一块纤维材料，和
v. 对所述溶剂进行生物污染物的存在的分析。
2. 项目1的方法，其中使用至少2块纤维材料，具体地使用至少3、4、5或6块纤维材料。
3. 项目1或2的方法，其中所述纤维材料包括在能够黏着到表面的黏着支持体上。
4. 项目1或2的方法，其中所述纤维材料包括在纸层上，其黏着到能够黏着到表面的黏着支持体。
5. 项目1-4任一项的方法，其中所述载体包括至少两个部分，任选地由穿孔线分开，其中至少一个部分包括一块或多块无菌且无核苷酸的黏着纤维材料，并且其中至少一个部分不包括纤维材料。
6. 项目1-4任一项的方法，其中所述载体包括由穿孔线分开的至少两个部分并且一块或多块纤维材料位于穿孔线上，并且其中所述载体任选地包括至少一个非-黏着部分。
7. 项目1-6任一项的方法，其中所述生物污染物是细菌，具体地单核细胞增生李斯特氏菌或大肠杆菌，酵母，或病毒。
8. 项目1-7任一项的方法，其中所述溶剂选自缓冲液，具体选自具有溶剂、表面活性剂、去污剂的缓冲液，不具有溶剂、表面活性剂、去污剂的缓冲液，Tris/EDTA；离液溶剂，有机溶剂，离子液体。
9. 项目1-8任一项的方法，其中对所述溶剂进行选自蛋白质、肽和核酸分子，具体地DNA或RNA的生物污染物的部分的分析。
10. 项目1-9任一项的方法，其中使用PCR、qPCR、下一代测序（NGS）、酶联免疫吸附测定（ELISA）或其他免疫测定来对所述溶剂进行生物污染物或生物污染物的部分的分析。
11. 项目9的方法，其中所述生物污染物是单核细胞增生李斯特氏菌，且对溶剂进行单核细胞增生李斯特氏菌基因prfA的存在的分析。
12. 项目7的方法，其中所述生物污染物是大肠杆菌并且对溶剂进行大肠杆菌基因sfmD的存在的分析。
13. 项目1-12任一项的方法，其中将所述纤维材料附着至表面达至少1小时、6小时、8小时或12小时，优选至少24小时。
14. 项目1-12任一项的方法，其中将所述纤维材料附着至表面达至少一周，优选至少2周。
15. 项目1-14任一项的方法，其中所述纤维材料、所述黏着载体和所述纸层使用物理或化学灭菌方法灭菌，具体选自紫外辐射、γ辐射、电子束辐射、X射线辐射、用亚原子粒子辐射、等离子体、干热、高压灭菌、臭氧、过氧化氢、过乙酸、二氧化氮、环氧乙烷、次氯酸盐和DNA酶。
16. 项目1-15任一项的方法，其中所述纤维材料为无机或有机纤维材料，具体选自活性炭、微孔陶瓷、多孔金属、氧化铝、玻璃纤维、纸、纤维素、纤维素酯、纤维素醚、乙酸纤维素、黏胶、玻璃纸、藻酸盐、尼龙膜、聚酯（PETE）、聚丙烯、聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏1,1-二氟乙烯、聚偏氟乙烯（PVDF）、聚碳酸酯（PCTE）、聚醚醚酮（PEEK）、聚丙烯腈（PAN）、聚芳酰胺（KEVLAR）和聚醚砜（PES）。
17. 项目1-16任一项的方法，其中所述黏着支持体选自胶带，具体地选自聚乙烯膜、聚丙烯膜、聚酯膜、聚氯乙烯（PVC）、纤维素膜、塑料石蜡膜和金属箔。
18. 项目1-17任一项的方法，其中所述一块或多块纤维材料包括至少10 mm2，优选50-300 mm2，更优选50-100 mm2的表面面积。
19. 项目1-18任一项的方法，其中所述一块或多块纤维材料、所述纸层和/或所述黏着载体补充有抑菌或杀菌剂组合物。
20. 项目1-19任一项的方法用于长期监控生物污染物的用途。
21. 项目1-20任一项的方法用于监控，具体地长期监控食物工业或医疗或药物区域中的生物污染物的用途。
22. 部件试剂盒，其包括至少以下部件：
i. 至少一个包括无菌载体的载体，优选以贴纸的形式，所述载体包括第一和第二表面，其中所述第一表面是黏着的并且所述第二表面包括至少一块无菌且无核苷酸的黏着纤维材料，且其中所述贴纸由顶部和底部无菌保护层覆盖，和
ii. 包括用于根据项目1-21任一项检测生物污染物的规程的说明书散页和/或用于进行检测的试剂。
本文描述的实施例是对本发明的举例说明而不意图是对其进行限制。已经根据本发明描述了本发明的不同实施方案。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本文描述和举例说明的技术进行许多修改和变化。因此，应当理解，这些实施例仅是举例说明性的，且不限制本发明的范围。
实施例
定期取样对于在敏感环境中正确监控微生物是必须遵循的。所述程序通常使用拭子进行。除了相当小的回收之外，所获得的检测结果仅代表瞬时快照，且建议取样后接着进行消毒，这使得取样过程是费力的。因此，在所述研究中，检查了适合于捕获细菌的备择表面。作为贴纸附着至感兴趣的表面，其可以在收集污染物时长时间段保持在原位。以这种方式研究了包括普通纸表面的文本标记（text marking）贴纸作为备择取样系统的适当性。
实施例1：随着时间的过去来自贴纸的DNA回收是足够且恒定的
最初使用分子和微生物方法对文本标记贴纸作为拭子的取样替换物的适合性进行了定量和定性评估。单核细胞增生李斯特氏菌（ΔprfA）和大肠杆菌以在四个对数单位范围内的浓度应用于贴纸。24小时后，使用平板计数方法对贴纸进行定量分析，或者用在用于微生物学分析的TSB或half Fraser培养基中的富集进行定性分析（表 1）。富集方法导致于任何浓度随机检测大肠杆菌，而从100 cfu检测单核细胞增生李斯特氏菌。使用平板计数方法获得了差的结果，其中在任何测试的浓度都几乎没有实现生长。比较起来，qPCR为所有浓度的两种细菌提供了定量结果，尽管单核细胞增生李斯特氏菌的回收低于大肠杆菌（图1）。
图1显示了在宽动态范围内来自人为污染的贴纸的单核细胞增生李斯特氏菌和大肠杆菌的定量。提取来自用四种10-倍对数稀度（对于大肠杆菌从80 cfu开始，且对于单核细胞增生李斯特氏菌从10 cfu开始）人为污染的贴纸的DNA并使用qPCR进行定量（y轴）。同时提取和分析对照 DNA（输入，应用于贴纸上）作为参考（x轴）。符号和误差棒分别表示标准化均数差和标准差（n=3个独立实验，每个实验重复3次）。为了清楚起见，仅显示正y-误差棒（负y-误差棒值与正值相同）。
因此，进一步的实验将集中于qPCR分析作为精选的检测方法。
表1. 在贴纸上干燥后单核细胞增生李斯特氏菌ΔprfA和大肠杆菌的生长。
一式三份进行的三个独立实验的在TSB（单核细胞增生李斯特氏菌、大肠杆菌）或half Fraser（单核细胞增生李斯特氏菌）中温育贴纸后阳性发现（生长）的数目。
为了确定随着时间的过去的稳定性，包括六个无菌贴纸的五个组被人为地用不同计数的单核细胞增生李斯特氏菌（ΔprfA）污染。两个贴纸各自分别用5 cfu、50 cfu或500 cfu污染，并被分析了最多到14天。为了比较起见，将相同的接种物在TSA-平板上铺平板或在稀释后直接提取DNA。图2显示了人为污染的贴纸方案的示意表示。通过添加所期望的浓度的稀释的细菌悬浮液，人为污染UV-处理的贴纸。在各自的温育时间后，提取来自贴纸和对照的DNA，并使用qPCR进行分析。并行地，将细胞铺平板在TSA平板上作为对照。
来自贴纸的回收相当可变，为约30%，但在14天后没有明显降低，从而表明在延长的时间段内取样的可能性。
在图5中，显示了随着时间的过去回收的稳定性。贴纸用单核细胞增生李斯特氏菌ΔprfA人为污染，且在0、1、3、7和14天后提取DNA并用qPCR进行分析。条和误差棒代表四个（第0、3天）或三个（1、7、14天）独立实验的回收的总平均值（结果（qPCR）/输入（qPCR））和标准误，包括一式两份的两个不同的细菌浓度。
结果与以前研究中从来自海绵棒（sponge-sticks）的回收获得的结果相似（Witte AK 等人，2018 年）。
实施例2：清洗和消毒对利用贴纸的细菌检测具有较小影响
预计食物加工厂中的表面将被定期清洗。因此，为了测试纸贴纸与常规取样相比是否传递优点或缺点，将人为污染的（单核细胞增生李斯特氏菌ΔprfA）贴纸用水、肥皂水和消毒剂处理，以模拟常规清洗实践。作为对照，瓷砖被人为污染，以与贴纸相同的方式处理，并使用海绵棒拭子取样。图3中总结的结果揭示，在清洗和/或消毒后，使用贴纸可以检测明显更多的细菌。
图 3 显示了清洗和消毒后的回收。表面或应用于表面的贴纸被103-104 cfu的单核细胞增生李斯特氏菌ΔprfA人为污染。干燥后，洗涤表面，接着取样，并提取DNA，且用qPCR进行分析。条表示一式两份进行的五个独立实验的具有标准误的回收的总平均值（结果（qPCR）/输入（qPCR））。
实施例3：最多到6个贴纸的汇集
一个贴纸的表面仅有50 mm2，其比对于拭子通常建议的小得多。为了最优化取样密度与工作（劳动力和材料）的关系曲线，决定每个DNA提取样品处理不止一个贴纸，而不是使用更大的贴纸。虽然要一次处理的贴纸数目受到NucleoSpin®试剂盒第一步中使用的预裂解（pre-lysis）缓冲液体积的限制，但发现每个样品6个贴纸被证明是当保持原始规程时的良好折衷方案。为了测试汇集六个贴纸是否会由于通过空贴纸的可能稀释或增加的量的不溶性材料而导致信息丧失，针对参考样品测试了两个集合体（图 6a）。
图 6 显示了贴纸的汇集。a. 汇集方法的示意表示显示了不同的样品：一单个污染的贴纸、单个具有1/6污染水平的贴纸、含有六个污染的贴纸的集合体和含有一个污染的贴纸和五个空贴纸的集合体。b. 结果表明，汇集六个贴纸不导致信息的显著丧失。BCE（细菌细胞当量）使用qPCR测定。条表示四个独立实验的具有标准差的标准化均数差。
两个集合体含有相同的细菌计数。携带与两个集合体相同或1/6的污染水平的单个贴纸充当对照。如图6b中所显示的，汇集看来似乎是足够的，因此不取决于（空的或污染的）贴纸的数目获得了类似的结果。尽管变异相对高，但看来似乎只有样品中DNA的总量是相关的。因此，这种汇集方法可能有助于减少样品数目。统计学上，应用的贴纸的较高数目增加检测到较少的污染物的机会。
实施例4：用于使用贴纸成功检测细菌污染的现场（on-site）取样和概念验证（proof of concept）
在利用人为污染实验研究新方法的适合性后，在概念验证实验中使用贴纸以确定用所述系统是否可以捕获细菌。为此，在经历频繁的手接触的几个位置如卫生间的门把手或灯开关应用贴纸达一至七天。在第一个方案中，对于检测单核细胞增生李斯特氏菌，并行地进行使用海绵棒取样。在第二个方案中，另外对大肠杆菌进行了qPCR，以补充阳性结果的出现并监控另一个物种。在所述方案中省略了擦拭，但包括了三个时间段。因为证明了prfA测定甚至可以检测和定量少至一单个分子（Rossmanith P和Wagner M., J Food Prot.2011;74(9):1404-1412），所以qPCR中的每个阳性信号都被评定为阳性结果。
表2和表3中总结的结果表明，贴纸从几个位置重复检测到两种细菌物种，从而提示作为合适的现场取样/检测系统的适合性。进一步地，在第一个方案中，与常规拭子系统相比，贴纸检测到类似甚至更高的单核细胞增生李斯特氏菌的出现（表 2）。最后，对应用了1至7天的时间段的贴纸的分析表明它们基本上与污染日期无关地用于取样和检测的适合性（表 3）。
表2. 使用贴纸和拭子的现场单核细胞增生李斯特氏菌检测
七个独立实验的qPCR中单核细胞增生李斯特氏菌阳性结果的数目（方案1）。
表3. 利用贴纸的现场单核细胞增生李斯特氏菌和大肠杆菌检测
测试3次的五个门把手上qPCR中阳性发现的数目，包括三个时间段（方案2）。
*一个贴纸丢失
实施例5：频繁使用的门把手上游离 DNA的累积
除了在我们的概念验证研究中监控微生物外，prfA IAC测定也被并行地检查，这是因为不止10年以前冻干的内部扩增对照偶然地分布在一个房间内。令人吃惊的是，所述100碱基对的合成寡核苷酸仍然可以在所述房间的门把手被检测，且甚至随着时间的过去在贴纸上累积，从而证明了DNA的稳定性和新贴纸系统有效检测它的能力。图4显示了随着时间的过去贴纸上合成IAC的累积。从应用于门把手的贴纸中提取的DNA的qPCR（IAC测定）显示了分布在所述房间中的贴纸上合成DNA随着时间的过去的累积。结果代表三个独立实验。
讨论
尽管在来自人为污染的贴纸的回收中有变异，但贴纸提供了与以前使用拭子获得的结果相似的结果。贴纸上DNA的保存也表明所述方法随着时间的过去是非常可靠的。提出的检测是基于qPCR的。没有遇到损害DNA-提取或qPCR的抑制因子。然而，由于阳性发现是DNA的存在的陈述，所以这并非不可避免地起源于活细胞。因此，所述方法因此检测活的、死的和活的但不可培养的细胞（VBNC）。虽然在过去检测非生长细胞经常被讨论为是缺点，但现在不断增加的VBNCs的利害关系和了解强调非生长细胞也是潜在的威胁（Silva S等人，2008）。进一步地，由于大多数化学消毒剂单独不能去除DNA，所以检测非生长细胞有利地证明了拙劣地清洗的区域。
如在概念验证实验中所示的，合成DNA被有效捕获。因此，使用过的贴纸也可以用于检测也可以产生严重的问题的“飞行”DNA。这种特性的污染在企业中可能比预期的更经常地发生，且也已用肽得到证明。尽管用人为DNA进行污染不大可能在很少使用其的食物工业中发生，但仍存在被PCR产物污染的危险。必须严格遵循实验室实践的指南，以将危险减至最低，例如，在处理前既不打开又不高压灭菌PCR-管。所有基本控制都必须包括在监控方案中。
由于食物加工环境中必须履行表面的定期清洗和消毒，所以测试了洗涤后贴纸的适用性，并与来自表面的擦拭结果进行了比较。在清洗之前，拭子显示类似的结果，但来自贴纸的得率倾向于更高。这可能是具有良好的用于附着细菌的亲和力的贴纸本身的黏附特性所继发的。然而，必须承认，尽管有优点，但贴纸本身可能有散布污染物的潜力，甚至在研究已显示来自无孔表面的更高微生物转移率（作者不详. Geneva, 瑞士; 2004）并且没有确证作为污染来源的来自纸的爆发时。仅在高浓度观察到吸引到贴纸的单核细胞增生李斯特氏菌和大肠杆菌的可再现再生长（表1）。然而，为了将来回避所述可能的危险，补充有抑菌组分的贴纸可能是有益的。尽管提供了有希望的数据，但进一步的现场测试是完成数据集所必需的。最初的现场实验的确显示了贴纸化合物稳定性的不一致。在一些情况下，贴纸变得折角并自发地从胶带分离。通过在与后来应用它们的门把手具有相似几何形状的表面上预先制备该化合物获得了微小的改进。然而，由于许多贴纸在没有任何不一致的情况下保持牢固，所以所述问题并非不可克服。
尽管贴纸的表面面积很小，仅有0.5 cm2，但与拭子相比，从它们获得了甚至更多的阳性样品。比较起来的擦拭的区域至少为十倍大，从而证明了贴纸系统的能力。
结论
新开发的对表面取样用于微生物污染且适合于分子检测方法的贴纸系统已显示了比起海绵棒擦拭系统来的几个优点，尽管在回收中有可比较的丧失和变异。贴纸的主要优点在于处理：它们易于分发和收集，并且进一步的处理步骤例如离心不是后来的DNA-提取所必需的。结果还表明，清洗和消毒仅稍微损害从贴纸获得的结果，从而提示延长的间隔取样应该是可能的。此外，不必须当使用海绵棒拭子时情况应该的那样在使用后对监控的表面进行消毒。所提出的检测系统看来似乎是用于有效取样细菌污染的有希望的备择方案。
材料和方法
在整个实施例中使用的材料和方法：
细菌菌株和生长条件
单核细胞增生李斯特氏菌EGDe和ΔprfA（Institute of Milk Hygiene, Milk Technology and Food Science, Department for Farm Animal and Public Health in Veterinary Medicine, Vetmeduni Vienna, 奥地利的保藏中心（collection）的一部分）和大肠杆菌TOP10F'（Invitrogen, Carlsbad, CA, 美国) 在具有0.6%（w/v）酵母的胰蛋白胨大豆液体培养基（TSB-Y; Oxoid, Hampshire, 英国)中于37℃生长过夜；使用HP 8452分光光度计（Hewlett-Packard, Waldbronn, 德国; 0.6 OD610近似108 cfu/ml）于610 nm处测量光密度。
DNA标准物
作为用于qPCR定量的DNA标准物，使用一毫升单核细胞增生李斯特氏菌（菌株EGDe或ΔprfA）或大肠杆菌过夜培养物用于利用NucleoSpin®组织试剂盒（MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, 德国）遵循用于革兰氏阳性细菌的规程说明进行DNA分离。DNA用50 μl ddH2O（70℃）洗脱两次。使用Qubit ds Broad Range试剂盒（Fisher Scientific, Vienna, 奥地利）测量DNA浓度。使用单核细胞增生李斯特氏菌（1 ng DNA等于3.1×105个基因组拷贝）或大肠杆菌（1 ng DNA等于1.8×105 个基因组拷贝）的DNA分子量计算单拷贝基因（EGDe，大肠杆菌）或单整合的（single-integrated）内部扩增对照的拷贝数。
qPCR
用于检测单核细胞增生李斯特氏菌的prfA qPCR测定在Rossmanith等人（Res Microbiol. 2006;157(8):763-771）之后进行了修改：一个25 μl终体积的qPCR反应含有1×反应缓冲液（Fisher Scientific, Vienna, 奥地利）、3.5 mM MgCl2、0.5 μM每种引物（表 4）、0.25 μM每种探针（表 4）、200 μM 每种dATP、dTTP、dGPT和dCTP、1.5 U Platinum Taq（Fisher Scientific, Vienna, 奥地利）和12 μl模板DNA。
用于检测大肠杆菌的sfmD qPCR测定在Kaclíková等人（Lett Appl Microbiol.2005;41(2):132-135）之后进行了修改：一个25 μl终体积的qPCR反应含有1×反应缓冲液、3.5 mM MgCl2、0.3 μM每种引物（表 4）、0.2 μM探针（表 4）、200 μM 每种dATP、dTTP、dGPT和dCTP、1 U Platinum Taq（Fisher Scientific, Vienna, 奥地利）和12 μl模板DNA。
使用表4中列出的热程序在Mx3000p实时PCR循环变温器（Stratagene, La Jolla, CA, 美国）中如以前所公开的进行qPCR，并使用MxPro 软件（自适应基线设置）进行分析。
表4. qPCR测定的引物、探针和热程序
所有引物和探针均从Eurofins（Ebersberg, 德国）获得。
贴纸
将可商购获得的文本标记贴纸（Markierungspunkte Ø 8 mm, 永久, No. 3013黄色, 3175白色, 3179绿色, AVERY TM of CCL Industries Inc., Toronto, 加拿大）使用无菌镊子应用到一条胶带（tesafilm®透明的, 15 mm No. 57370-02, tesa SE, Norderstedt, 德国），继之以用UV-C辐射灭菌15分钟（Sylvania G30W T8, 10 cm距离, Feilo Sylvania, Erlangen, 德国）。然后将贴纸化合物附着至感兴趣的表面。
贴纸的人为污染
对于贴纸的人为污染（图2），洗涤细菌并在1 × PBS（磷酸缓冲盐水）中对数稀释。将各自细菌悬浮液的5 μl液滴应用到每个贴纸，以达到每个样品约10、100、1000或10,000个菌落形成单位（cfu）。将细菌悬浮液干燥至少一小时或直到任何可见的水分已蒸发为止或将它们于室温保持1、3、7或14天。在各自的贮存时间之后，使用无菌镊子将贴纸转移到1.5 ml Eppendorf 管中用于后来的DNA提取。作为参考，将等体积（equi-volume）接种物直接转移到DNA提取和TSA-Y平板以获得参考值。并行地，将人为污染的贴纸在500 μl 1 × PBS中温育1小时，涡旋，并将整个上清液铺平板到TSA-Y。另一方面，将贴纸转移到half Fraser液体培养基（broth）（BIOKAR Diagnostics, Beauvais, 法国）或TSB培养基，并于30℃或相应地37℃24小时后评估细菌生长。
实验于室温（22℃至25℃）进行，且相对湿度水平为40%至60%。
从贴纸进行DNA回收和分离
用无菌镊子分离并转移到1.5 ml Eppendorf管中的贴纸通过在贴纸的顶部添加预裂解缓冲液直接用于使用NucleoSpin®组织DNA提取试剂盒（MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, 德国）进行DNA提取。遵循革兰氏阳性细菌的原始规程，同时有用两次24 μl ddH2O（70℃）进行DNA 洗脱以减少体积的修改，从而产生48 μl洗脱体积而不是100 μl。
用海绵棒取样
将贴纸的性能与海绵棒擦拭（具有缓冲的蛋白胨水液体培养基的海绵棒（Sponge-Stick with Buffered Peptone Water Broth），3M (TM), St. Paul, MN, 美国）进行比较。表面取样后，将海绵用10 ml 1 × PBS 浸泡并消化2分钟。将液体以8,000 g离心5分钟，且获得的沉淀接着用于使用NucleoSpin®试剂盒进行DNA提取（用两次48 μl H2O洗脱，70℃）。
清洗和消毒
肥皂水通过将EXACT AC（E. Mayr, Vösendorf, 奥地利）在水中稀释至通常用于清洗表面的浓度来制备。对于表面的消毒，通过擦拭应用mikrozid® AF液体（Schülke & Mayr, Norderstedt, 德国）。还测试了两分钟暴露时间用于进行比较。
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
