一种倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置及其使用方法和应用与流程

1.本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置及其使用方法和应用。


背景技术：

2.在细胞培养过程中，对活细胞进行动态观测在生命科学研究领域及医学研究领域中具有重要意义，对细胞繁殖转移、细胞吞噬及细胞间的相互作用等进行研究是生命科学的重要基础。
3.目前，传统的细胞培养在培养箱中完成，尽管传统细胞培养箱的箱内环境控制系统能够尽量避免培养过程中打开箱门造成腔内温度的大幅波动，但也无法杜绝细胞从培养箱中取出，移至室温环境产生的温度变化及细胞污染的可能，也给操作人员增加了转移操作过程的失误风险。细胞染色技术用于区分不同种类、不同形态、不同状态的细胞及细胞间的相互作用，通常是将待检测样本取出，滴入具有不同染色效果的染色液和缓冲液，混合均匀完成染色后，再洗掉影响观察的染色液及缓冲液，完成整个染色过程后转移到显微镜上观察。
4.现有技术中的培养装置难以满足活细胞的原位培养、原位染色及原位观察的需求。cn209797991u公开了一种原位观测细胞培养箱，包括主机与细胞培养室；所述的主机包括温控装置、气体控制装置和液体控制装置，以及co2进气口、第一进气口、第一出气口和注水口；所述的气体控制装置的入口与co2进气口和第一进气口相连接，出口与第一出气口相连接；所述液体控制装置的入口与注水口相连接，出口与第一出气口相连接；所述的细胞培养室包括盒体和上盖板，盒体内放置微流控芯片；所述盒体上设有偶数个液体管路接口；所述上盖板上设有上观察窗；所述盒体底部设有下观察窗，所述下观察窗与所述上观察窗相对设置；所述盒体上设有第二进气口和第二出气口，所述第二进气口与第一出气口进行连通，所述第二出气口与第一进气口进行连通。该装置实现了细胞的原位培养与观察，但是无法直接对装置内的细胞进行染色，操作较为不便。
5.因此，如何提供一种装置，可以实现细胞的原位培养、染色和观察，方便研究人员的操作，减少外界环境对细胞的影响，已成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置及其使用方法和应用，杜绝了从培养箱中转移细胞到室温环境中产生的影响，也避免了操作人员转移操作中可能出现的失误，同时满足了细胞的原位培养、染色和观察，便于实时观察细胞的培养、吞噬及相互作用等情况。
7.为达此目的，本发明采用如下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了一种倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置，
所述装置包括池体1，所述池体1包括池壁2、池底3和池盖5，所述池壁2上设置进气口11、出气口12、进水口13和出水口14，所述池底3上设有开口7，所述池盖5上设有染液进出口9。
9.本发明中，通过设置进气口11、出气口12、进水口13和出水口14，实现了装置内气体组成及温度的恒定，避免因周围环境条件骤变而对细胞的生理状态造成影响；通过设置可以放置培养皿的开口7，实现了细胞的原位培养与观察，配合染液进出口9与注射器的使用，实现了细胞的原位染色与观察，方便对细胞进行实时观测及定位，实验结果更加准确，使用也更加方便。
10.优选地，所述装置中还设有池隔板4，所述池隔板4与所述池壁2、池底3围合的闭合空间中装有恒温循环水。
11.优选地，所述池盖5上还设有温度传感器插入口8。
12.优选地，所述装置还包括温度控制系统15、co2气体控制系统16和加湿系统17。
13.优选地，所述池体1中含有co2、空气和水蒸气的混合气体。
14.本发明中，所述混合气体的具体组分可根据培养的细胞种类进行选择，此处不做限定。
15.优选地，所述进气口11、出气口12、进水口13、出水口14和染液进出口9上装有过滤器10。
16.本发明中，所述过滤器10帮助维持培养池内的无菌环境。
17.优选地，所述开口7的大小与培养皿的大小相同。
18.优选地，所述开口7的四周设置环形支撑板，所述支撑板的上方装有密封圈6。
19.本发明中，通过合适大小的开口7与环形支撑板的相互配合，可以将培养皿固定在池底3，具有抗压、减震、维持细胞培养环境稳定的效果。
20.优选地，所述染液进出口9的数量与开口7的数量相同。
21.本发明中，染液进出口9和开口7的数量可根据具体的实验需求加以确定，此处不做限定。
22.作为优选技术方案，本发明所述倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置，包括池体1，所述池体1包括池壁2、池底3和池盖5，所述池壁2上设置进气口11、出气口12、进水口13和出水口14，所述池底3上设有开口7，所述池盖5上设有温度传感器插入口8和染液进出口9，所述进气口11、出气口12、进水口13、出水口14和染液进出口9上装有过滤器10；
23.所述装置中还设有池隔板4，所述池隔板4与所述池壁2、池底3围合的闭合空间中装有恒温循环水；
24.所述装置还包括温度控制系统15、co2气体控制系统16和加湿系统17；
25.所述池体1中含有co2、空气和水蒸气的混合气体；
26.所述开口7的大小与培养皿的大小相同，其四周设置环形支撑板，所述支撑板的上方装有密封圈6；
27.所述染液进出口9的数量与开口7的数量相同。
28.第二方面，本发明提供了一种第一方面所述的倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置的使用方法，所述使用方法包括：
29.将所述装置和培养皿消毒后置于无菌操作台中，将细胞接种在培养皿中，并将接
种后的培养皿转移到装置的池体1的开口7中，盖上池盖5，调节池体1中的气体和温度，培养细胞，并进行观察。
30.本发明中，所述装置使用简单，方便操作，降低了操作失误的可能性，提高了研究人员的工作效率，应用价值极高。
31.优选地，所述使用方法还包括更换过滤器10的步骤。
32.优选地，所述消毒包括紫外消毒和/或高温消毒。
33.优选地，所述盖上池盖5后还包括将池体1转移到显微镜上的步骤。
34.优选地，所述调节池体1中的气体和温度的步骤包括：
35.将co2气体控制系统16连入进气口11和出气口12，调节气体流量，排尽池体1中的空气；
36.将设好温度的循环水管连入进水口13和出水口14，装上温度控制系统15。
37.优选地，所述使用方法还包括染色的步骤。
38.优选地，所述染色的方法包括：
39.用注射器从染液进出口9中吸出培养液，加入染液，染色后吸出，再加入洗液清洗，吸出洗液。
40.作为优选技术方案，本发明所述倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置的使用方法，包括以下步骤：
41.更换进气口11、出气口12、进水口13、出水口14和染液进出口9上的过滤器10，将所述装置和培养皿紫外消毒和/或高温消毒后置于无菌操作台中；
42.将细胞接种在培养皿中，并将接种后的培养皿转移到装置的池体1的开口7中，盖上池盖5，将池体1转移到显微镜上；
43.将co2气体控制系统16连入进气口11和出气口12，调节气体流量，排尽池体1中的空气；将设好温度的循环水管连入进水口13和出水口14，装上温度控制系统15，调节池体1中的气体和温度，培养细胞，并进行观察；
44.用注射器从染液进出口9中吸出培养液，加入染液，染色后吸出，再加入洗液清洗，晃动池体1，吸出洗液，染色后进行观察。
45.相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
46.本发明所述倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置结构设置科学合理，可以实现细胞的原位培养与观察，可以避免传统培养箱法培养中取出细胞时因环境骤变从而引发细胞的应激反应，生理状态发生改变从而对实验结果造成影响；通过设置染液进出口9实现了细胞的原位染色，从而可以对待观察细胞进行持续地观察，免除了寻找观察对象所需的时间，提升了工作效率；操作简单，使用方便，降低了实验失误的风险，促进了相关产品的推广与使用。
附图说明
47.图1为本发明实施例1中的倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置的侧视图；
48.图2为本发明实施例1中的倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置的俯视图；
49.图3为本发明实施例1中的倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置的开口7的结构俯视图；
50.图4为本发明实施例2中hmscs细胞染色后激光共聚焦显微镜拍摄的图片(比例尺＝50μm)；
51.图5为本发明实施例3中的倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置的侧视图；
52.图6为本发明实施例3中的倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置的俯视图；
53.图7为本发明实施例4中n2a细胞染色后激光共聚焦显微镜拍摄的图片(比例尺＝50μm)；
54.图8为本发明实施例5中4t1细胞染色后激光共聚焦显微镜拍摄的图片(比例尺＝10μm)。
55.图中，1
‑
池体，2
‑
池壁，3
‑
池底，4
‑
池隔板，5
‑
池盖，6
‑
密封圈，7
‑
开口，8
‑
温度传感器插入口，9
‑
染液进出口，10
‑
过滤器，11
‑
进气口，12
‑
出气口，13
‑
进水口，14
‑
出水口，15
‑
温度控制系统，16
‑
co2气体控制系统，17
‑
加湿系统。
具体实施方式
56.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
57.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
58.材料：
59.培养皿购自美国康宁corning；
60.过滤器购自thermo scientific；
61.小鼠乳腺癌4t1细胞、小鼠神经瘤母细胞n2a细胞和人骨髓间充质干细胞hmscs细胞购自酶研生物；
62.细胞培养液购自gibco；
63.细胞染液calcein
‑
am和pi购自invitrogen。
64.细胞染液dapi、cy5和dcfh购自thermo scientific。
65.实施例1
66.本实施例提供一种倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置，其侧视图如图1所示，俯视图如图2所示。
67.所述倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置包括池体1，所述池体1包括池壁2、池底3和池盖5，所述池壁2上设置进气口11、出气口12、进水口13和出水口14，所述池底3上设有开口7，所述池盖5上设有温度传感器插入口8和染液进出口9，所述进气口11、出气口12、进水口13、出水口14和染液进出口9上装有过滤器10；
68.所述装置中还设有池隔板4，所述池隔板4与所述池壁2、池底3围合的闭合空间中
装有恒温循环水；
69.所述装置还包括温度控制系统15、co2气体控制系统16和加湿系统17；
70.所述池体1中含有co2、空气和水蒸气的混合气体；
71.所述开口7的大小与培养皿的大小相同，直径为20mm，其四周设置环形支撑板，所述支撑板的上方装有密封圈6，开口7的结构俯视图如图3所示；
72.所述染液进出口9的数量与开口7的数量相同，均为4个。
73.本发明所述倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置设计科学，结构合理，可以实现细胞的原位培养、染色和观察。
74.实施例2
75.本实施例使用实施例1制备的倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置，对细胞进行培养、染色和观察，具体步骤如下：
76.(1)更换进气口11、出气口12、进水口13、出水口14和染液进出口9上的过滤器10，将所述装置和培养皿紫外消毒后置于无菌操作台中；
77.(2)将人骨髓间充质干细胞(hmscs)接种在培养皿中，并将接种后的培养皿转移到装置的池体1的开口7中，盖上池盖5，将池体1转移到激光共聚焦显微镜的载物台上；
78.(3)将co2气体控制系统16连入进气口11和出气口12，调节气体流量，排尽池体1中的空气；将设好温度的循环水管连入进水口13和出水口14，装上温度控制系统15，调节池体1中的气体为5％的co2和空气的混合气体，调节温度为37℃，培养细胞，并进行观察；
79.(4)人骨髓间充质干细胞(hmscs)在池体1中于37℃和5％的co2的条件下培养48h后，用注射器从染液进出口9中吸出培养液，用pbs清洗5次。从染液进出口9中加入用pbs稀释好的各组分浓度分别为2μmol/l的calcein
‑
am和4μmol/l的pi，使染色液刚好没过样品，孵育15min，用pbs清洗，晃动池体1，吸出洗液，进行激光共聚焦显微镜观察；
80.(5)实验结束后，关闭气源、水源，拆下温度传感器；从激光共聚焦显微镜上移下池体1，打开池盖5，取出共聚焦培养皿，拆下所有的过滤器10，将池体1进行杀菌消毒，并放入无菌操作台中后续备用。
81.细胞的免疫荧光图片如图4所示。由图可以看出，细胞形态规则，密度均匀，活细胞数量很多，证明细胞生理状态良好，所述装置可以为细胞提供适宜的培养环境，并且可以实现细胞的原位培养、染色与观察，使用方便，提升了工作效率。
82.实施例3
83.本实施例提供一种倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置，其侧视图如图5所示，俯视图如图6所示。
84.所述倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置包括池体1，所述池体1包括池壁2、池底3和池盖5，所述池壁2上设置进气口11、出气口12、进水口13和出水口14，所述池底3上设有开口7，所述池盖5上设有温度传感器插入口8和染液进出口9，所述进气口11、出气口12、进水口13、出水口14和染液进出口9上装有过滤器10；
85.所述装置中还设有池隔板4，所述池隔板4与所述池壁2、池底3围合的闭合空间中装有恒温循环水；
86.所述装置还包括温度控制系统15、co2气体控制系统16和加湿系统17；
87.所述池体1中含有co2、空气和水蒸气的混合气体；
88.所述开口7的大小与培养皿的大小相同，直径为20mm，其四周设置环形支撑板，所述支撑板的上方装有密封圈6，开口7的结构与实施例1中相同；
89.所述染液进出口9的数量与开口7的数量相同，均为6个。
90.本发明所述倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置可以实现细胞的原位培养、原位观察及原位染色，使用方便，提升了工作效率。
91.实施例4
92.本实施例使用实施例3制备的倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置，对小鼠神经瘤母细胞(n2a)进行培养、染色和观察，使用的细胞染液为dcfh，具体染色步骤与实施例2相同。
93.细胞的免疫荧光图片如图7所示。由图可以看出细胞分布均匀，形态规则，细胞生理状态良好，内部结构清晰可见，说明所述倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置具有实际应用的价值。
94.实施例5
95.本实施例使用实施例3制备的倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置，对小鼠乳腺癌细胞(4t1)进行培养、染色和观察，使用的细胞染液为dapi和cy5，具体染色步骤与实施例2相同。
96.细胞的免疫荧光图片如图8所示。由图可以看出细胞形态清晰，染色清楚。结合图4、7和8可知，本技术所述的倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置对多种细胞类型均适用，应用前景广阔。
97.综上所述，本发明提供了一种倒置显微镜用细胞的原位培养、染色和观察的装置，所述装置实现了细胞培养过程中细胞的原位培养与观察，避免细胞因从培养箱中移出而产生应激状态，生理状态稳定，实验结果更加准确；染液进出口9与注射器配合使用，实现了细胞的原位染色，可以对观察对象进行连续观察，提升了工作效率；结构合理，使用方便，具有用于实际科研工作中的价值，应用前景广阔。
98.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。