枯草芽胞杆菌表面活性素（Surfactin）产量的提升及其应用的制作方法

技术特征：
1.通过同源重组原理获得单产surfactin的改良菌株b9δdeguδbmya(b9bd)及方法。通过双突变degu和bmya基因获得枯草芽胞杆菌表面活性素(surfactin)产量提高的菌株的方法，其特征在于：引物设计：bmyaf：tgaatgggtgtctgtccggabmyar：tgacgatgccggttagatggkm(bmy)
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f：ttaactgcaggagtatggacagttgcggatgkm(bmy)
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r：ggatgaattcgcgaaccatttgaggtgatag以枯草芽胞杆菌bs916基因组为模板，分别用引物bmya
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f/r扩增bmya基因序列(片段长度约2200bp)，并将该片段进行t/a克隆，构建中间载体pmd
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bmya。以质粒pt
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km为模板，用引物km(bmy)
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f/r扩增km基因序列(片段长度约1400bp)；将km基因片段插入psti和ecori酶切的中间载体，最终构建突变载体pt
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bmyakm。采用化学转化法，将构建好的突变载体pt
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bmyakm转化入枯草芽胞杆菌bs916和b9δdegu中，经过km抗生素筛选，获得转化子，提取转化子基因组，pcr验证转化子，即为b9δdeguδbmya(b9bd)，将正确转化子于
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70℃甘油保藏。2.权利要求1所述改良菌株b9δdeguδbmya(b9bd)高产surfactin的发酵培养基及优化方法。以菌株b9δdeguδbmya(b9bd)为出发菌株，利用高效液相色谱技术分析surfactin产量，筛选影响b9δdeguδbmya(b9bd)发酵产surfactin的培养基成分；通过plackett
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burman实验设计、中心组合实验设计(ccd)和响应曲面法，优化了b9δdeguδbmya(b9bd)高产surfactin的发酵培养基成分。3.权利要求1所述菌株b9δdeguδbmya(b9bd)在权利要求2所优化培养基中产生的表面活性素在防治水稻病害中的应用。因表面活性素发挥作用机理主要是抑制病原菌和诱导水稻抗病性，因此其防治水稻病害包括但不限于水稻纹枯病和白叶枯病。

技术总结
本发明涉及通过基因突变和发酵工艺优化提高枯草芽胞杆菌表面活性素(Surfactin)产量的方法及其应用，属于生物技术领域。本发明以枯草芽胞杆菌Bs916(CGMCC No.0808)为原始菌株，以之前构建的高产表面活性素的菌株B9ΔdegU(申请号：201911313407.9)为基础，利用同源重组原理，再次突变枯草芽胞杆菌Bs916基因组中的bmyA基因，获得了同时突变degU和bmyA的双突变菌株B9ΔdegUΔbmyA(B9BD)。随后，以菌株B9ΔdegUΔbmyA(B9BD)为出发菌株，通过Plackett


技术研发人员：乔俊卿 刘邮洲 刘永锋
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：2021.06.29
技术公布日：2021/10/18