多肽纳米杂化物及其用途的制作方法

1.本发明属于生物工程领域，具体地，本发明涉及多肽纳米杂化物及其用途。


背景技术：

2.随着现代人生活方式的改变、年龄的增长以及各方面压力的增大，肌肤问题越来越多，细纹、毛孔粗大的问题很容易就找上门。皮肤皱纹是人体衰老的最明显迹象，皮肤在衰老过程中，神经末梢会释放乙酰胆碱，引发肌肉松弛，皮肤收缩，产生动态纹或表情纹等现象，动态纹或表情纹的产生对人外貌的变化可能对人的生活质量产生负面影响。在某些情况下，对外表的担忧会影响人际交往、职业功能。到目前为止，肉毒杆菌毒素是最常用和最有效的减少皱纹的化合物之一。但是由于肉毒素的高毒性以及需要长期注射使用，会造成许多副作用，如呼吸困难、肌肉无力、肉样瘤肉芽肿、头痛、流感样症状、过敏反应等。因此，开发新的安全、有效抗皱组合物或药物是非常有必要的。
3.随着研究的进展，六胜肽的出现给抗皱的安全性带来了希望，与肉毒素相比，六胜肽无刺激、安全、无手术风险、无年龄肤质要求以及无需注射，如雅诗兰黛的黄金六胜肽、倩碧六肽光子抗老瓶。六胜肽是由6个氨基酸组成的多肽，序列为 ac
‑
glu
‑
glu
‑
met
‑
gln
‑
arg
‑
arg
‑
nh2，由突触蛋白snap
‑
25的氮端(aa12
‑
17)衍生而来的六个氨基酸肽链，能与snare三元复合物相互作用（破坏胞内snap25
‑
rabphilin
‑
3a间的相互作用），抑制嗜铬细胞中受ca
2＋
调控的儿茶酚胺释放，从而阻止神经
‑
肌肉间的乙酰胆碱传导，引起肌肉麻痹，让肌肉放松，减少动态纹的发生，从而消除细纹。
4.然而，在实际的多肽治疗中，特别是那些针对细胞内的ppis（细胞内蛋白
‑
蛋白相互作用），总是存在两个固有的缺陷：蛋白水解稳定性差和细胞膜通透性低，这些会影响多肽的疗效。为了解决这些药理学障碍，越来越多的针对蛋白水解抗性的精心设计，如修饰和靶向递送载体，已经出现在肽的临床转化应用中，尽管这两种方法在优化多肽治疗方面取得了一些成功，但细胞内ppis治疗转化应用仍具有挑战性。
5.近年来，纳米技术提供了一种自下而上的方法，借助共价或非共价修饰方式使得多肽具有蛋白水解抗性和细胞膜穿透性的稳定结构。一些肽衍生纳米药物，包括脂质体/大分子来源的肽纳米微球、肽包被纳米颗粒和基于多肽的自组装纳米结构材料，具有延长循环时间、增强靶向疾病特异性、增强蛋白水解稳定性和优化治疗效果等优异的生物学优势。
6.随着纳米金颗粒偶联肽治疗技术的发展，越来越多的纳米金因其惰性的本质、毒性低和经济成本等内在优势被应用于临床试验。然而，肽的复杂化学性质（疏水性、电荷性和氧化还原性）总是不利于共轭后的胶体纳米金颗粒的稳定，导致在离子浓度升高的生理条件下，发生聚集甚至沉淀。此外，胶体稳定性的减弱往往伴随着治疗肽的提前释放和网状内皮系统吸收的增强，最终导致脱靶毒性和治疗失败。
7.多肽衍生的纳米复合材料已显示出卓越的生物性能，包括但不限于优异的生物相容性、生物降解性、靶向性和良好的治疗效果。虽然在基于多肽结构的纳米工程方面已经取得了一些成功，但在多肽纳米制剂的临床应用方面仍存在巨大的挑战，特别是在调节细胞
内蛋白
‑
蛋白相互作用方面。


技术实现要素：

8.为了解决现有技术的不足，本发明既提供了一种多肽，又提供了一种多肽纳米杂化物，同时还提供了多肽或多肽纳米杂化物在制备抗衰和/或抗皱护肤组合物中的用途。本发明提供的多肽或多肽纳米杂化物具有很好的消除或减少褶皱的功效。
9.本发明的目的通过以下技术方案来实现：第一方面，本发明提供一种多肽纳米杂化物，所述多肽纳米杂化物的结构为[au
‑
s
‑
s
‑
十五肽]n，所述十五肽的氨基酸序列为sefmrneleemqrra。
[0010]
第二方面，提供一种护肤组合物，所述护肤组合物包含本发明所述的多肽纳米杂化物。
[0011]
第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含安全有效量的如本发明所述的多肽纳米杂化物。
[0012]
第四方面，提供本发明所述的多肽纳米杂化物在制备护肤组合物中的用途。
[0013]
第五方面，提供本发明所述的多肽纳米杂化物在制备抗衰、抗皱和/或美白护肤组合物中的用途。
[0014]
第六方面，提供本发明所述的多肽纳米杂化物在麻痹哺乳动物肌肉状态中的用途。
[0015]
第七方面，提供本发明所述的多肽纳米杂化物在抑制神经递质释放中的用途。
[0016]
第八方面，提供本发明所述的多肽纳米杂化物在制备肌肉松弛剂中的用途。
[0017]
第九方面，提供本发明所述的护肤组合物在减缓或抑制或预防人皮肤衰老中的用途。
[0018]
在优选的实施方式中，所述护肤组合物为乳膏、香脂、泡沫、洗液、凝胶、乳霜、化妆品、个人护理产品、水凝胶、搽剂、浆液、肥皂、扑粉、糊剂、半固体制剂、精华素、洗发水、护发素、软膏、摩丝、粉剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、悬浮液、乳液或贴剂。
[0019]
第十方面，本发明提供一种多肽纳米杂化物，所述多肽纳米杂化物包含纳米金和十五肽，所述纳米金与所述多肽之间通过au
‑
s键结合，所述十五肽的氨基酸序列为sefmrneleemqrra。
[0020]
第十一方面，本发明提供一种多肽纳米杂化物的制备方法，所述方法包含以下步骤：s1.计算机辅助模拟、结构设计得到十五肽的氨基酸序列；s2.利用fmoc固相合成的方法合成半胱氨酸修饰的rabphilin
‑
3a拮抗剂，得到十五肽
‑
sh；s3.将干燥过的十五肽
‑
sh溶解在nh2‑
peg
‑
sh、无水乙醇和纯水的混合溶液中，待十五肽
‑
sh完全溶解，加入羟乙基哌嗪乙基磺酸和haucl4, 涡旋搅拌，得到au
‑
肽前体；s4.将羟乙基哌嗪乙基磺酸、haucl4和纯水混合，涡旋搅拌，得到纳米金溶液；s5.将au
‑
肽前体加入纳米金溶液中，得到多肽纳米杂化物。
[0021]
如本文中所使用的，术语“肽”或“多肽”是指天然和合成的肽，其可仅包含天然氨基酸，仅非天然氨基酸或天然和非天然氨基酸的组合。 如本文中所用的，术语“多肽”包括
寡肽、肽、多肽及其衍生物、肽类似物及其衍生物以及这些化合物的药学上可接受的盐。“肽类似物”是指合成修饰的氨基酸或肽。 如本文中所用的，术语“肽”还包括与其他物种例如金属离子（例如铜、锌、锰、镁等）的配合物。
[0022]
如本文中所用的，术语“氨基酸”包括并涵盖所有天然存在的和非天然氨基酸，如果具有光学活性，则呈d
‑
或l
‑
构型。如本文中所用的，术语“十五肽”是在其结构内包括十五个氨基酸的不间断序列的化合物。 这些在本文中使用传统的三字母约定从左（n端）到右（c端）表示。在此命名法中，s是丝氨酸，e是谷氨酸，f是苯丙氨酸，m是甲硫氨酸，r是精氨酸，n是天冬酰胺，e是谷氨酸，l是亮氨酸，e是谷氨酸，e是谷氨酸，m是甲硫氨酸，q是谷氨酰胺，r是精氨酸，r是精氨酸，a是丙氨酸。
[0023]
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的多肽是根据snap25与rabphilin
‑
3a间的有效结合氨基酸位点，截取关键氨基酸，获得的新的多肽序列，本发明提供的多肽与rabphilin
‑
3a的亲和力更强，其亲和力能提高5
‑
6个量级。
[0024]
现有护肤组合物中使用的短肽多为十肽以下，其稳定性、亲和力、渗透皮肤屏障不理想。a型肉毒毒素受到剂量和作用可逆等限制，且长期注射可能会造成长期、严重的不良反应，如呼吸困难、肌肉无力、肉样瘤肉芽肿、头痛、流感样症状、过敏反应等。本发明提供的多肽为仿a型肉毒素的十五肽，稳定性、渗透性和亲和力均较好，且展现出良好的生物相容性，能够更好的穿透细胞膜、抵抗蛋白酶水解，从而能够更好的阻止神经
‑
肌肉间的乙酰胆碱传导、引起肌肉麻痹、让肌肉放松、减少动态纹的发生，从而消除细纹。
[0025]
将本发明提供的多肽纳米杂化物涂抹在皮肤上，可以抑制皮肤松弛，抗衰老。进一步的，本发明提供的多肽纳米杂化物可以用于面部表情肌麻痹松弛，从而用于改善面部轮廓和消除或减少褶皱。
附图说明
[0026]
图1a为au
‑
con组处理小鼠1小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图1b为au
‑
con组处理小鼠2小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图1c为au
‑
con组处理小鼠3小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图1d为au
‑
con组处理小鼠4小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图2a为六肽组处理小鼠1小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图2b为六肽组处理小鼠2小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图2c为六肽组处理小鼠3小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图2d为六肽组处理小鼠4小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图3a为十五肽组处理小鼠1小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图3b为十五肽组处理小鼠2小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图3c为十五肽组处理小鼠3小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图3d为十五肽组处理小鼠4小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图4a为纳米金
‑
六肽组处理小鼠1小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图4b为纳米金
‑
六肽组处理小鼠2小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图4c为纳米金
‑
六肽组处理小鼠3小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；
图4d为纳米金
‑
六肽组处理小鼠4小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图5a为纳米金
‑
十五肽组处理小鼠1小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图5b为纳米金
‑
十五肽组处理小鼠2小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图5c为纳米金
‑
十五肽组处理小鼠3小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图5d为纳米金
‑
十五肽组处理小鼠4小时后肢脚趾形态及松弛观察结果图；图6a为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠1小时后小鼠的抓力测定结果图；图6b为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠2小时后小鼠的抓力测定结果图；图6c为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠3小时后小鼠的抓力测定结果图；图6d为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠4小时后小鼠的抓力测定结果图；图7a为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠1小时后小鼠的跑动耐力变化结果图；图7b为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠2小时后小鼠的跑动耐力变化结果图；图7c为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠3小时后小鼠的跑动耐力变化结果图；图7d为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠4小时后小鼠的跑动耐力变化结果图；图8a为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠1小时后小鼠的跑动距离变化结果图；图8b为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠2小时后小鼠的跑动距离变化结果图；图8c为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠3小时后小鼠的跑动距离变化结果图；图8d为使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽处理小鼠4小时后小鼠的跑动距离变化结果图。
具体实施方式
[0027]
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚的呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
[0028]
实施例1本实施例提供一种多肽纳米杂化物，所述多肽纳米杂化物的结构为[au
‑
s
‑
s
‑
十五肽]n，所述十五肽的氨基酸序列为sefmrneleemqrra。
[0029]
实施例2本实施例提供一种护肤组合物，所述护肤组合物包含实施例1所述的多肽纳米杂
化物。
[0030]
实施例3本实施例提供一种药物组合物，所述药物组合物包含安全有效量的如实施例1所述的多肽纳米杂化物。
[0031]
实施例4本实施例提供本发明所述的多肽纳米杂化物在制备护肤组合物中的用途。
[0032]
实施例5本实施例提供本发明所述的多肽纳米杂化物在制备抗衰、抗皱和/或美白护肤组合物中的用途。
[0033]
实施例6本实施例提供本发明所述的多肽纳米杂化物在麻痹哺乳动物肌肉状态中的用途。
[0034]
实施例7本实施例提供本发明所述的多肽纳米杂化物在抑制神经递质释放中的用途。
[0035]
实施例8本实施例提供本发明所述的多肽纳米杂化物在制备肌肉松弛剂中的用途。
[0036]
实施例9本实施例提供本发明所述的护肤组合物在减缓或抑制或预防人皮肤衰老中的用途。
[0037]
优选地，所述护肤组合物为乳膏、香脂、泡沫、洗液、凝胶、乳霜、化妆品、个人护理产品、水凝胶、搽剂、浆液、肥皂、扑粉、糊剂、半固体制剂、精华素、洗发水、护发素、软膏、摩丝、粉剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、悬浮液、乳液或贴剂。
[0038]
实施例10 计算机辅助模拟、结构设计获得十五肽的氨基酸序列基于snap
‑
25与rabphilin
‑
3a晶体结构，利用discovery studio软件，对相应氨基酸位点进行天然氨基酸突变，之后根据能量最小化原则，对突变复合体蛋白进行能量最小化模拟。根据模拟结果，输出结合界面与结合自由能，以进行比较，获得最优序列：sefmrneleemqrra。
[0039]
实施例11 制备钻石十五肽
‑
sh采用全化学合成多肽技术，采用boc化学固相肽合成或abi提供的hbtu/hobt为基础的fmoc法优化的hbtu活化/diea原位中和方案，在cs bio 336x自动肽合成仪中的mbha树脂上合成所有肽。在 hf（boc化学）或含有88％tfa，5％苯酚，5％h2o和2％tips（fmoc化学）的试剂混合物中裂解和去保护后，用冷乙醚沉淀粗产物并通过制备型c
18
反相hplc方法纯化至均一。通过电喷雾电离质谱（esi
‑
ms）确定分子量。在冷冻干燥机上冷冻干燥，得到十五肽
‑
sh，于
‑
20℃保存。
[0040]
实施例12 制备au
‑
肽前体将10mg十五肽
‑
sh溶解在2.5ml nh2‑
peg
‑
sh（4mg/ml，纯水溶解）、2.5ml无水乙醇以及6.25ml纯水的混合溶液中，超声振荡5min
‑
10min，使十五肽
‑
sh完全溶解；之后将其倒入干净的100ml烧杯中，烧杯置于磁力搅拌器上，设置温度为50℃，转速为500rpm，然后依次加入11.25ml hepes (100mm， ph 7.4，纯水溶解)、2.5ml haucl4（10mm，纯水溶解），反应30s
‑
60s, 溶液由黄色泛白，即形成au
‑
肽前体。
[0041]
实施例13 制备纳米金溶液将11.25ml hepes（100mm，ph 7.4）、11.25ml纯水、2.5ml haucl4（10mm）依次加入干净的100ml烧杯中, 烧杯置于磁力搅拌器上，设置温度为50℃，转速为500rpm，搅拌30s，溶液变成紫红色，即形成纳米金溶液。
[0042]
实施例14 制备多肽纳米杂化物在纳米金溶液形成后，立刻将合成好的au
‑
肽前体倒入到含纳米金溶液的烧杯中，将磁力搅拌器温度设置为50℃，转速为300rpm，待溶液反应1min后拿移液器吸取1ml的聚丙烯胺盐酸盐pah（4mg/ml，纯水溶解），缓慢逐滴加入到烧杯中，反应5
‑
10min后，收集烧杯中的液体到50ml离心管中，即完成多肽纳米杂化物的制备。
[0043]
实施例15 多肽纳米杂化物的物理性质、化学性质及药物性能表征
①
制备不同溶剂的多肽纳米杂化物，然后用移液器吸取不同溶剂的多肽纳米杂化物，滴加到碳支持膜上，待碳支持膜干燥后，通过透射电子显微镜来测定其形貌尺寸，筛选合适的多肽纳米杂化物。进一步地，通过动态光散射（dls）对筛选的多肽纳米杂化物的水合粒径进行表征，验证其具有合理的尺寸，适合于较好的被动靶向操作。
[0044]
②
将多肽纳米杂化物悬浮在37℃、含有20%胎牛血清的pbs中，通过dls监测其粒径随时间的变化，以判断其稳定性。
[0045]
③
通过紫外吸收光谱、傅里叶变换红外吸收光谱、zeata电位来验证纳米金与au
‑
肽前体是否成功连接。
[0046]
④
通过基于荧光偏振的竞争性结合测定多肽纳米杂化物对snap
‑
25/rabphilin
‑
3a
fitc
的抑制能力。
[0047]
⑤
将多肽纳米杂化物分别与含有10%血清、氧化型谷胱甘肽和胰凝乳蛋白酶的标准pbs 孵育，通过hplc测试，随时间的增加，检测多肽纳米杂化物含量的变化。此外，我们将多肽纳米杂化物（0.5mg/ml）分别与 pbs孵育（ph7.4，模拟体内中性环境）、含有10mm 还原型谷胱甘肽（gsh）的 pbs孵育（ph7.4，模拟体内还原环境），并通过hplc来定量释放的15肽，以表征15肽的抗酶解及可控释放能力。
[0048]
实施例16 使用人工短肽
‑
6肽、人工短肽
‑
15肽、纳米金
‑
6肽、纳米级
‑
15肽（即本发明的多肽纳米杂化物）用于小鼠腓肠肌麻痹松弛实验研究实验对象：使用8
‑
12周龄的c57品系小鼠；实验方法：小鼠腓肠肌注射实验设计分为au
‑
con组（对照组），六肽组（仿a型肉毒素六肽组）、十五肽组（仿a型肉毒素十五肽组）、纳米金
‑
六肽组（纳米金
‑
仿a型肉毒素六肽组）、纳米金
‑
十五肽组（纳米金
‑
仿a型肉毒素十五肽组，即本发明的多肽纳米杂化物组），每组不少于3只；注射方式采用微量注射器后肢小腿腓肠肌肌肉注射；给药方式采用单次注射，四肢给药；给药剂量为单点20μg；注射方式按照上述方案分别对不同组别的小鼠腓肠肌注射；分别于注射后1h、2h、3h和4h，观察小鼠后肢脚趾形态及松弛程度。
[0049]
实验结果如图1
‑
图5所示。
[0050]
由图1
‑
图5可知，通过观察au
‑
con组（对照组）、六肽组、纳米金
‑
六肽组、十五肽组和纳米金
‑
十五肽组注射后不同时间点小鼠后肢形态，发现较对照组在注射后3h后，六肽组、纳米金
‑
六肽组，十五肽组和纳米金
‑
十五肽组的小鼠后肢均出现不同程度脚趾并拢、松弛的肌肉无力表型，十五肽组和纳米金
‑
十五肽组的表型较六肽组和纳米金
‑
六肽组更为显
著，纳米金
‑
十五肽组的表型最为显著。
[0051]
实施例17 使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽（即本发明的多肽纳米杂化物）处理小鼠后，利用小鼠抓力测定仪对小鼠的抓力进行测定实验对象：使用8
‑
12周龄的c57品系小鼠；实验方法：小鼠腓肠肌注射实验设计分为au
‑
con组（对照组），六肽组（仿a型肉毒素六肽组）、十五肽组（仿a型肉毒素十五肽组）、纳米金
‑
六肽组（纳米金
‑
仿a型肉毒素六肽组）、纳米金
‑
十五肽组（纳米金
‑
仿a型肉毒素十五肽组，即本发明的多肽纳米杂化物组），每组不少于3只；注射方式采用微量注射器后肢小腿腓肠肌肌肉注射；给药方式采用单次注射，四肢给药；给药剂量为单点20μg；注射方式按照上述方案分别对不同组别的小鼠腓肠肌注射；分别于注射后1h、2h、3h和4h，利用小鼠抓力测定仪对小鼠的抓力进行测定。
[0052]
实验结果如图6所示。
[0053]
由图6可知，通过对上述不同组不同时间点小鼠抓力测定，实验结果显示注射2小时纳米金
‑
十五肽组的小鼠抓力出现显著下降，六肽组的小鼠整体抓力无显著变化；纳米金
‑
六肽组的小鼠在4小时出现抓力下降；而十五肽组和纳米金
‑
十五肽组小鼠的抓力在3h下降持续到4h；且与十五肽组相比，纳米金
‑
十五肽组的小鼠抓力变化更为显著。
[0054]
实施例18 使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽（即本发明的多肽纳米杂化物）处理小鼠后，利用小鼠疲劳仪对小鼠的跑动耐力进行测定实验对象：使用8
‑
12周龄的c57品系小鼠；实验方法：小鼠腓肠肌注射实验设计分为au
‑
con组（对照组），六肽组（仿a型肉毒素六肽组）、十五肽组（仿a型肉毒素十五肽组）、纳米金
‑
六肽组（纳米金
‑
仿a型肉毒素六肽组）、纳米金
‑
十五肽组（纳米金
‑
仿a型肉毒素十五肽组，即本发明的多肽纳米杂化物组），每组不少于3只；注射方式采用微量注射器后肢小腿腓肠肌肌肉注射；给药方式采用单次注射，四肢给药；给药剂量为单点20μg；注射方式按照上述方案分别对不同组别的小鼠腓肠肌注射；分别于注射后1h、2h、3h和4h，利用小鼠疲劳仪对小鼠的跑动耐力进行测定。
[0055]
实验结果如图7所示。
[0056]
由图7可知，通过对上述各组不同时间点小鼠跑步耐力测定，测试结果显示注射1小时纳米金
‑
十五肽组小鼠耐力出现明显下降，相较于对照组，其余4组在2h开始都出现耐力显著下降；但是六肽组在4h耐力得到恢复；而纳米金
‑
六肽组仍存在耐力下降。此外，与其他3组相比，纳米金
‑
十五肽组小鼠耐力下降最为显著，且维持效果最好。
[0057]
实施例19 使用au
‑
con、六肽、十五肽、纳米金
‑
六肽、纳米级
‑
十五肽（即本发明的多肽纳米杂化物）处理小鼠后，利用小鼠疲劳仪对小鼠的跑动距离进行测定实验对象：使用8
‑
12周龄的c57品系小鼠；实验方法：小鼠腓肠肌注射实验设计分为au
‑
con组（对照组），六肽组（仿a型肉毒素六肽组）、十五肽组（仿a型肉毒素十五肽组）、纳米金
‑
六肽组（纳米金
‑
仿a型肉毒素六肽组）、纳米金
‑
十五肽组（纳米金
‑
仿a型肉毒素十五肽组，即本发明的多肽纳米杂化物组），每组不少于3只；注射方式采用微量注射器后肢小腿腓肠肌肌肉注射；给药方式采用单次注射，四肢给药；给药剂量为单点20μg；注射方式按照上述方案分别对不同组别的小鼠腓肠肌注射；分别于注射后1h、2h、3h和4h，利用小鼠疲劳仪对小鼠的跑动距离进行测定。
[0058]
实验结果如图8所示。
[0059]
由图8可知，通过对上述各组不同时间点小鼠跑步距离测定，测试结果显示注射1小时纳米金
‑
十五肽组小鼠跑动距离出现下降。随后，较对照组，其余4组在2h都出现跑动距离显著下降，但是六肽和纳米金
‑
六肽组在3h和4h的跑动距离恢复对照组水平；十五肽组在3h跑动距离仍然显著下降，但是到4h时与对照相比差异不显著；而相较于对照组，纳米金
‑
十五肽组小鼠跑动距离在2
‑
4h显著下降，3h下降最多，到4h开始有所恢复，维持效果最好。
[0060]
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
[0061]
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。