枯草芽胞杆菌表面活性素（Surfactin）产量的提升及其应用的制作方法

枯草芽胞杆菌表面活性素(surfactin)产量的提升及其应用
技术领域
1.本发明涉及通过基因突变和发酵工艺优化提高枯草芽胞杆菌表面活性素产量的方法即其应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)是一类好氧革兰氏阳性细菌，对多种植物病原菌具有拮抗性，能产生丰富多样的抗菌代谢产物，尤其是以非核糖体途径合成的脂肽类抗菌物质(surfactin，fengycin和iturin)，不仅具有抗菌活性，而且还具有生物表面活性剂的功能和诱导植物抗性的作用。因此，芽胞杆菌在农业、医药、工业和环境保护上有着广泛的应用。
3.表面活性素(surfactin)是生防芽胞杆菌发挥防效的重要物质，也是提升微生物农药效价和货架期的关键因子。近年来，以芽胞杆菌为活性成分的微生物农药在植物病害生物防治中被广泛使用，国内外用于生防微生物研究和开发的优良芽胞杆菌有fzb42、bs916、b3、lx
‑
11、sqr9、ncd
‑
2、mbi600等。生防芽胞杆菌产生的抑菌活性物质表面活性素(surfactin)是其发挥防效的重要物质，具有降低表面活性张力、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、诱导植物抗病性、增强芽胞杆菌的生境定殖能力的作用。当芽胞杆菌被开发为生物农药施用后，生防菌定殖于生境，通过产生抑菌物质而发挥作用。芽胞杆菌产生抗菌物质的能力及芽孢存活力等都是影响微生物农药效价和货架期的重要因素。然而，受遗传、环境和营养等因素影响，芽胞杆菌合成分泌抗菌物质的效率非常低，需要长时间的剂量积累才能发挥其抑菌、诱导抗病性等作用。
4.综合前人研究结果表明，为了获得高产量的surfactin，目前国内外科研工作者围绕筛选高产surfactin的菌株资源筛选、影响surfactin生物合成和外泌的调控通路及机制和高效发酵工艺等开展了相关研究。目前，已有科学家尝试通过分子生物学技术对菌种进行改良，进而提高其产表面活性素的产量。如江南大学的qun wu等在2019年利用基因工程技术来增加枯草芽胞杆菌168中surfactin的产量，该研究中通过对已经报道的surfactin脂肪链代谢途径、surfactin合成基因簇及调控因子和surfactin外泌及耐受基因进行了突变或者增强表达，最终将surfactin的产量显著提高(qun wu，yan zhi，yan xu.systematically engineering the biosynthesis of a green biosurfactant surfactin by bacillus subtilis 168[j].metabolic engineering.2019，52：87
‑
97.)。此外，分别在2011年和2016年，南京农业大学的陆兆新、别小妹团队等，通过对已报到的影响芽胞杆菌脂肽类抗生素的相关基因进行突变(abrb，phrc)或超表达(coma，yerp，degq)等来实现脂肽类抗生素的产量提升(cn201110071211.0、cn201110105407.7、cn201110105392.4、cn201110105395.8、cn201610032668.3)。此外，通过发酵工艺优化也是surfactin产量提升的重要策略。2017年，江苏省农业科学院的乔俊卿等，通过优化发酵工艺，提升枯草芽胞杆菌脂肽类抗生素的产量；
[0005]
枯草芽胞杆菌bacillus subtilis bs916是江苏省农科院植物保护研究所研发的
生物农药“纹曲宁”的活性成分，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmcc no.0808。研究表明bs916能产生表面活性素、伊枯草素和泛革素三类脂肽抗生素。本专利发明人基于前期构建的高产表面活性素的菌株b9δdegu(申请号：201911313407.9)，进一步利用同源重组原理将伊枯草菌素基因簇的bmya基因进行部分缺失突变，构建只产生表面活性素的工程菌株b9δdeguδbmya(b9bd)。随后，通过plackett
‑
burman实验设计、中心组合实验设计(ccd)和响应曲面法，优化了b9δdeguδbmya(b9bd)产生surfactin的发酵培养基成分，并利用分离获得的表面活性素进行了水稻主要病害的盆栽防效评估。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是为了提高枯草芽胞杆菌bs916产生表面活性素产量，方便表面活性素的分离纯化，本专利发明人利用分子生物学技术构建了一株高产、单产表面活性素的菌株b9δdeguδbmya(b9bd)，通过plackett
‑
burman实验设计、中心组合实验设计(ccd)和响应曲面法，提供一种由上述重组的菌株高产surfactin的发酵工艺，并就表面活性素对水稻主要病害(纹枯病、白叶枯病)的防效进行了盆栽试验评估。本发明为枯草芽胞杆菌工业化生产获得高产表面活性素和表面活性素的现实应用提供技术支撑和理论指导。
[0007]
本发明目的通过如下技术方案实现：
[0008]
1.在b9δdegu菌株基础上，通过突变bmya基因获得单产表面活性素的改良菌株，其特征在于：
[0009]
以枯草芽胞杆菌bs916基因组为模板，分别用引物bmya
‑
f/r扩增bmya基因序列(片段长度约2200bp)，并将该片段进行t/a克隆，构建中间载体pmd
‑
bmya。以质粒pt
‑
km为模板，用引物km(bmy)
‑
f/r扩增km基因序列(片段长度约1400bp)；将km基因片段插入psti和ecori酶切的中间载体，最终构建突变载体pt
‑
bmyakm。采用化学转化法，将构建好的突变载体pt
‑
bmyakm转化入枯草芽胞杆菌bs916和b9δdegu中，经过km抗生素筛选，获得转化子，提取转化子基因组，pcr验证转化子，即为b9δdeguδbmya(b9bd)，将正确转化子于
‑
70℃甘油保藏。
[0010]
所述突变degu和bmya基因的枯草芽胞杆菌菌株b9δdegubmya可以在生产脂肽类抗生素surfactin中应用。
[0011]
2.上述重组的菌株b9δdegubmya高产表面活性素的发酵工艺。
[0012]
通过plackett
‑
burman试验设计、中心组合试验设计(ccd)和响应曲面法，优化了b9δdegubmya菌株高产脂肽类抗生素surfactin的发酵培养基成分。结果表明：b9δdegubmya菌株高产脂肽类抗生素surfactin的最佳培养基为：葡萄糖24.27g/l，黄豆粉29.05g/l，牛肉浸膏3g/l，nh4no34g/l，l
‑
亮氨酸2.36g/l，kh2po43g/l，nacl 3g/l，feso40.02g/l，基于最佳摇瓶发酵培养基，b9δdegubmya产生的脂肽类抗生素surfactin产量达934.25mg/l，是其在lb培养基中产量的5.6倍。
[0013]
3.表面活性素对水稻纹枯病菌和白叶枯病菌的室内毒力测定。
[0014]
按照农药室内生物活性测定准则：杀菌剂抑制病原真菌菌丝生长试验(平皿法)和杀菌剂抑制细菌生长量试验(浑浊度法)分别就surfactin对水稻纹枯病菌和白叶枯病菌进行了室内生物活性测定，结果显示：surfactin对水稻纹枯病菌的抑制毒理方程为y＝
2.5235 1.9112x，其ec
50
为19.76μg/ml；surfactin对水稻白叶枯病菌的抑制毒理方程为y＝2.2098 2.2921x，其ec
50
为16.49μg/ml。
[0015]
4.表面活性素对水稻纹枯病和白叶枯病的盆栽防效评估。
[0016]
通过盆栽试验，分别对表面活性素对纹枯病和白叶枯病的防效进行了评估，结果显示，100μg/ml的surfactin溶液对水稻纹枯病的“病斑比”平均防效为55.67％；100μg/ml的surfactin溶液对白叶枯病斑的扩展防治效果达64.21％。
[0017]
本发明所用的枯草芽胞杆菌bs916是被我国农业部列为可在农业领域广泛应用的安全菌株，其产生的抗菌脂肽surfactin属于微生物天然脂肽类抗生素，对人类健康和食品安全性高，可用于生物防治，食品加工、农产品贮藏保鲜和石油开采等，以菌株bs916为活性成分的生物农药“纹曲宁”已经在2002年开始进入市场销售。
[0018]
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
附图说明
[0019]
图1 bmya基因突变体的构建流程图
[0020]
图2菌株b9δdegubmya产surfactin排油活性检测
[0021]
图3菌株b9δdegubmya产surfactin发酵工艺响应曲面优化交互三维图
[0022]
图4表面活性素抑制水稻纹枯病生物活性测定(ec
50
)
[0023]
实施例1 芽胞杆菌单产表面活性素菌株b9δdeguδbmya(b9bd)的构建
[0024]
以枯草芽胞杆菌bs916基因组为模板，分别用引物bmya
‑
f/r扩增bmya基因序列(片段长度约2200bp)，采用taq dna聚合酶mix(擎科生物技术有限公司)，pcr程序为：95℃2min；30
×
(95℃20s；58℃30s；72℃1min；72℃5min。扩增片段经过切胶回收后，将该片段进行t/a克隆，构建中间载体pmd
‑
bmya，保存备用。
[0025]
以质粒pt
‑
km为模板，用引物km(bmy)
‑
f/r扩增km基因序列(片段长度约1400bp)；采用taq dna聚合酶mix(擎科生物技术有限公司)，pcr程序为：95℃2min；30
×
(95℃20s；62℃30s；72℃1min；72℃5min。将km基因片段插入psti和ecori酶切的中间载体，最终构建突变载体pt
‑
bmyakm，保存备用。
[0026]
采用化学转化法，将构建好的突变载体pt
‑
bmyakm转化入枯草芽胞杆菌bs916和b9δdegu中，经过km抗生素筛选，获得转化子，提取转化子基因组，pcr验证转化子，即为b9δdeguδbmya(b9bd)，将正确转化子于
‑
70℃甘油保藏。
[0027]
转化方法参考以下文献进行(elsorra e.idris，domingo j.iglesias，manuel talon，and rainer borriss.tryptophan
‑
dependent production of indole
‑3‑
acetic acid(iaa)affects level of plant growth promotion by bacillus amyloliquefaciens fzb42[j].molecular plant microbe interactions.2007，20(6)：619
‑
626.)。
[0028]
表1 bmya和km序列目的片段扩增引物
[0029][0030]
实施例2 突变菌株b9δdeguδbmya(b9bd)产surfactin的排油活性检测。
[0031]
活化芽胞杆菌野生株bs916、突变株b9δdegu、b9δbmya和b9δdeguδbmya(b9bd)，用无菌牙签分别挑取单菌落至20ml lb液体培养基中30℃、200r/min培养12
‑
15h，制备种子液，按照1％接种量将种子液接入含有100ml lb培养液的500ml摇瓶中，30℃，180rpm培养48h，菌液6000r/min离心10min后，获得发酵上清液。依据surfactin具有强的排油活性特点，取5μl进行排油活性检测，具体步骤如下：将9cm培养皿，加入2/3体积蒸馏水，取800
‑
1000μl的染色石蜡油滴于表面，待石蜡油在水表均匀散开，分别取适量(5μl)芽胞杆菌培养菌液滴在平板中央，待形成排油圈后，测量排油直径(mm)。实验结果显示：野生株bs916的排油圈直径为36.30
±
1.70mm，而突变体b9δdeguδbmya(b9bd)的排油圈直径为62.70
±
2.05mm，依据排油圈面积估算，突变体所产surfactin的排油活性是野生型的2.92倍。
[0032]
实施例3 突变菌株b9δdeguδbmya(b9bd)高产surfactin的发酵培养基优化。
[0033]
试验材料及方法：枯草芽胞杆菌突变体b9δdeguδbmya(b9bd)的常规活化和发酵种子液的制备都采用lb培养基(胰蛋白胨10.0g/l，酵母粉5.0g/l，nacl 10.0g/l)。取
‑
70℃冰箱保存的b9δdeguδbmya(b9bd)菌种于lb平板活化，28℃静置培养24h后，挑取单胞接种于含有20ml lb液体的100ml三角瓶中，30℃、180r
·
min
‑1振荡培养12h，即为发酵种子液。枯草芽胞杆菌突变体b9δdeguδbmya(b9bd)发酵产surfactin的能力采用色谱法检测方法。
[0034]
高效液相色谱检测(hplc)采用c
18
柱(sephasil peptide c18 5μm st 4.6/250)；流动相a为乙腈(0.1％三氟乙酸)，流动相b为水(0.1％三氟乙酸)；采用梯度检测方法：0
‑
25min，60％a和40％b；25
‑
35min，70％a和30％b；35
‑
60min，93％a和7％b；流速为0.8ml
·
min
‑1，进样量为10μl，紫外检测波长为210nm，柱温为30℃。从sigma公司购买surfactin标准样品，配制不同浓度的surfactin甲醇标准溶液，用hplc进行检测分析。根据分析结果判断surfactin的存在和产量。
[0035]
发酵培养基组分plackett
‑
burman试验：(1)培养基成分的筛选在含100ml培养基的500ml三角瓶中，接种1％的种子液，于30℃、180r
·
min
‑1培养，36h后，分别测定发酵液的surfactin含量，采用design
‑
expert软件进行plackett
‑
burman摇瓶发酵试验设计筛选合适的培养基成分。plackett
‑
burman设计如下：(a)葡萄糖10～20g/l，(b)黄豆粉10～20g/l，(c)牛肉浸膏1～3g/l，(d)nh4no31～4g/l，(e)l
‑
亮氨酸0.5～2g/l，(f)kh2po41～3g/l，(g)nacl 1～3g/l，(h)mgso40～0.02g/l，(j)mnso40～0.05g/l，(k)feso40.02～0.1g/l。试验中每因素取2水平：即高水平“1”(范围区间最大值)和低水平
“‑
1”(范围区间最小值)，每组试验3次重复。
[0036]
培养基关键因子中心组合试验(ccd)：根据培养基成分的plackett
‑
burman试验结果，综合选出3个对发酵液排油活性产生显著影响的培养基成分关键因素(葡萄糖、黄豆粉和l
‑
亮氨酸)，并确定中心点数值。然后利用中心组合试验进行3因素试验，根据其设计原
理，分别按照轴向点α值为1.68179，角点值为1，设计5水平试验，共设20组，每组3个重复。
[0037]
表2关键培养基成分中心组合实验设计各因素水平
[0038][0039]
数据分析：plackett
‑
burman试验、中心组合试验及响应曲面分析均利用design
‑
expert软件进行设计和分析。
[0040]
实验结果显示：
[0041]
plackett
‑
burman筛选培养基关键因素：对培养基成分的10因素2水平的plackett
‑
burman试验数据进行回归分析，所得主要因子回归方程为：y＝331.64 159.56a 53.58b 44.43c 19.42d 76.25e 16.93f 15.24g
‑
34.10h
‑
4.09j
‑
14.23k，校正系数r2＝0.9992，公式中：y为surfactin产量的预测值。由校正系数可知y的变化中99.92％能被回归方程解释。design
‑
expert对回归模型的方差分析显示(表3)：首先，回归模型是显著的(p＝0.0472)；此外，葡萄糖、黄豆粉和l
‑
亮氨酸对菌株产surfactin有显著性影响(p＜0.05)。
[0042]
表3培养基成分的plackett
‑
burman试验设计方差分析
[0043][0044]
*表示该因子在0.05水平差异显著。
[0045]
培养基关键因素中心组合设计试验及响应曲面分析：根据pb试验结果，获得培养基成分的3个关键因素(葡萄糖、黄豆粉和l
‑
亮氨酸)，然后进行3因素5水平的中心组合设计，进一步优化影响b9δdeguδbmya(b9bd)摇瓶发酵产表面活性素的培养基成分最优组合。对中心组合试验数据进行回归分析，获得主要因子回归方程为：y＝864.91
‑
18.64a 34.95b 14.59c
‑
3.91ab
‑
4.69ac 49.78bc
‑
98.20a2‑
48.46b2‑
40.48c2，校正系数r2＝0.9312，公式中：y为surfactin产量的预测值。回归方程的方差分析显示(表4)，模型的p值小于0.0001，表明该模型正确，该菌株发酵产生的surfactin的产量实际测定值与方程预测
值存在显著相关性。该模型变异系数cv为3.80％，小于10％，属于弱变异，这进一步表明试验数据的可靠性。缺失拟合项值为2.24，该回归方程的失拟不显著(p＞0.05)，说明所建立的回归方程拟合度高。以上结果表明该模型可以用于预测surfactin产量。
[0046]
表4培养基关键因素中心组合试验(ccd)回归方程方差分析
[0047][0048]
*表示该模型在0.05水平差异显著。
[0049]
图3为葡萄糖、黄豆粉和l
‑
亮氨酸对b9δdeguδbmya(b9bd)菌株surfactin产量影响的响应曲面三维图。附图3a、b和c都有凸起的最高点，可以确定3个变量的优化值范围。根据前面得到的ccd回归方程求得3个因素的最优值，分别为：葡萄糖24.27g/l，黄豆粉29.05g/l，l
‑
亮氨酸2.36g/l，在此条件下，脂肽类抗生素表面活性素产量预测值可达最高。基于此，我们得到最佳发酵培养基为：葡萄糖24.27g/l，黄豆粉29.05g/l，牛肉浸膏3g/l，nh4no34g/l，l
‑
亮氨酸2.36g/l，kh2po43g/l，nacl 3g/l，feso40.02g/l。
[0050]
发酵优化工艺的验验证：基于筛选的最优发酵培养基配方进行摇瓶发酵培养实验(30℃、180rpm、36h、装液量50ml/250ml摇瓶、1％接种量)，菌株b9δdeguδbmya(b9bd)发酵产生的表面活性素产量达934.25mg/l，是其在lb培养基中产量的5.6倍。
[0051]
实施例4 表面活性素对水稻纹枯病菌和白叶枯病菌的室内毒力测定
[0052]
把surfactin样品加入到pda培养基中，配制成质量浓度为5、10、20和40μg/l四个浓度梯度的含药培养基。采用菌丝生长速率法进行室内毒力测定。将培养好的水稻纹枯病菌，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘打孔，用无菌牙签将菌块接种到含药培养基平板中央，每个平板放置一个菌块，菌丝面朝下，在28℃的恒温培养箱中培养36h后，采用十字交叉法测量菌落直径，计算各处理的菌丝生长抑制率。每处理重复3次，以清水处理作为对照。用dps数据处理软件进行数据分析，得到毒力回归方程和抑制中浓度。菌丝生长抑制率＝(对照菌落生长直径
‑
处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径
×
100％。
[0053]
把surfactin样品加入到nb液体培养基中，配制成质量浓度为5、10、20和40μg/l四个浓度梯度的含药培养基。采用浊度法进行室内毒力测定。将od
600
＝1.0的水稻白叶枯病菌
菌液以1％的接种量接种到培养基中，28℃、130rpm培养48h，用浊度仪测量浊度值。每处理重复3次，以清水处理作为对照。用dps数据处理软件进行数据分析，得到毒力回归方程和抑制中浓度。抑制率＝[(对照浊度值
‑
初始浊度值)
‑
(处理浊度值
‑
初始浊度值)/(对照浊度值
‑
初始浊度值)
×
100％。
[0054]
试验结果表明：surfactin对水稻纹枯病菌有一定抑制作用，毒力回归方程为y＝2.5235 1.9112x，相关系数r＝0.9698，ec
50
值为19.76μg/ml。surfactin对水稻白叶枯病菌有一定抑制作用，毒力回归方程为y＝2.2098 2.2921x，相关系数r＝0.9878，ec
50
值为16.49μg/ml。
[0055]
实施例5 表面活性素对水稻纹枯病的盆栽防效评估
[0056]
用超纯水配制质量浓度分别为20、50和100μg/ml的surfactin溶液各300ml，ph＝7.5，本试验按照随机区组设计，分为清水对照(ck)、surfactin20、surfactin50和surfactin100共4个处理，每处理3次重复，每重复中平均有40株水稻苗。在水稻拔节期接种水稻纹枯病菌，接种后出现零星病斑时，采用surfactin溶液进行均匀喷雾处理，间隔7d后再施药一次。
[0057]
病害调查：第2次施药7d后调查发病情况，调查水稻发病株数，如有病斑，则要调查病斑长度和植株高度(每个重复调查15个病斑)，计算发病率和病斑比，最终计算防治效果。
[0058]
发病率(％)＝发病株数/调查总株数
×
100％
[0059]
病斑比(％)＝病斑长度/株高
×
100％
[0060]
防治效果(％)＝[(空白对照区病斑比
‑
药剂处理区病斑比)/空白对照区病斑比]
×
100％
[0061]
数据处理：所有数据均采用dps软件分析处理。
[0062]
在盆栽药效试验中，surfactin按照有效浓度20、50和100μg/ml三个浓度防治水稻纹枯病的调查结果显示：surfactin三个浓度对水稻纹枯病病斑比的平均防效分别为28.87％、42.35％和55.67％，方差分析表明，surfactin三个浓度之间病斑比的防效差异极显著。
[0063]
表5 surfactin溶液对水稻纹枯病病斑比的盆栽防治效果
[0064][0065]
注：表中同列英文字母不同表示差异显著，显著性测定采用邓肯氏新复极差法。
[0066]
实施例6表面活性素对水稻白叶枯病的盆栽防效评估
[0067]
用超纯水配制质量浓度分别为20、50和100μg/ml的surfactin溶液各300ml，ph＝7.5；。本试验按照随机区组设计，分为清水对照(ck)、surfactin20、surfactin50和surfactin100共4个处理，每处理3次重复，每重复中平均有40株水稻苗。采用剪叶法接种水稻白叶枯病菌，接种后立刻用surfactin溶液进行均匀喷雾处理，间隔再施药一次。
[0068]
病害调查：第2次施药7d后调查发病情况，测量水稻白叶枯病病斑长度(每个重复调查15个病斑长度)，计算病斑抑制效果。
[0069]
防治效果(％)＝[(对照区平均病斑长度
‑
处理区平均病斑长度)/对照区平均病斑长度]
×
100％
[0070]
在盆栽药效试验中，surfactin按照有效浓度20、50和100μg/ml三个浓度防治水稻白叶枯病，结果显示：surfactin三个浓度对水稻白叶枯病斑的抑制效果分别为38.71％、52.53％和64
‑
21％，方差分析表明，surfactin三个浓度之间的防效差异极显著。
[0071]
表6 surfactin溶液对水稻白叶枯病的盆栽防治效果
[0072][0073]
注：表中同列英文字母不同表示差异显著，显著性测定采用邓肯氏新复极差法。