一株具有高效尼古丁降解能力的窄食单胞菌ND16及其应用的制作方法

一株具有高效尼古丁降解能力的窄食单胞菌nd16及其应用
技术领域
1.本发明属于农业微生物技术领域，涉及一株具有高效尼古丁降解能力的窄食单胞菌nd16及其应用，该菌株鉴定为膝状窄食单胞菌(stenotrophomonas geniculate)，具备高效尼古丁降解能力，可以有效降低烟草生物有机肥中的尼古丁含量，达到安全使用标准。


背景技术：

2.尼古丁，俗称烟碱，广泛存在于茄科植物中，也是烟草中的主要生物碱，约占其生物碱总量的95％。尼古丁化学分子式为c
10
h
14
n2，相对分子质量大小为162.23。尼古丁由吡啶环和吡咯环构成，属于一种杂环化合物。根据吡啶环和吡咯环相对位置的不同，烟碱还可分为α
‑
烟碱、β
‑
烟碱和γ
‑
烟碱3种，其中β
‑
烟碱是烟碱在烟草体内的主要存在形式。烟碱是一种呈无色透明或淡黄色的油状液体，对人体有着较强的刺激性，具有良好的挥发性，有烟臭味。烟碱在空气中会被氧化，在光照条件下也会发生氧化分解，变成黄棕色。烟碱的密度为1.01g/cm3，与水的密度相似，熔点为
‑
79℃，沸点为247℃，具有潮解性，易溶于水和有机溶剂。
3.尼古丁会对人体健康造成巨大威胁。尼古丁有剧毒，若一次性吸入超过50mg尼古丁将会危及生命，若通过静脉注射，则只要2～3mg尼古丁就能致人死亡。吸入尼古丁还会导致一系列疾病，如各种心血管疾病、癌症和畸形等。若是孕妇吸入尼古丁，则会对胎儿的代谢系统、心血管等系统的发育造成严重伤害，增加婴儿猝死的风险。尼古丁会影响中枢神经系统，长期吸入尼古丁将会使人对其产生依赖性。尼古丁具有良好的水溶性，容易渗入土壤和水体，对土壤、河流、地下水等造成严重污染，还会对环境中的微生物群落结构产生影响。
4.在欧盟的相关规定中，每千克废弃物中尼古丁含量超过500mg就会被认定为有害废弃物。在我国，每年都会有大量的烟草废弃物产生，这些废弃物中的尼古丁含量远高于此标准。找到一种合适的烟草废弃物的处理方法，对保护环境和人体健康有着重要意义。
5.消除尼古丁的方法有物理法、化学法和生物法。相比物理法和化学法，利用微生物降解尼古丁的方法是一种环保低碳的生物方法，不仅成本低，操作简单，而且效果好，不易造成二次污染。利用微生物降解尼古丁受到关注，并有很多具有尼古丁降解能力的细菌被应用于尼古丁降解。
6.已知的尼古丁降解细菌主要为假单胞菌属(pseudomonas)、节杆菌属(arthrobacter)、农杆菌属(agrobacterium)、苍白杆菌属(ochrobactrum)、纤维单胞菌属(cellulomonas)、不动杆菌属(acinetobacter)、红球菌属(rhodococcus)、鞘氨醇单胞菌属(sphingomonas)、极小单胞菌属(pusillimonas)、申氏杆菌属(shinella)等。其中假单胞菌属的吡咯降解路径和节杆菌的吡啶降解路径，以及二者的混合路径最为清楚，一般产生绿色、蓝色、棕色等中间代谢产物。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一株具有高效尼古丁降解能力的窄食单胞菌，该菌株从湖
北省恩施州宣恩县植烟农田的烟草根际土壤中分离而来，所述菌株命名为stenotrophomonas geniculatend16，保藏编号为cctcc no：m 2021802。
8.本发明的第二个目的在于提供了窄食单胞菌nd16在尼古丁降解中的应用。
9.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
10.申请人从中国湖北省恩施州宣恩县植烟农田的烟草根际土壤中分离、筛选到一株具有高效尼古丁降解能力的细菌nd16，申请人将该菌鉴定为膝状窄食单胞菌(stenotrophomonas geniculate)，该菌株已于2021年6月29日送至中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，其保藏编号为cctcc no：m 2021802，分类命名：stenotrophomonas geniculate nd16，地址：中国武汉武汉大学。
11.该菌株的具体特征如下：
12.窄食单胞菌nd16在lb琼脂平板培养基上28℃培养48h，形成圆状的淡黄色小菌落，边缘光滑，隆起。
13.窄食单胞菌nd16在降解尼古丁中的应用，包括以窄食单胞菌nd16为有效成分或有效成分之一，制备成制剂，用于降解生物有机肥中的尼古丁。
14.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
15.(1)本发明首次公开了窄食单胞菌属的细菌，具有降解尼古丁作为其生长物质的能力，客观上降低环境中的尼古丁含量，是对尼古丁降解菌株资源的补充。
16.(2)本发明提供的窄食单胞菌对尼古丁的降解率高，在尼古丁为唯一碳源的培养基中，接种了窄食单胞菌nd16后，样品中尼古丁浓度不断下降。第0天到第3天，样品中的尼古丁浓度迅速下降，从1g/l下降到0.2g/l，尼古丁降解率达到80％。5天后，尼古丁基本被完全降解。在不同温度和尼古丁浓度下对菌株进行了尼古丁降解能力的测定，在28～37℃、尼古丁浓度0.5～2g/l条件下尼古丁降解率均在80％以上，有较好的应用潜力。
17.(3)本发明的窄食单胞菌nd16可在烟草生物有机肥中生长，具有高效降解尼古丁的能力，经12天的发酵，烟草有机肥中的尼古丁含量从1500mg/kg下降到449mg/kg，低于500mg/kg，有效降低了有机肥中的尼古丁含量，达到了安全标准。
18.(4)本发明的窄食单胞菌nd16在降解尼古丁的过程中不产生绿色、蓝色、棕色等中间代谢产物，预示着一个新的尼古丁代谢途径，为今后的尼古丁代谢研究打下基础。
附图说明
19.图1为窄食单胞菌nd16的尼古丁降解曲线；
20.图1中尼古丁初始浓度为1g/l，培养温度为28℃，培养转速为150r/min。
21.图2为窄食单胞菌nd16对烟草生物有机肥中尼古丁降解的效果图；
22.图2中烟草生物有机肥中尼古丁初始含量1500mg/kg，培养温度为28℃，静置培养；空白对照表示不加菌处理；nd16表示加窄食单胞菌nd16。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
24.实施例1：窄食单胞菌nd16的分离、鉴定
25.(1)样品采取：申请人于2020年7月从湖北省恩施州宣恩县植烟农田中采集烟草根际土壤。
26.(2)菌体分离纯化：称取5g采集自湖北恩施的烟草根际土壤样品，加入到95ml无菌生理盐水中，放置到28℃、150r/min条件下的摇床中振荡30min，充分混匀后静置1h，再在超净工作台中吸取1ml土壤混合液的上清液，加入到9ml无菌水中进行稀释，制成10
‑2溶液，充分混匀后，再取10
‑2溶液依次制成10
‑3、10
‑4、10
‑5溶液，吸取10
‑5稀释倍数的溶液0.2ml加到尼古丁为唯一碳源的固体培养基上，进行稀释涂布，置于28℃恒温培养箱中倒置培养，定期观察菌落生长状态。能够在尼古丁固体培养基上生长出来的菌落，说明其具有降解尼古丁的能力。将这些菌落逐一挑取，接种到新鲜尼古丁培养基上进行划线培养，再进一步分离纯化，得到单菌落。纯化后按50％甘油:菌液(体积比1:1)保存于螺口试管中，
‑
80℃保藏，进行后续实验。
27.尼古丁选择培养基(以尼古丁为唯一碳源)：(nh4)2so
4 2g/l，mgso4·
7h2o 0.2g/l，cacl2·
2h2o 0.01g/l，feso4·
7h2o 0.001g/l，na2hpo4·
12h2o 2.33g/l，nah2po4·
2h2o 0.55g/l。培养基121℃高压灭菌20min，待冷却至60℃以下时加入尼古丁，使最终尼古丁浓度为1g/l。
28.(3)高效尼古丁降解菌的筛选：将分离纯化培养后的尼古丁降解菌菌落挑取接种到5ml的lb培养基中，在摇床中28℃、150r/min的条件下过夜培养，培养后得到的菌液按1％的接种量接种到50ml的新鲜尼古丁液体培养基中，培养基的尼古丁浓度为1g/l，ph为7，在28℃、150r/min条件下培养，定期取样。取样后用0.05mol/l的hcl溶液对样品进行适当稀释，再用紫外分光光度计测定样品的尼古丁浓度，计算菌株的尼古丁降解率，筛选出高效尼古丁降解菌株。
29.(4)以尼古丁浓度(g/l)为纵坐标，时间为横坐标构建尼古丁降解曲线(图1)。
30.如图1所示，样品中尼古丁浓度不断下降。第0天到第3天，样品中的尼古丁浓度迅速下降，从1g/l下降到0.2g/l，尼古丁降解率达到80％。5天后，尼古丁基本被完全降解，尼古丁降解率为97％。
31.下表为按照步骤(3)的步骤，不同起始浓度下的尼古丁在不同时间内的降解率：
[0032][0033]
当尼古丁浓度为1.0g/l时，28℃和37℃降解情况接近。
[0034]
(5)高效尼古丁降解菌的分类鉴定：对获得的菌株进行16s rrna基因测序和全基
因组测序并构建其系统发育树，结合其生理生化特征，申请人鉴定该菌属于窄食单胞菌属，该菌株已于2021年6月29日送往中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，分类命名：stenotrophomonas geniculate nd16，保藏号为cctcc no：m 2021802，地址：中国武汉武汉大学。
[0035]
该菌株的具体特征如下：
[0036]
窄食单胞菌nd16在尼古丁平板培养基上28℃培养72h，形成圆状的乳白色小菌落，边缘光滑，隆起。
[0037]
实施例2：
[0038]
窄食单胞菌nd16在烟草生物有机肥中尼古丁降解图
[0039]
具体步骤如下所述：
[0040]
(1)用lb液体培养基在28℃，150r/min条件下过夜培养窄食单胞菌nd16，得到适量菌液。将尼古丁降解菌nd16接种到烟草生物有机肥基质中，分2组，1组接种nd16，另一组为不加菌的空白对照组，每组做3个平行实验。
[0041]
菌液接种量为10％，对照组加入等量的空白培养基，放置到28℃恒温培养箱中静置培养，培养12天，定期取样。取样后将样品分为2份，一份样品称重记录后放置到70℃烘箱中烘干，烘干至恒重后再次称重记录，根据烘干前后样品重量的变化计算样品的含水量；另一份样品用来提取尼古丁，测定尼古丁浓度。根据鲜重样品中的尼古丁含量和相应样品中的含水量计算干重样品中的尼古丁含量。
[0042]
(2)提取尼古丁：称取1g烟草有机肥样品，加入2ml 1mol/l的氢氧化钠溶液，将样品ph调至碱性，再加入3ml无水乙醇，充分混合后在50℃条件下静置30min，再进行超声处理30min，使用0.22μm的滤膜过滤后得到尼古丁提取液。
[0043]
(3)尼古丁浓度的检测：使用岛津lc
‑
20at高效液相色谱仪测定尼古丁浓度。流动相分为水相和有机相，水相为纯水，用硫酸调节ph到2.5左右，有机相为色谱纯甲醇，有机相和水相配比为10:90。测定波长为259nm；色谱柱为c18；柱温30℃；流速设为1ml/min；进样量为10μl。测定时将尼古丁提取液用0.22μm滤膜过滤后再进样检测。
[0044]
(4)以测得尼古丁含量(mg/g)为纵坐标，时间为横坐标构建尼古丁降解图(图2)。
[0045]
(5)如图2所示，烟草生物有机肥中的初始尼古丁含量约为1.5mg/g，培养12天后，各组有机肥中的尼古丁含量均有下降。nd16菌组培养12天后，有机肥中尼古丁含量为0.45mg/g，降解率为69％；空白对照组在培养12天后，有机肥中尼古丁含量降为0.9mg/g，降解率为37％。该结果表明，在不加尼古丁降解菌的情况下，烟草有机肥中的尼古丁含量也会有所下降，这是因为烟草生物有机肥中所含的微生物对尼古丁产生了降解，但降解速度较慢。在加菌条件下，烟草有机肥中的尼古丁降解速度加快，表现出了明显的促进尼古丁降解的作用，使有机肥中的尼古丁含量降到了449mg/kg，低于500mg/kg的安全阈值，达到了安全使用标准。
[0046]
实施例3：窄食单胞菌nd16降解尼古丁的代谢路径分析
[0047]
使用尼古丁培养基在28℃条件下培养窄食单胞菌nd16，既没有吡啶途径会有的蓝色，也没有吡咯途径会出现的绿色，与大多数尼古丁降解菌的颜色变化都不同，预示其具备某种新的尼古丁降解途径。