一种用于检测新冠病毒N蛋白的双抗体夹心ELISA试剂盒的制作方法

一种用于检测新冠病毒n蛋白的双抗体夹心elisa试剂盒
1.说明书
技术领域
2.本发明涉及新冠病毒的检测及诊断领域。更具体地，本发明涉及一种可以用于新冠病毒检测的双抗体夹心elisa方法，在新型冠状病毒感染的筛查，检测和预后评价中具有重要应用价值。


背景技术：

3.新冠病毒(sars
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cov
‑
2)与引起中东呼吸综合征mers病毒和严重急性呼吸综合征sars病毒同属于冠状病毒的大家族。sars
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cov
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2有一个大小为30kb的正义、单链rna基因组。它的核衣壳蛋白(n)是由膜蛋白(m)、包膜蛋白(e) 以及刺突蛋白(s)组成的外膜，包裹着病毒的基因组。n蛋白是由两个结构域组成的磷酸化蛋白，可与病毒rna结合，参与rna合成和蛋白翻译，是病毒复制过程表达拷贝最多的结构蛋白，它性质稳定的特点决定了其作为病毒抗原检测的独特优势。
4.截至目前，国家药品监督管理局共批准新冠病毒检测试剂15个，其中核酸检测试剂10个，抗体检测试剂5个，没有批准病毒抗原的相关检测。核酸检测是病原物检测的金标准，该方法对实验室条件、检测人员、仪器要求较高，且呈现出特异性较强，灵敏度偏弱的特点，对感染病例检测的准确度只有30％
‑
50％。抗体检测试剂是检测血清中由病毒进入人体后刺激人体产生的igm或igg抗体，igm抗体出现较早，igg抗体出现较晚，该方法可以作为核酸检测的有效补充。对于新冠病毒核酸检测阴性的疑似病例，可以采用抗体检测作为补充检测指标。对于新冠病毒核酸检测的疑似病例，也可以用抗体检测来协同使用。
5.相较于核酸检测，抗原检测方便、快速和低价等优势，而相较于抗体检测，抗原检测无窗口期，可对刚出现感染症状的患者进行及时检测。对于这种传染性很强的新冠病毒感染，提高检测便利程度和敏感度格外重要，而抗原检测具有目前抗体检测所不能替代的优势，预期冠状病毒感染和防治的态势将会是长期的，高敏感检测方法需求强烈，高亲和力的配对抗体在抗原检测产品开发中尤为重要。新冠病毒的n蛋白长度为422个氨基酸，由序列比对可知，该蛋白与sars冠状病毒株号为gd01的n蛋白序列(genbank id为aap51234)一致性达到了90.5％，通常制备的抗体难以将二者进行区分，这增加了抗体制备的难度。双抗体夹心elisa 方法无论是采用传统的双抗体酶联吸附免疫法、酶促化学免疫发光法或免疫胶体金试纸条法，都需要通过特异的抗体完成检测。


技术实现要素：

6.本发明的第一个目的是提供一对可配对的特异性识别sars
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cov
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2病毒n蛋白而不识别sars病毒n蛋白的单克隆抗体对。
7.本发明的另一个目的是提供上述特异性抗体对的制备及筛选方法。
8.本发明的再一个目的是提供一种检测sars
‑
cov
‑
2病毒n蛋白的双抗体夹心 elisa
方法及试剂盒。
9.在本发明的第一方面，提供了一对单克隆抗体，分别为包被抗体和检测抗体包被抗体组成为包括：
10.(a)轻链可变区
11.(i)包含seq id no：01所示氨基酸序列的cdr
‑
h1区。
12.(ii)包含seq id no：02所示氨基酸序列的cdr
‑
h2区。
13.(iii)包含seq id no：03所示氨基酸序列的cdr
‑
h3区。
14.(b)重链可变区
15.(i)包含seq id no：04所示氨基酸序列的cdr
‑
l1区。
16.(ii)包含seq id no：05所示氨基酸序列的cdr
‑
l2区。
17.(iii)包含seq id no：06所示氨基酸序列的cdr
‑
l3区。
18.检测抗体组成为包括：
19.(a)轻链可变区
20.(i)包含seq id no：07所示氨基酸序列的cdr
‑
h1区。
21.(ii)包含seq id no：08所示氨基酸序列的cdr
‑
h2区。
22.(iii)包含seq id no：09所示氨基酸序列的cdr
‑
h3区。
23.(b)重链可变区
24.(i)包含seq id no：10所示氨基酸序列的cdr
‑
l1区。
25.(ii)包含seq id no：11所示氨基酸序列的cdr
‑
l2区。
26.(iii)包含seq id no：12所示氨基酸序列的cdr
‑
l3区。
27.在本发明的第二方面，提供了一对可以用于新冠病毒检测的双抗体夹心elisa 方法的可配对的单克隆抗体对，配对抗体是由如下方法制备筛选获得的：
28.免疫原制备:真核表达及原核表达n蛋白，纯化后60℃处理30分钟，与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂混合，制备免疫原，交叉免疫小鼠；
29.阳性杂交瘤细胞制备:取免疫鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，以真核表达且热处理后sars
‑
cov
‑
2病毒n蛋白为阳性抗原正筛选，真核表达且经过热处理的sars病毒n蛋白为阴性抗原负筛选间接elisa筛选得阳性杂交瘤细胞；
30.单克隆抗体:阳性杂交瘤细胞亚克隆建株，腹水制备、纯化，即得22株单克隆抗体，对所述22株单克隆抗体进行hrp标记和生物素标记；
31.夹心抗体配对:对所述22株单克隆抗体进行包被抗体与酶标抗体配对，即得适用于检测新冠病毒的双抗夹心elisa方法的包被抗体、酶标抗体。
32.在本发明的第三方面，提供一种基于所述单克隆抗体对的用于检测新冠病毒的双抗夹心elisa方法的建立包括:
33.所述配对的包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度、最适包被条件最适封闭剂、最适封闭条件、酶标二抗稀释液组分、酶标抗体最适作用时间、底物作用时间及双抗夹心elisa方法临界值的确定，选取最适参数的组合，即可。
34.优选地，包被抗体为64360a#4:27，包被浓度为5μg/ml
‑
1μg/ml，最适包被浓度为 1μg/ml。
35.优选地，检测抗体64360a#5:42为经过辣根过氧化物酶或生物素标记的，辣根过氧
化物酶(hrp)标记后的稀释比例为1:5000至1:20000，优选1:10000稀释，生物素标记后的稀释比例为1:5000至1:20000，优选1:5000稀释。
36.优选地，elisa试剂盒最低检测限为100pg/ml。
37.解决技术问题所采用的技术手段
38.本发明通过大规模的细胞融合和筛选得到一对分泌抗sars
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cov
‑2‑
n抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤:
39.1)按照公布的sars
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cov
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2病毒n蛋白编码序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择n蛋白全长区域用于重组表达，为促进重组蛋白的可溶表达，利用真核细胞进行分泌表达，在其c端融合有组氨酸标签便于纯化，经基因合成后克隆进表达质粒载体pcdna3.4，转染 expi293细胞进行培养，从培养基上清中分离和纯化表达产物用作免疫原和抗体筛选。
40.2)从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的b细胞，按常规方法，将b细胞与骨髓瘤细胞sp2/0株融合，然后利用常规的融合细胞hat筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆。
41.3)用于特异性识别sars
‑
cov
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2的n蛋白的抗体制备和筛选：2003年发生的sars 病毒引发的非典型性肺炎(俗称“非典”)与2019年底发生的sars
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cov
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2感染引起的新型冠状病毒感染的肺炎(俗称“新冠”)的病原物在核酸序列和主要结构蛋白序列组成上都具有高度相似性，这增加了研制可鉴别二种病毒蛋白抗体的研发困难，在附图1的蛋白质序列比对结果中，genbank编号为mn908947.3的是由sars
‑
cov
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2病毒基因组序列推导的n蛋白氨基酸序列，长度为422个氨基酸， genbank编号为ay278489.2的是sars
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cov病毒基因组序列推导的n蛋白氨基酸序列，二者序列一致性为90.5％，仅有少量散在的差异氨基酸，且连续差异氨基酸的长度在两个之内，按照抗原表位长度是4
‑
7个氨基酸的一般规律，要获得可鉴别两种蛋白的抗体存在制备困难。同时，n蛋白本身是一个富含磷酸化修饰的蛋白，在实际检测前需要对血液或咽拭子样本进行热灭活，蛋白也会经历结构改变、部分基团修饰改变，本发明利用真核表达n蛋白获得与天然样本相似的磷酸化和糖基化修饰，并且经加热处理取得和样本处理同样的加工过程，使之更接近实际检测蛋白的状态，以此经处理的蛋白进行免疫和筛选，获得了高亲和力、高特异性和可识别热处理n蛋白的优质抗体。
42.本发明从上述杂交瘤细胞株制备了单克隆抗体，所述制备方法有以下两种:
43.1)在体外用无血清培养基培养杂交瘤细胞，收获培养上清经免疫亲和层析法分离纯化所需单克隆抗体。
44.2)在动物腹腔内接种杂交瘤细胞，收获动物腹水后分离纯化所需单克隆抗体。本发明用腹水法制备的抗体经protein a/g柱亲和层析纯化得到的n单抗。
45.本发明的优点及有益效果
46.本发明用于elisa检测的抗体对，均能特异性识别sars
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cov
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2病毒n蛋白，而不识别2003年发生的sars病毒的n蛋白，具有很高的特异性，可以区分两种病毒蛋白，按照序列同源性比较，也可以区分2004年
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2005年发生的新型人类冠状病毒 hcov
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hku1和2012年引起中东呼吸综合症(middle east respiratory syndromecoronavirus)的mers
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cov的冠状病毒。另一方面，elisa试剂盒的标准抗原为经过60℃热灭活的sars
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cov
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2病毒n蛋白，能用于sars
‑
cov
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2引起的新冠肺炎的筛查和检测。
附图说明:
47.图1：sars
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cov
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2和sars
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cov病毒n蛋白序列比较
48.genbank编号为mn908947.3的是由sars
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cov
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2病毒基因组序列推导的n蛋白氨基酸序列，genbank编号为ay278489.2的是sars
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cov病毒基因组序列推导的n蛋白氨基酸序列，二者序列一致性为90.5％。
49.图2：在expi293细胞中进行无血清培养和纯化的sars
‑
cov
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2病毒n重组蛋白图中m为分子量标记，1为培养基上清原样，2为培养基上清上样流穿，3和4分别是15mm咪唑洗脱产物，5
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6是60mm咪唑洗脱产物，表达产物的大小约为 56kda，使用12％sds
‑
page凝胶分离。
50.图3：双抗体夹心elisa检测sars
‑
cov
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2病毒n蛋白
具体实施方式
51.下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。
52.实施例1重组sars
‑
cov
‑
2病毒n蛋白免疫原制备
53.参照genbank中编号为mn908947.3的新型冠状病毒基因组序列中编码n蛋白的核苷酸序列合成完整的开放读码框区域，并将其克隆到质粒载体puc57之上(南京金斯瑞生物科技有限公司)，设计上游引物n
‑
cov
‑
nf:5
’‑ꢀ
ggatcgaattcgatgtctgataatg
‑3’
和下游引物 n
‑
cov
‑
nr:5
’‑
acgctcgagttagtggtggtggtggtggtgggcctgagttgag tcagc
‑3’
，通过上游引物引入ecori切点，通过下游引物引入组氨酸纯化标签和 xhoi酶切位点，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。依照标准的核酸扩增过程，从质粒载体上扩增目的基因，经ecori/xhoi双酶切并回收后克隆入经同样双酶切的真核表达载体pcdna3.4(购自invitrogen inc)线性化片段，经测序鉴定后进行质粒制备，参照expi293
tm expression system kit(赛默飞舍尔科技(中国)有限公司，货号a14635)说明书进行expi293细胞转染和培养，维持细胞活力在70％以上，培养120小时后进行纯化。因重组的n蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱亲和纯化。用不同浓度的咪唑溶液进行洗脱后，将各组分和流穿分别上样sds
‑
page分离检测，附图2为融合有组氨酸标签的重组n蛋白的表达和纯化结果。重组n蛋白的纯度在90％以上，浓度约为1
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1.5mg/ml，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。
54.实施例2杂交瘤细胞系的建立和抗体筛选
55.一.动物免疫
56.将实施例1中的重组n蛋白，60℃灭活后用弗氏完全佐剂(购自sigma公司)乳化，免疫4
‑
6周龄雌性balb/c小鼠六只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，依次编号为64360#a、64360#b、64360#c、64360#d、64360#e和64360#f。腹部皮下注射每只小鼠剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(sigma 公司)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接elisa(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水温匀，剂量为50μg/只。
57.二、细胞融合
58.无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(atcc)以5:1 比例混合，离心1500rpm，5min弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的peg1500(roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml 无血清的imdm(sigma
公司)，混匀，离心1000rpm，5min弃上清后，加入10ml血清(paa公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10
×
hat(sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃ 5％co2培养箱中培养。
59.三、阳性杂交瘤筛选及保存
60.融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃培养箱中培养，co2浓度为5％。
61.四、elisa筛选阳性杂交瘤细胞
62.在杂交瘤细胞培养3天后，细胞量大约占底面积2/3，加入200μl含饲养细胞和1％ ht(sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次elisa筛选，得到与免疫原间接elisa检测od值高于0.5的杂交瘤作为阳性克隆进行后续培养。这些阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和ht)的24孔板培养。五天后取100μl上请进行第三次elisa筛选。筛选过程如下，取100μl上清用60℃热灭活的真核表达 sars
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2病毒n蛋白(北京华大蛋白质研发中心有限公司，货号pt
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00117)和原核表达的sars病毒n蛋白(北京华大蛋白质研发中心有限公司，货号pt
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20304) 为包被抗原进行elisa方法的特异性筛选。筛选时以pbs缓冲液稀释抗原蛋白至 2μg/ml。每孔加入100μl抗原，4℃包被12小时，弃去溶液，洗涤液(含0.05％tween 的pbs缓冲液)洗板3次后控干，每孔再加300μl的2％(v/w)牛血清蛋白作为封闭液，37℃温育3h,重复洗板3次，加入待鉴定的细胞培养上清，孵育筛选后封闭结束在酶标板孔内加入待测样本，37℃温育1h,洗板3次，每孔加入1：5000倍稀释的 100μl hrp标记的羊抗小鼠抗体(购自)，37℃孵育1h后洗板3次，控干，每孔加入100μll tmb显色缓冲液，室温孵育8分钟后每孔加入50μl的h2so4(2m)终止反应，在酶标仪上读取450nm的吸光值。
63.六只小鼠经初步筛选获得可识别n蛋白的杂交瘤细胞260株，以64360#d的60个杂交瘤为例的筛选结果见表1，大多数杂交瘤细胞分泌的抗体可以同时识别两种不同的抗原，经过筛选得到22株只识别sars
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cov
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2病毒n蛋白，而不与sars病毒n蛋白结合，可作为后续双抗体夹心elisa方法的候选抗体。
64.表1编号为64360#d小鼠制备杂交瘤特异性筛选
65.66.实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体
67.取对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5
×
105,1ml悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心 4000rpm，10min小心吸出中间的腹水收集于离心管中用于纯化。抗体的纯化按照 hitrap rprotein a ff(购自ge公司，货号17
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5079
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02)产品的说明书进行。
68.实施例4单克隆抗体亚类鉴定及亲和力测定
69.亚类鉴定时，用100mm pbs(ph7.4)稀释包被羊抗鼠igg(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/m1，每孔加100μl，4℃过夜后倾空液体，用含0.05％tween的 pbs(pbs
‑
t)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％bsa和3％庶糖的pbs)，37℃孵育1h。倾空液体，用pbs
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t清洗3次。每孔加入100μl杂交瘤培养上清或纯化的抗体，37℃孵育1h后倾空液体，用pbs
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t清洗3次。用封闭液1:1000稀释hrp标记的羊抗鼠(κ，λ)抗体或1:2000稀释hrp标记的羊抗鼠(igm，igg1,igg2a,igg2b，igg3， iga)抗体(southern biotech公司)按照每孔100μl分别的体积分别加入待检抗体样品孔中，37℃孵育1h，倾空液体，用pbs
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t清洗3次。每孔加50μl含0.15％abts (southern biotech公司，货号0202
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1)和0.03％h2o2的柠檬酸缓冲液(ph4.0)显色， 10min内测定405nm波长的吸光度值。
70.二、亲和常数测定
71.按照2μg/m1的浓度包被重组n蛋白，100μ1/孔，4℃包被过夜，pbs
‑
t洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭，pbs
‑
t洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，pbs
‑
t洗3次。 hrp标记的羊抗鼠二抗1:20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，pbs
‑
t洗3次。每孔加入100μl含0.1％tmb(sigma公司)和0.03％h2o2的柠檬酸磷酸缓冲液显色 10min，加入50μl 0.5m的硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值，利用数据分析作图软件graphpad prism v8绘出抗体稀释浓度和od
450
对应曲线，计算亲和力。
72.实施例5双抗体夹心elisa方法的建立
73.5.1单克隆抗体与酶标单克隆抗体的配对
74.具体操作如下:
75.包被抗体:按1μg/ml浓度，100μl/孔包被纯化抗体，4℃孵育过夜；
76.封闭:1％bsa 200μl/孔，37℃封闭2h；
77.按100μl/孔加入梯度稀释的sars
‑
cov2
‑
n标准品蛋白(蛋白经过60℃热处理)，蛋白浓度依次为5ng/ml、0.5ng/ml和0.05ng/ml，37℃孵育2h后pbst冲洗数次: 按100μl/孔加入梯度稀释酶标抗体，37℃水浴作用1h后pbst洗涤三次，每次 5min；
78.按100μl/孔加入tmb显色液室温作用15min；
79.按50μl/孔加入2m硫酸终止反应，od450读值见表2，结果显示单克隆抗体 64360a#4:27和64360a#5:42配对效果最好。
80.表2部分抗体配对情况
64360a#4:27单克隆抗体作为捕获抗体，4℃包被12h后用洗涤液(pbs
‑
t)洗板3次，每孔再加300μl 2％(v/w)牛血清蛋白作为封闭液，37℃温育3h进行封闭，封闭结束后倾去液体，用洗涤液(pbs
‑
t)洗板3次，每孔内加入待测样本和依次为5ng/ml、 1.667ng/ml、0.556ng/ml、0.185ng/ml、0.062ng/ml、0.021ng/ml、0.007ng/ml 及0ng/ml浓度的重组n蛋白作为标准品，37℃孵育1h后倾去液体，洗涤3次，按100μl/ 孔加入预先制备的辣根过氧化物酶标记的64360a#5:42为检测抗体，37℃孵育1h，洗板6次，每孔加入100μl显色剂tmb溶液，室温孵育8min后按50μl/孔加入2m的 h2so4终止反应，读取od
450
值，依据标准曲线计算待检样本中的n蛋白浓度，由附图3的标准曲线结果显示本发明单克隆抗体制备的elisa检测试剂盒检出浓度为 100pg/ml。
88.实施例8抗体的可变区序列测定
89.培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集106以上杂交瘤细胞。trizol法提取杂交瘤细胞总rna，取9μl总rna，加入2.5μl oligo(dt)12
–
18primer(10mm)，及5μl dntps，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μl rt buffer(5x)，2.5μl dtt(0.1m)及1μl逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cdna保存在
‑
20℃。将获得的第一链cdna进行pcr扩增，在50μl反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列见表3
90.表3抗体可变区扩增引物
[0091][0092]
其余dntps及缓冲液均按照常规加入，最后加入cdna模板1μl和1u热启动taqdna聚合酶。设置pcr扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行25个循环扩增，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μl pcr产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离切胶回收，将所得重链可变区和轻链可变区分别克隆至pmd18t质粒载体(takara)后测序，得到的抗体重链可变区的 dna序列利用在线分析工具，分析其骨架区和抗原决定簇(cdr)序列和推导的氨基酸序列，此抗体可变区序列可以通过基因克隆的方式在其下游分别加入重链、轻链的恒定区，利用遗传重组方式获得可以重组表达抗体片段的表达载体在真核细胞中表达重组的完整抗体或片段，也可以将重链和轻链可变区利用一段链间连接肽 (如ggggsggggsggggs)的编码序列连接后构建为单链抗体在适宜的宿主细胞中表达抗体片段。