杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的CPA引物及试剂盒和检测方法与流程

技术特征：
1.一种cpa检测引物，其特征在于包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如下所示：靶点pvl剥离引物4s：5
’‑
gttgggatgttgaagcac
‑3’
(seq id no.1)靶点pvl剥离引物5a：5
’‑
tggataacactggcattt
‑3’
(seq id no.2)靶点pvl交叉引物2a1s：5
’‑
gtccagcatttaagttgcggaccatatggcagagat
‑3’
(seq id no.3)靶点pvl特异引物2a：5
’‑
gtccagcatttaagttgc
‑3’
(seq id no.4)靶点pvl特异引物3a：5
’‑
catttcattaccataag
‑3’
(seq id no.5)。2.一种针对杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的cpa检测引物。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：所述各cpa检测引物的浓度为10μm。4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于还包括如下组分：a、2
×
反应缓冲液：40.0mm的tris
‑
hcl，20.0mm的硫酸铵，20.0mm的氯化钾，16.0mm的硫酸镁，0.2％(v/v)的tween 20，1.4m的甜菜碱，10.0mm的dntps(each)；b、bst dna聚合酶；c、钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述bst dna聚合酶的浓度为8u/μl。6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述钙黄绿素和氯化锰的混合溶液，通过如下方法制备得到：(i)将钙黄绿素溶于二甲基亚砜中，配制50μm的钙黄绿素溶液；将氯化锰溶于水中，配制1mm的氯化锰水溶液；(ii)取25μl、50μm的钙黄绿素溶液与10μl、1mm的氯化锰水溶液混合均匀，得到钙黄绿素和氯化锰的混合溶液。7.一种针对杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的cpa检测方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取待检样品的细菌dna作为模板dna，并控制模板dna水溶液的od
260
/od
280
值为1.8～2.0；(2)建立检测pvl的交叉引物恒温扩增反应体系，于60～63℃水浴中保温至少60分钟进行交叉引物恒温扩增反应，待反应完成后于(80
±
2)℃水浴中保温2～3分钟终止反应；(3)针对靶点pvl的检测，终止反应后肉眼观察反应体系的颜色；待检样品为杀白细胞毒素阴性金黄色葡萄球菌或非金黄色葡萄球菌显示黄色；待检样品为杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌显示绿色。8.根据权利要求7所述的cpa检测方法，其特征在于：步骤(2)中，交叉引物恒温扩增反应体系为：2
×
反应缓冲液12.5μl，10μm的剥离引物4s和10μm的剥离引物5a各1.5μl，10μm的交叉引物2a1s 2.5μl，10μm的特异引物2a和10μm的特异引物3a各1.25μl，dna模板1.0μl，8u/μl的bst dna聚合酶1.0μl，加去核酸水补足至25μl；最后加入1μl的钙黄绿素与氯化锰的混合溶液。9.根据权利要求7所述的cpa检测方法，其特征在于：所述的步骤(3)是，终止反应后对
扩增产物做琼脂糖凝胶电泳，杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌呈现梯形条带，杀白细胞毒素阴性金黄色葡萄球菌或非金黄色葡萄球菌无扩增条带。

技术总结
本发明公开了一种杀白细胞毒素阳性金黄色葡萄球菌的CPA引物及其检测试剂盒和检测方法，针对靶点pvl设计的CPA引物包括剥离引物4s、5a，交叉扩增引物2a1s，以及特异引物2a、3a；其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1


技术研发人员：徐振波 刘子奇 骆玉婷 刘君彦 陈玲 叶燕锐 李晓玺 洪玮 彭芳 付欣 户帅锋 苏健裕
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：2021.07.23
技术公布日：2021/10/18