与芥菜型油菜多室性状相关的两室基因BjMc2和三室基因Bjmc2及其应用的制作方法

与芥菜型油菜多室性状相关的两室基因bjmc2和三室基因bjmc2及其应用
技术领域
1.本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及与芥菜型油菜多室性状相关的两室基因bjmc2和三室基因bjmc2及其应用。


背景技术：

2.油菜作为我国最重要的大宗油料作物，其菜籽油产量占我国食用植物油总产量的半壁江山。近年来，由于多室油菜的每角果粒数显著多于普通两室油菜，且已有几种自然变异多室油菜种质资源在不同的杂交组合后代中，多室单株产量均高于两室单株，所以越来越多研究者认为这一性状具有潜在的增产效益。
3.研究人员在对油菜种质资源的收集、整理，发现几种特殊角果性状的种质资源，通过仔细观察发现其角果具有多个角果皮和果室，并称其为多室油菜。通常，普通油菜的成熟角果只有2个角果皮，角果内1个“i”型假隔膜将角果心房分为2个果室，每个果室都有1排沿果皮内则融合与假隔膜的连接处着生的种子，称为两室油菜；两室角果是由2个心皮先天性融合成柱状结构的雌蕊发育而来，而多室角果是由多个心皮的雌蕊发育而成，雌蕊的心皮数目不同导致发育成熟角果内的假隔膜类型不同，常见有“y”型、“ii”型和“ ”型等，这些不同类型的假隔膜通常将角果分为3～4个果室，每个果室都含有1排以上种子。因此，多室油菜产量增加的主要原因是其每角果粒数要比普通两室油菜的显著增多。
4.以芥菜型三室油菜j163
‑
4和两室油菜j268
‑
2、j248
‑
2作为亲本，通过对正反交f1、f
1'
以及f2、bc1f1群体单株的表型统计，证实j163
‑
4的三室性状受2 对独立遗传的隐性核基因控制，并命名为bjmc1和bjmc2，其中控制三室性状的其中一个基因bjmc1已被成功克隆。现有技术虽然已将另一个基因bjmc2精细定位到一段共线于白菜a7 scaffold000019的946～1014kb区间之间，约68kb物理距离，然而现有技术并未成功克隆到控制三室性状的另一个基因bjmc2及其基因序列。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的空白，提供了一种与芥菜型油菜多室性状相关的两室基因bjmc2和三室基因bjmc2及其应用。
6.本发明的目的之一在于提供一种与芥菜型油菜多室性状相关的两室基因 bjmc2，所述两室基因bjmc2的启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述两室基因bjmc2的编码区的核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明的目的之二在于提供上述两室基因bjmc2编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
8.本发明的目的之三在于提供一种包含上述两室基因bjmc2的载体或遗传工程菌。
9.本发明的目的之四在于提供了所述两室基因bjmc2和/或包含上述两室基因 bjmc2的载体或遗传工程菌在制备两室油菜中的应用。
10.本发明的目的之五在于提供了所述两室基因bjmc2的等位基因，所述等位基因为三室基因bjmc2，所述三室基因bjmc2的启动子核苷酸序列为：在如seqid no.1所示的两室基因bjmc2的启动子核苷酸序列中缺失如seq id no.5所示的914bp的核苷酸序列。
11.进一步地，所述三室基因bjmc2的启动子核苷酸序列如seq id no.4所示。
12.进一步地，所述三室基因bjmc2的编码区的核苷酸序列与两室基因bjmc2 的编码区的核苷酸序列相同，如seq id no.2所示。
13.本发明的目的之六在于提供了一种包含上述三室基因bjmc2的载体或遗传工程菌。
14.本发明的目的之七在于提供了所述三室基因bjmc2和/或包含上述三室基因 bjmc2的载体或遗传工程菌在制备多室油菜中的应用。
15.本发明的目的之八在于提供了一种用于区分所述两室基因bjmc2及其等位基因三室基因bjmc2的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.6
‑
8 所示。
16.本发明的目的之九在于提供了所述分子标记在油菜多室品种选育中的应用。
17.本发明的目的之十在于提供了一种油菜多室品种的选育方法，所述方法包括：提取待测样品的总dna，采用上述分子标记进行pcr扩增，扩增产物进行电泳检测：若电泳条带仅出现一条1299bp的特异性条带，则待测样品为仅包含两室基因bjmc2的纯合型两室油菜；若电泳条带只出现一条700bp的特异性条带，则待测样品为仅包含三室基因bjmc2的纯合型三室油菜；若电泳条带同时包含一条1299bp和一条700bp的电泳条带，则待测样品为杂合型两室油菜。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过图位克隆技术，首次从芥菜型油菜中成功克隆得到了芥菜型油菜的两室基因bjmc2和三室基因 bjmc2，可利用所述两室基因和三室基因对油菜进行基因工程改造，以根据需求获得不同表型的油菜，其中三室油菜的产量相对较高。同时本发明还提供了一个可分别特异性扩增两室基因bjmc2和三室基因bjmc2的分子标记cm2，可将其应用于芥菜型多室油菜育种中，用于辅助选择具备三室性状的芥菜型油菜，从而克服了传统育种中依靠表型进行选择的缺陷，减少育种工作量，缩短育种年限，加快了芥菜型多室油菜育种的进程。
附图说明
19.图1为本发明实施例1中分离克隆候选基因区段的物理图谱，其中a为将 bjmc2基因登陆到芥菜型油菜a7染色体标记zx17和bacsr96之间的35kb物理区间内，括号内的数字表示相应标记的交换单株数，下面的灰色物理图谱是标记zx17和bacsr96在bac测序序列contig1对应的物理区间；b为bjmc2 位点的35kb物理区间在芥菜型油菜参考基因组中包含6个注释基因，灰色箭头表示bjmc2的候选基因；c为候选基因的基因结构以及在双亲中的多态性，深灰色柱代表外显子，浅灰色柱代表启动子和3
′
utr区，灰色虚线表示三室基因 bjmc2启动子区缺失914bp序列；
20.图2为本发明实施例2中利用分子标记cm2在芥菜型油菜不同群体中单株基因组dna的扩增结果，其中a为以j163
‑
4和j268
‑
1为双亲构建的f2群体中单株检测结果；b为以j163
‑
4和j268
‑
2为双亲构建的bjmc2位点nil
‑
bc7f1群体中单株检测结果，图中m为dna marker；
21.图3为本发明实施例3中分2段在芥菜型油菜j163
‑
4和j268
‑
1的基因组dna中分别扩增bjmc2和bjmc2的检测结果，其中a为片段1(包含启动子)扩增结果，左边为三室基因bjmc2(3060bp)，右边为两室基因bjmc2(4014bp)，；b为片段2扩增结果，左边为三室基因bjmc2，右边为两室基因bjmc2，片段大小均为3936bp，图中m为dnamarker；
22.图4为本发明实施例3中互补载体的构建图，其中a为载体pmc2::mc2；b为载体pmc2::mc2；
23.图5为本发明实施例3中阳性植株的pcr鉴定结果图，图中m为dnamarker，dnamarker左边为pmc2::mc2转基因植株检测结果，dnamarker右边为pmc2::mc2转基因植株检测结果；
24.图6为本发明实施例3中qrt
‑
pcr分析t1代转基因株系不同组织中bjmc2的表达情况；
25.图7为本发明实施例3中bjmc2和bjmc2基因在芥菜型油菜中互补验证的表型结果，其中图a为a
‑
bi株系植株的花发育第12期雌蕊横切、成熟果枝和角果表型；图b为a
‑
tri株系植株的花发育第12期雌蕊横切、成熟果枝和角果表型；图c为t1代pmc2::mc2转基因植株的花发育第12期雌蕊横切、成熟果枝和角果表型；图d为t1代pmc2::mc2转基因植株的花发育第12期雌蕊横切、成熟果枝和角果表型。
具体实施方式
26.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例1芥菜型油菜两室基因bjmc2和三室基因bjmc2序列的获得
28.1、精细定位区间的染色体登陆
29.现有技术通过精细定位已经把bjmc2基因限定在分子标记zx17和bacsr96之间，遗传距离分别为0.048cm、0.34cm，并共线于白菜a7scaffold000019的946～1014kb之间，约68kb物理距离。随后，将挑到的两个bac阳性单克隆(002
‑
o
‑
21和009
‑
m
‑
2)的全长测序序列组装完成，一共获得3个contigs(分别命名为contige1、2、3)。经比对发现，标记zx17和bacsr96在contige1的物理位置分别为89.5kb和54.6kb，覆盖34.9kb的物理区间。当芥菜型油菜的全基因组序列测序完成后，标记zx17和bacsr96标记分别在芥菜型油菜参考基因组a7的物理位置为32935kb和32900kb，覆盖35kb的物理区间，说明之前bjmc2位点的定位结果是可靠的(如1
‑
a所示，其中括号内的数字表示相应标记的交换单株数，下面的灰色物理图谱是标记zx17和bacsr96在bac测序序列contig1对应的物理区间)。如图1
‑
b所示，这段基因组区域包含6个有注释的候选基因(bjua029482、bjua029483、bjua029484、bjua029485、bjua029486和bjua029487)，其中bjua029487只包含部分cds。通过对6个候选基因的序列进行分析，预测其中bjua029486可能是bjmc2的候选基因，并进一步对其进行验证。
30.2、两室基因bjmc2的候选基因bjua029486在双亲中序列比较分析
31.为了确定bjmc2位点的候选基因，基于contig1测序序列，设计一系列特异引物，如表1所示：
32.表1候选基因比较测序的引物核苷酸序列
[0033][0034]
注：a在三室亲本中扩增无条带；b在三室亲本中扩增条带大小为1739bp
[0035]
分别以两室亲本268
‑
1和三室亲本163
‑
4的基因组dna为模板，利用高保真pcr方法进行基因扩增。ta克隆测序结果表明，在两室亲本268
‑
1和三室亲本163
‑
4中该基因的编码区(3043bp)和3'utr(1248bp)序列没有差异，而在起始密码子atg的上游启动子区域有差异，相较两室亲本，三室亲本在起始密码子atg的上游
‑
2865bp到
‑
3778bp(914
‑
bp)大片段缺失(如图1
‑
c所示，其中深灰色柱代表外显子，浅灰色柱代表启动子和3
′
utr区，灰色虚线表示三室基因bjmc2启动子区缺失914
‑
bp序列)。由此，得到了芥菜型油菜两室基因 bjmc2的候选基因完整序列，其启动子核苷酸序列(起始密码子atg的上游序列，下同)如seq id no.1所示，编码区核苷酸序列如seq id no.2所示，编码的氨基酸序列如seq id no.3所示。同时，还得到了该基因在三室亲本j163
‑
4 中的等位基因完整序列，即三室基因bjmc2，其启动子核苷酸序列为seq id no. 4所示，相较于两室基因bjmc2的启动子序列，三室基因bjmc2的启动子序列缺失了如seq id no.5所示的914bp序列。
[0036]
实施例2与芥菜型油菜三室性状相关的分子标记及其应用
[0037]
1、与芥菜型油菜三室性状相关的分子标记cm2的开发
[0038]
本发明根据已获得的bjmc2基因和bjmc2基因序列信息，在bjmc2启动子缺失位点附近开发共分离分子标记cm2(包含cm2
‑
f1、cm2
‑
f2和cm2
‑
r三条引物)。pcr扩增芥菜型两室油菜j268
‑
1和芥菜型三室油菜j163
‑
4的基因组 dna，在j268
‑
1中分子标记cm2预期扩增出1299bp的片段，而在j163
‑
4中 cm2预期扩增出700bp的片段。
[0039]
本实施例所开发的cm2共分离分子标记的序列如下：
[0040]
cm2
‑
f1：tactacttccgttgccttttcg
[0041]
cm2
‑
f2：aaaatactggtgtacattggaa
[0042]
cm2
‑
r：aaatccatacacttggggtt
[0043]
2、分子标记cm2在不同群体中的应用
[0044]
采用本领域常规方法提取以j163
‑
4和j268
‑
2为双亲构建的bjmc2位点nil
ꢀ‑
bc7f1群体和以j163
‑
4和j268
‑
1为双亲构建的f2及bc1f1群体的单株叶片总d na，利用上述开发的分子标记cm2进行pcr扩增。
[0045]
pcr的反应体系如下：1
×
pcr buffer，1.35mm mgcl2，0.08mm dntps，1.0u dna聚合酶(均购自mbi fermentas,lithuanin公司)，100ng dna，两条正向引物cm2
‑
f1和cm2
‑
f2各加0.5um，反向引物cm2
‑
r加1um，ddh
2 o补充至终体积20ul。
[0046]
热循环参数为：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃90sec，35个循环；72℃10min，1个循环。
[0047]
扩增产物在水平电泳槽上1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果如图2所示，其中图2
‑
a为f2群体中单株检测结果，共检测出3种带型：同时包含1299bp 和700bp上下2条条带的bjmc2位点为杂合型，其基因型为mc2/mc2；只含有 1条上条带(1299bp)的bjmc2位点为显性纯合型，其基因型为mc2/mc2；只含有1条下条带(700bp)的bjmc2位点为隐性纯合型，其基因型为mc2/mc2。图2
‑
b为bjmc2位点nil
‑
bc7f1群体中单株检测结果，共检测出2种带型，其中同时包含上下2条条带的bjmc2位点为杂合型，其基因型为mc1mc1mc2mc2 (田间表型为两室)，只含有1条下条带的bjmc2位点为隐性纯合型，其基因型为mc1mc1mc2mc2(田间表型为三室)。上述结果说明，本发明开发的cm2 分子标记可以作为芥菜型油菜三室性状的共显性分子标记。因此，cm2结合专利cn201610979823.2中公开的bjmc1位点的m1
‑
1分子标记，可以在不同杂交组合的低世代(例如f2)就能对不同基因型的两室和三室单株进行区分，从而有效缩短了多室油菜的选育年限，提高选择效率。
[0048]
实施例3两室基因bjmc2和三室基因bjmc2在芥菜型油菜中的互补验证
[0049]
1、遗传互补载体的构建
[0050]
为了验证该候选基因的功能，根据比较测序得到的序列，设计特异引物在三室亲本j163
‑
4和两室材料j268
‑
1中分别扩增出该候选基因的基因组序列。本发明所用到的互补载体包括：pmc2::mc2和pmc2::mc2。其中，pmc2::mc2的外源片段是通过两对引物g2einfusionf/g2&g3medinfur(扩增条带大小为4014 bp)和g2&g3medinfuf/g2&g3kinfusionr(扩增条带大小为3936bp)分2段扩增j268
‑
1的基因组dna，引物序列为：
[0051]
g2einfusionf： ctatgacatgattacgaattcgaattgaaaccactttttttacacc
[0052]
g2&g3medinfur： agtgagctgagggggaagtggagtgaacccagtcgtggag
[0053]
g2&g3medinfuf： cacttccccctcagctcactgttctttctccggcgtttca
[0054]
g2&g3kinfusionr： tctagaggatccccgggtacccaacatggcttttatttattaatctccac
[0055]
pcr产物经过1.0％tae琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图3所示，其中3
‑
a 为片段1(包含启动子)扩增结果，图3
‑
b为片段2的扩增结果。将目的条带进行挖胶回收(琼脂糖凝胶dna纯化回收试剂盒，cat.no.dp219，天根)，再通过同源重组(clonexpressⅱone step cloning kit,vazyme)的方法与经过ecor
ꢀⅰ
和kpnⅰ双酶切处理的pcambia 2300空载体连接，pmc2::mc2载体的构建图如图4
‑
a所示。插入片段为bjmc2全长7930bp的基因组序列，其中包括gdna 序列3043bp、上游启动子序列3818bp和下游5'utr序列1069bp。获得的阳性克隆经过pcr扩增、测序与比较测序序列比对无突变后，用于后续遗传转化。
[0056]
同样，pmc2::mc2的外源片段也是通过两对引物 g3einfusionf/g2&g3medinfur(扩增条带大小为3060bp)和 g2&g3medinfuf/g2&g3kinfusionr(扩增条带大小为3936bp)分2段扩增j163
‑
4 的基因组dna，引物序列为：
[0057]
g3einfusionf： ctatgacatgattacgaattctgtacattggaaatgcaactccagc
[0058]
另外3条引物序列同上，pcr产物经过1.0％tae琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图3所
marker，片段大小从上至下依次为3000bp、2000bp、1000bp、750bp和500bp，dnamarker左边的条带为pmc2::mc2转基因植株的检测结果，dnamarker右边的条带为pmc2::mc2转基因植株的检测结果，片段大小均约为1.2kb，该结果说明阳性植株中包含候选基因。
[0068]
对所有t0代阳性植株的表型进行鉴定，其中pmc2::mc2载体18株有表型，pmc2::mc2载体31株有表型。继续种植有表型的单株t1代，取苗期幼叶、花序和雌蕊子房提取总rna(百泰克，rp3202，http://cn.bioteke.cn/)。每个样品吸取2毫克的总rna进行反转录(fermentas，revertaidfirststrandcdnasynthesk1622)。将合成的第一链cdna稀释20倍用作qrt
‑
pcr的模板，在qrt
‑
pcr专用96孔板中先加入上下游引物(5.0μm)等比例混合液3.2μl，模板2.0μl和greenrealtimepcrmastermix(toyobo)10μl，最后补ddh20至20μl，每对引物3个技术重复，每个组织3次生物学重复，actin2内参基因作为对照。qrt
‑
pcr引物序列为：
[0069]
rta7mc2f：tcaagaatctcctcaacggtac
[0070]
rta7mc2f：agaagaagttatcggtgagctc
[0071]
actin2
‑
f：ggagctgagagattccgttg
[0072]
actin2
‑
r：gaaccaccactgaggacgat
[0073]
反应程序如下：95℃预变性60s；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，39个cycles；熔解曲线程序：95℃10s，95℃
‑
65℃5s，
‑
0.5℃percycle，收集数据。qrt
‑
pcr在bio
‑
redcfx96touch
tm
荧光定量pcr仪上进行，依照2
‑
δδct
方法分析基因的相对表达量。
[0074]
qrt
‑
pcr分析结果如图6所示(student’st检验显著性差异，ns：不显著(p≥0.05)；***：极显著(p<0.001))，其中pmc2::mc2转基因植株的苗期幼叶、花序和雌蕊子房中bjmc2转录本的相对表达量相较于受体材料均有显著性提高。同样，pmc2::mc2转基因植株的苗期幼叶和花序中bjmc2转录本的相对表达量相较于受体材料也有显著性提高，且和pmc2::mc2转基因植株间没有显著性差异。然而，pmc2::mc2转基因植株的雌蕊子房中bjmc2转录本的相对表达量相较于受体材料没有显著性差异，但显著性低于pmc2::mc2转基因植株。这些结果表明bjmc2启动子缺失914
‑
bp不影响bjmc2基因在苗期幼叶和花序中的表达，但会影响bjmc2基因在雌蕊子房中表达。
[0075]
同时取有表型t1代株系的花蕾做石蜡切片，不同植株的的花发育第12期雌蕊横切、成熟果枝和角果表型的切片结果如图7所示，其中图7
‑
a为a
‑
bi株系植株；图7
‑
b为a
‑
tri株系植株；图7
‑
c为t1代pmc2::mc2转基因植株；图7
‑
d为t1代pmc2::mc2转基因植株。
[0076]
根据图7
‑
c，其中pmc2::mc2转基因植株的雌蕊可以将三室株系a
‑
tri恢复成由两个心皮和一个“i”型假隔膜组成的两室表型，和图7
‑
a中bc7f2‑
bi(a
‑
bi)两室株系的雌蕊表型类似。而图7
‑
d中pmc2::mc2转基因植株的雌蕊不可以恢复为两室表型，其雌蕊由4个心皮和1个“ii”型假隔膜或3个心皮和1个“y”型假隔膜组成的三室表型，和图7
‑
b中bc7f2‑
tri(a
‑
tri)三室株系的雌蕊表型类似。在成熟果枝和角果也能看出pmc2::mc2转基因植株主要是两室角果组成，而pmc2::mc2转基因植株仍然主要是3室角果组成，表明pmc2::mc2转基因植株可恢复成两室角果表型，而pmc2::mc2转基因植株不能恢复两室角果表型。
[0077]
综上所述，本发明成功筛选克隆得到了两室基因bjmc2，其启动子核苷酸序列如seqidno.1所示，编码区的核苷酸序列如seqidno.2所示，编码的氨基酸序列如序列表seqidno.3所示；该两室基因的启动子突变等位基因即三室基因bjmc2的启动子核苷酸序
列如seq id no.4所示，三室基因bjmc2启动子相较于两室基因bjmc2启动子缺失的914bp核苷酸序列如seq id no.5所示。将该两室基因bjmc2通过基因工程改造技术导入至以j163
‑
4和j268
‑
2为双亲构建的bjmc2位点nil
‑
bc7f2三室自交株系(a
‑
tri)植株中，可恢复两室角果表型，证明了这段914bp启动子核苷酸序列是两室基因bjmc2恢复两室角果表型所必须的。
[0078]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。