小牛血清动物源性成分种属的检测方法与流程

1.本发明涉及生化药物检测领域，具体涉及一种小牛血清动物源性成分 种属的检测鉴别方法。


背景技术：

2.小牛血清去蛋白注射液为小牛血清经乙醇沉淀去蛋白、浓缩、多次超 滤除菌等工艺制得的无菌水溶液。其已收载于国家药品标准中，该标准虽 规定了产品的动物种属来源，但并未提出具体的小牛血清种属来源的检测 鉴别方法。由于在小牛血清去蛋白注射液生产过程中，小牛血清去蛋白提 取物要经多次超滤步骤，本产品的制剂中的活性成分与中间体已不具备通 过核酸分子技术来检测鉴别小牛血清的种属来源的条件，小牛血清由于其 经过了搅拌、离心等多道工序而获得，其模板dna的含量更低且不易扩增， 因此，如何能够有效检测出不同种属来源的小牛血清，对于鉴别产品是否 符合国家有关的质量要求尤为关键。
3.聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction，pcr)系指通过提取 样品中物种的遗传物质脱氧核糖核酸(dna)，对dna中具有种属特异性 的片段进行聚合酶链式反应扩增，并对扩增产物进行检测，以检测不同种 属来源的动物源性成分产品，常规pcr法采用琼脂糖凝胶电泳对pcr扩增 产物进行检测，通过与dna分子量marker进行比较，将样品扩增产物的 片段大小与预期大小进行比较，从而判断样品中是否含有特定的动物源性 成分。
4.国家标准gb/t21101
‑
2007公开了动物源性饲料中猪源性成分定性检测 的pcr方法。该方法属于从固体原料中提取dna，其模板dna浓度相对 有保证，扩增容易。但是，该方法不适用于药品行业中dna浓度较低的液 体动物源性原料，且该方法使用试剂复杂，相对于药品检验实验室不易操 作。
5.国家标准gb/t 20190
‑
2006公开了饲料中牛羊源性成分定性检测的 pcr方法。该方法同样属于从固体原料中提取dna，其模板dna浓度相 对有保证，扩增容易。但该方法不适用于药品行业中dna浓度较低的液体 动物源性原料，且该方法使用试剂复杂，相对于药品检验实验室不易操作。
6.因此，为了有效检测小牛血清去蛋白注射液的小牛血清的种属来源以 确定其是否符合相关质量要求，保证小牛血清原料确实来源于牛源性成分， 亟需一种针对原材料小牛血清的牛、猪及羊源性成分的检测鉴别方法。
7.开发一种专属性好、灵敏度高、扩增速度快、操作简便、成本低的小 牛血清动物源性成分种属的检测方法是有必要的。


技术实现要素：

8.针对以上技术现状，本发明的目的是提供一种专属性好、灵敏度高、 操作简便的小牛血清动物源性成分种属的检测方法，本发明所述方法包括 如下步骤：
9.(1)模板dna制备：提取样品的基因组dna，测定浓度，稀释，作 为样品模板dna；
10.(2)pcr扩增：取步骤(1)中所得样品模板dna，鉴别引物为seq id no：1和seq id no：2；或为seq id no：3和seq id no：4；或为 seq id no：5和seq id no：6；pcr扩增反应体系为样品模板dna、鉴 别引物混合液、pcr扩增试剂、水，扩增条件为：94℃预变性1
‑
5分钟， 然后94
‑
95℃变性30
‑
60秒、50
‑
60℃退火30
‑
45秒、72℃延伸30
‑
60秒，循 环30
‑
35次，72℃延伸5min，4℃保温结束反应；
11.(3)酶切反应：取步骤(2)所得样品模板dna扩增产物，限制性内 切酶为dpn ii酶、mnl i酶、或sau3a i酶，酶切反应体系为扩增产物、限 制性内切酶、酶反应缓冲液、无菌水，酶切反应条件为：37℃60
‑
120分钟，65℃5
‑
20分钟，4℃保温结束反应；作为示例性的说明，37℃酶切60min、 80min、100min、120min。
12.(4)琼脂糖凝胶电泳测定：取步骤(3)所得酶切产物，制胶，点样， 电泳。
13.本发明方法中，所述动物源性成分包括牛源性成分、猪源性成分或羊 源性成分。
14.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法步骤(2)中扩增条件为： 94℃预变性3
‑
5分钟，然后94
‑
95℃变性30
‑
45秒、55
‑
59℃退火30秒、72℃ 延伸30
‑
45秒，循环35次，72℃延伸5min，4℃保温结束反应；
15.本发明方法中，作为实施方案之一，进一步优选扩增条件为：94℃预 变性5分钟，然后94℃变性30秒、57℃退火30秒、72℃延伸30秒，循环 35次，72℃延伸5min，4℃保温结束反应。作为示例性说明，退火温度为 55℃、56℃、57℃、58℃、59℃。
16.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法步骤(3)中酶切反应条 件为：37℃60分钟，65℃20分钟，4℃保温结束反应。
17.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：所述样品 包括对照品和供试品，所述供试品为小牛血清；所述对照品为小牛血清、 猪血清或羊血清。
18.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：步骤(1) 中提取的dna用水稀释制成每1ml中含dna 1.25～5μg的溶液，优选每1ml 中含5μg的溶液。
19.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：步骤(2) 中pcr扩增试剂为premix ex taq hs、taq hs perfect mix、或premix taq
tm
， pcr扩增反应体系为样品模板dna 5
‑
8μl、优选5μl，鉴别引物混合液 0.5
‑
1μl、优选1μl，扩增试剂10μl、无菌水补足至20μl。
20.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法步骤(2)中pcr扩增试 剂为premix ex taq hs，pcr扩增反应体系为样品模板dna 5μl、鉴别引物 混合液1μl、premix ex taq hs 10μl、无菌水补足至20μl。
21.本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(4)进一步包括：
22.(4
‑
1)琼脂糖凝胶的配制：称取琼脂糖1.5g，加琼脂糖凝胶电泳缓冲 液50ml，加热使完全溶胀，加入核酸染料5μl，趁热将胶液倾注于制胶板上， 涂层厚度约10mm，插入加样梳，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层， 拔出加样梳，即得；
23.(4
‑
2)电泳检测：分别取步骤(3)所得供试品和对照品限制性内切酶 酶切反应液各9μl，加上样缓冲液1μl，混匀，加到琼脂糖凝胶板上，在另 一单独泳道加入dna分子量marker5μl，恒压70
‑
100v、优选80v，电泳 40
‑
80分钟、优选45分钟，置于紫外凝胶成像系统上成像，观察。
24.本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(4
‑
1)中琼脂糖凝胶电 泳缓冲液按
以下方法制得：取三羟甲基氨基甲烷4.84g，二水合乙二胺四醋 酸二钠0.37g，加水800ml，充分搅拌使溶解。再加冰醋酸1.14ml，搅拌均 匀，用氢氧化钠试液调节ph至8.3，用水稀释至1000ml，即得。
25.本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(4
‑
2)中上样缓冲液按 以下方法制得：取溴酚蓝0.25g，二水合乙二胺四醋酸二钠1.12g，加水30ml， 充分搅拌使溶解，用氢氧化钠试液调节ph至8.0，加甘油50ml，混匀，用 水稀释至100ml，即得。
26.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：
27.鉴别牛源性成分时，所述对照品为小牛血清，所述步骤(2)中的鉴别 引物为seq id no：1和seq id no：2，所述对照品分别在214bp及57bp 处各有一条dna条带；或
28.鉴别猪源性成分时，所述对照品为猪血清，所述步骤(2)中的鉴别引 物为seq id no：3和seq id no：4，所述对照品分别在196bp及16bp 处各有一条dna条带；或
29.鉴别羊源性成分时，所述对照品为羊血清，所述步骤(2)中的鉴别引 物为seq id no：5和seq id no：6，所述对照品分别在202bp及91bp 处各有一条dna条带。
30.本发明方法中，作为实施方案之一，所述方法进一步包括：鉴别牛源 性成分时，所述步骤(3)中的限制性内切酶为dpn ii酶，酶切体系为扩增 产物5μl、dpn ii反应缓冲液1μl、dpn ii酶0.5μl、加无菌水补足至10μl； 或
31.鉴别猪源性成分时，所述步骤(3)中的限制性内切酶为mnl i酶，酶 切体系为扩增产物5μl、mnl i反应缓冲液1μl、mnl i酶0.5μl、加无菌水补 足至10μl；或
32.鉴别羊源性成分时，所述步骤(3)中的限制性内切酶为sau3a i酶， 酶切体系为扩增产物5μl、sau3a i反应缓冲液1μl、sau3a i酶0.5μl、加无 菌水补足至10μl。
33.本发明方法中，作为实施方案之一，所述步骤(1)中可使用常用的dna 提取试剂盒按照说明书进行提取，作为示例性的说明，可使用promega公 司的magnetic dna purification system for food试剂盒或其他同等 效果的试剂盒。
34.本发明中，作为实施方案之一，所述步骤(1)中测定基因组dna提 取液浓度，照紫外
‑
可见分光光度法(中国药典2020年版四部通则0401)， 在260nm的波长处测定吸光度，按下式计算出基因组dna提取液浓度
[0035][0036]
式中c为基因组dna提取液浓度(μg/ml)；
[0037]
a
260
为基因组dna提取液在260nm处的吸光度；
[0038]
0.020为每1ml含有1μg dna的溶液在260nm处的吸光度；
[0039]
l为光程(cm)；
[0040]
n为基因组dna提取液的稀释倍数。
[0041]
本发明中，作为实施方案之一，所述步骤(1)中测定基因组dna提 取液浓度，可使用基于相同原理的dna浓度测定仪器进行基因组dna提 取液的浓度测定，并根据所使用的仪器操作说明进行浓度计算，作为示例 性说明，可根据epoch超微量核酸分析仪的操作说明测定基因组dna提取 液的浓度。
[0042]
本发明中，作为实施方案之一，所述步骤(2)中可使用常用的pcr扩 增试剂按照说明书配制样品的反应体系，体系中包含taq酶、与taq酶相匹 配的缓冲液、鉴别引物混合液、
供试品或对照品的模板dna以及dntp等 pcr反应所需的成分，作为示例性的说明，可使用宝生物工程大连有限公 司的premix ex taq hs或其他同等效果的试剂。
[0043]
本发明的小牛血清动物源性成分种属鉴别方法相对于现有技术，具有 专属性好、灵敏度高、扩增速度快、操作简便、成本低的优点，更适合于 鉴别药品行业中dna浓度较低的液体动物源性原料，可以有效保证实验室 检验需求。
附图说明
[0044]
图1：实施例1中小牛血清样品牛源性成分鉴别的电泳图，泳道m： dna分子量marker(dl500)；泳道1：牛源性成分对照品；泳道2
‑
6：样 品2、3、4、5、8；
[0045]
图2：实施例2中小牛血清样品猪源性成分鉴别的电泳图，其中泳道m： dna分子量marker(dl500)；泳道1：猪源性成分对照品；泳道2
‑
7：样 品1、2、3、4、5、8；
[0046]
图3：实施例3中小牛血清样品羊源性成分鉴别的电泳图，泳道m： dna分子量marker(dl500)；泳道1：羊源性成分对照品；泳道2
‑
7：样 品1、2、3、4、5、8；
[0047]
图4：实施例4中基因组dna溶液浓度对牛源性成分鉴别的影响电泳 图，其中泳道m：dna分子量marker(dl500)；泳道1：样1模板dna (5ng/μl)；泳道2：样1模板dna(2.5ng/μl)；泳道3：样1模板dna(1.25 ng/μl)；泳道4：样1模板dna(0.62ng/μl)；泳道5：样1模板dna (0.31 ng/μl)；泳道6：样1模板dna (0.16ng/μl)；
[0048]
图5：实施例4中基因组dna溶液浓度对猪源性成分鉴别的影响电泳 图，泳道m：dna分子量marker(dl500)；泳道1：样6模板dna(5ng/μl)； 泳道2：样6模板dna(2.5ng/μl)；泳道3：样6模板dna (1.25ng/μl)； 泳道4：样6模板dna(0.62ng/μl)；泳道5：样6模板dna(0.31ng/μl)； 泳道6：样6模板dna(0.16ng/μl)；
[0049]
图6：实施例4中基因组dna溶液浓度对羊源性成分鉴别的影响电泳 图，泳道m：dna分子量marker(dl500)；泳道1：样7模板dna(5ng/μl)； 泳道2：样7模板dna(2.5ng/μl)；泳道3：样7模板dna(1.25ng/μl)； 泳道4：样7模板dna(0.62ng/μl)；泳道5：样7模板dna(0.31ng/μl)； 泳道6：样7模板dna(0.16ng/μl)；泳道7：样7模板dna(0.08ng/μl)； 泳道8：样7模板dna(0.04ng/μl)；
[0050]
图7：实施例7中牛、猪及羊源性成分鉴别专属性验证电泳图，其中泳 道m：dna分子量marker(dl500)；泳道1：猪源性成分对照品(5ng/μl)； 泳道2：牛源性成分对照品(5ng/μl)；泳道3：羊源性成分对照品(5ng/μl)；
[0051]
图8：实施例8中牛猪混合样品中猪源性成分鉴别电泳图，泳道m： dna分子量marker(dl500)；泳道1：猪源性成分对照品；泳道2：猪源 性成分50％；泳道3：猪源性成分10％；泳道4：猪源性成分1％；泳道泳 道5：猪源性成分0.1％；泳道6：猪源性成分0.01％；
[0052]
图9：实施例9中牛羊混合样品中羊源性成分鉴别电泳图，泳道m： dna分子量marker(dl500)；泳道1：羊源性成分对照品；泳道2：羊源 性成分50％；泳道3：羊源性成分10％；泳道4：羊源性成分1％；泳道5： 羊源性成分0.1％；泳道6：羊源性成分0.01％；
[0053]
图10：实施例5中pcr扩增条件对鉴别方法的影响电泳图，泳道m： dna marker(dl500)；泳道1：55℃；泳道2：56℃；泳道3：57℃；泳 道4：58℃；泳道5：59℃；
[0054]
图11：实施例6中酶切条件对鉴别方法的影响，泳道m：dna marker (dl500)；泳道1：60min；泳道2：80min；泳道5：100min；泳道8：120min。
具体实施方式
[0055]
结合以下实施例或试验例对本发明进行进一步的说明，但本发明并不 受限于此。
[0056]
样品：
[0057]
表1样品信息表
[0058][0059]
对照品确认：
[0060]
对提取自样1、样6、样7的基因组dna碱基序列进行测序(委托上 海美吉生物医药有限公司进行)，并通过与genbank核酸数据库中的物种序 列进行比对，以此明确上述样品的种属来源。
[0061]
比对结果显示：样1的碱基序列与基因库中搜索到的牛(bos taurus) 最高匹配度为100％，样6的碱基序列与基因库中家猪(sus scrofa)基因匹 配度为100％，样7的碱基序列与羊(ovis aries)基因匹配度为100％。
[0062]
因此，可确认样1、样6、样7的种属来源分别为牛、猪、羊。由于目 前尚无牛、猪及羊源性成分种属鉴别方法的国家标准品，因此，将上述三 个已确认种属来源的基因组dna将分别作为牛、猪、羊源性成分的对照品 使用。
[0063]
试剂与仪器：
[0064]
pcr仪(美国thermo fisher，型号：veriti)，紫外凝胶成像系统(美 国proteinsimple，型号：fluorchem fc3)，电源及电泳仪(美国bio
‑
rad， 型号：powerpac basic)，超微量核酸分析仪(法国biotek，型号：ephoch)， dynabeads磁力管架(美国thermo fisher，型号：mpc
‑
s)。
[0065]
基因组dna提取试剂盒：magnetic dna purification system for food(美国promega，批号：0000213187)，试剂盒组成包括：裂解缓冲液 a(lysis buffer a)、裂解缓冲液b(lysis buffer b)、沉淀溶液(precipitation solution)、磁珠液(pmps)
[0066]
pcr试剂：premix ex taq hs(大连宝生物，批号：a3202a)
[0067]
rna酶：rnase a(100mg/ml，天根生物技术有限公司，批号：p4506)
[0068]
限制性内切酶：dpn ii(10000u/ml，美国new england biolabs，批号： 0080902)；mnl i(5000u/ml，美国new england biolabs，批号：0611403)； sau3a i(10000u/ml，大连
宝生物，批号：k3653ca)
[0069]
dpn ii反应缓冲液：nebuffer for dpn ii(美国new england biolabs， 批号：0607)
[0070]
mnl i反应缓冲液：cutsmart buffer(美国new england biolabs，批号： 0051404)
[0071]
sau3a i反应缓冲液：k buffer(大连宝生物，批号：a2701c)
[0072]
核酸染料：gelred(10000
×
，碧云天生物技术有限公司，批号：d0139)
[0073]
琼脂糖：ultrapure agarose(美国life technology，批号：0000424058)
[0074]
dna分子量marker：dl500(大连宝生物，批号：a701a)
[0075]
琼脂糖凝胶电泳缓冲液取三羟甲基氨基甲烷4.84g，二水合乙二胺四 醋酸二钠0.37g，加水800ml，充分搅拌使溶解。再加冰醋酸1.14ml，搅拌 均匀，用氢氧化钠试液调节ph至8.3，用水稀释至1000ml，即得。
[0076]
上样缓冲液取溴酚蓝0.25g，二水合乙二胺四醋酸二钠1.12g，加水 30ml，充分搅拌使溶解，用氢氧化钠试液调节ph至8.0，加甘油50ml，混 匀，用水稀释至100ml，即得。
[0077]
实施例1小牛血清牛源性成分鉴别
[0078]
(1)模板dna制备
[0079]
样品基因组dna提取：
[0080]
分别取样品1(对照品)、样品2
‑
5、8(供试品)各约0.2ml，根据基因 组dna提取试剂盒说明书提取样品基因组dna，具体操作方法如下：
[0081]
(1
‑
1)向0.2ml样品中加入裂解缓冲液a(lysis buffer a)500μl及 rna酶5μl，振荡混匀；
[0082]
(1
‑
2)加入裂解缓冲液b(lysis buffer b)250μl，剧烈振荡15秒；
[0083]
(1
‑
3)室温放置10分钟；
[0084]
(1
‑
4)加入沉淀溶液(precipitation solution)750μl，剧烈振荡15秒；
[0085]
(1
‑
5)每分钟12000转，离心10分钟；
[0086]
(1
‑
6)吸取上清液950μl，转移至另一新的2ml离心管中；
[0087]
(1
‑
7)将磁珠液(pmps)振荡混匀，吸取50μl加入上述上 清液中，剧烈振荡混匀；
[0088]
(1
‑
8)加入800μl异丙醇，上下颠倒混匀10～15次，室温孵育5分钟 后置于dynabeads磁力管架上，待磁珠完全吸附于管壁后，用移液器吸净管 中液体；
[0089]
(1
‑
9)将离心管从磁力管架上取出，加入裂解缓冲液b(lysis buffer b)250μl，上下颠倒混匀2～3次后，重新放置于磁力管架上，待磁珠完全 吸附于管壁后，用移液器吸净管中液体；
[0090]
(1
‑
10)将离心管从磁力管架上取出，加入70％乙醇1ml，上下颠倒混 匀2～3次后，重新放置于磁力管架上，待磁珠完全吸附于管壁后，用移液 器吸净管中液体；
[0091]
(1
‑
11)再次重复第(10)步2次；
[0092]
(1
‑
12)将离心管从磁力管架上取出，打开管盖65℃放置10分钟；
[0093]
(1
‑
13)加入水100μl，关上管盖，振荡混匀，65加热5分钟后将离心 管置于磁力管
架上，待磁珠完全吸附于管壁后，吸取管中液体，置于新的 1.5ml离心管中，即为样品基因组dna提取液。
[0094]
取样品基因组dna提取液2μl，根据epoch超微量核酸分析仪的操作 说明测定基因组dna提取液的浓度。
[0095]
取供试品基因组dna提取液，用水稀释制成每1ml中约含基因组dna 5μg的溶液，作为供试品模板dna。取对照品基因组dna提取液同法操作， 作为对照品模板dna。
[0096]
(2)pcr扩增
[0097]
牛源性成分鉴别引物：
[0098]
上游引物：5
’‑
gcc ata tac tct cct tgg tga ca
‑3’
(seq id no： 1)
[0099]
下游引物：5
’‑
gta ggc ttg gga ata gta cga
‑3’
(seq id no：2) 按下表配制pcr反应体系：
[0100]
表2 pcr反应体系
[0101][0102]
pcr反应条件为：94℃5分钟，循环反应35次(94℃30秒，57℃30 秒，72℃30秒)，72℃延伸5min，4℃保温结束反应。
[0103]
(3)酶切反应
[0104]
取步骤(2)中pcr反应产物，按表3配制牛源性成分鉴别的限制性内 切酶酶切反应体系：
[0105]
表3牛源性成分鉴别限制性内切酶酶切体系
[0106][0107]
dpn ii限制性内切酶酶切反应条件为：37℃60分钟，65℃20分钟，4℃ 保温结束反应。
[0108]
(4)琼脂糖凝胶电泳测定：
[0109]
琼脂糖凝胶的配制：
[0110]
称取琼脂糖1.5g，加琼脂糖凝胶电泳缓冲液50ml，加热使完全溶胀， 加入核酸染料5μl，趁热将胶液涂布于制胶板上，涂层厚度约10mm，插入 加样梳，静置，待凝胶凝固成无
气泡的均匀薄层，拔出加样梳，即得。
[0111]
电泳检测：
[0112]
取步骤(3)所得的限制性内切酶酶切反应液9μl，加上样缓冲液1μl， 混匀，加到琼脂糖凝胶板上，在另一单独泳道加入dna分子量marker5μl， 恒压80v，电泳45分钟，置于紫外凝胶成像系统上成像，观察。
[0113]
实验结果：
[0114]
(1)步骤(1)中提取的dna浓度结果见下表：
[0115]
表4样品基因组dna提取液浓度测定结果
[0116][0117]
(2)电泳检测结果：
[0118]
以样1为牛源性成分对照品，对样2～5、样8进行牛源性成分鉴别，对 照品的限制性内切酶酶切反应液应分别在214bp及57bp处各有一条dna 条带，供试品的限制性内切酶酶切反应液dna条带位置均与对照品的一致 (见图1，泳道m：dna分子量marker(dl 500)；泳道1：牛源性成分对 照品；泳道2：样2；泳道3：样3；泳道4：样4；泳道5：样5；泳道6： 样8)。
[0119]
结果显示，5批样品均检出牛源性成分。
[0120]
实施例2小牛血清猪源性成分鉴别
[0121]
(1)模板dna制备
[0122]
样品：样6(对照品)，样1
‑
5、8(供试品)
[0123]
具体步骤同实施例1步骤(1)。
[0124]
(2)pcr扩增
[0125]
猪源性成分鉴别引物：
[0126]
上游引物：5
’‑
gcc taa atc tcc cct caa tgg ta
‑3’
(seq id no： 3)
[0127]
下游引物：5
’‑
atg aaa gag gca aat aga ttt tcg
‑3’
(seq id no：4)
[0128]
具体步骤同实施例1步骤(2)。
[0129]
(3)酶切反应
[0130]
取步骤(2)中pcr反应产物，按表5配制猪源性成分鉴别的限制性内 切酶酶切反应体系：
[0131]
表5猪源性成分鉴别限制性内切酶酶切体系
[0132][0133]
mnl i限制性内切酶酶切反应条件为：37℃60分钟，65℃20分钟，4℃ 保温结束反应。
[0134]
(4)琼脂糖凝胶电泳测定：
[0135]
具体步骤同实施例1步骤(2)。
[0136]
实验结果：
[0137]
(1)步骤(1)中提取的dna浓度结果见下表：
[0138]
表6样品基因组dna提取液浓度测定结果
[0139][0140][0141]
(2)电泳检测结果：
[0142]
以样6为猪源性成分对照品，对样1～5、样8进行猪源性成分鉴别，对 照品的限制性内切酶酶切反应液应分别在196bp及16bp处各有一条dna 条带，供试品的限制性内切酶酶切反应液均无dna条带(见图2，泳道m： dna分子量marker(dl500)；泳道1：猪源性成分对照品；泳道2：样1； 泳道3：样2；泳道4：样3；泳道5：样4；泳道6：样5；泳道7：样8)。
[0143]
结果显示，6批样品均未检出猪源性成分。
[0144]
实施例3小牛血清羊源性成分鉴别
[0145]
(1)模板dna制备
[0146]
样品：样7(对照品)，样1
‑
5、8(供试品)
[0147]
具体步骤同实施例1步骤(1)。
[0148]
(2)pcr扩增
[0149]
羊源性成分鉴别引物：
[0150]
上游引物：5
’‑
tat tag gcc tcc ccc ttg tt
‑3’
(seq id no：5)
[0151]
下游引物：5
’‑
ccc tgc tca taa ggg aat agc c
‑3’
(seq id no： 6)
[0152]
具体步骤同实施例1步骤(2)。
[0153]
(3)酶切反应
[0154]
取步骤(2)中pcr反应产物，按表7配制羊源性成分鉴别的限制性内 切酶酶切反应体系：
[0155]
表7羊源性成分鉴别限制性内切酶酶切体系
[0156][0157][0158]
sau3a i限制性内切酶酶切反应条件为：37℃60分钟，65℃20分钟， 4℃保温结束反应。
[0159]
(4)琼脂糖凝胶电泳测定：
[0160]
具体步骤同实施例1步骤(2)。
[0161]
实验结果：
[0162]
(1)步骤(1)中提取的dna浓度结果见下表：
[0163]
表8样品基因组dna提取液浓度测定结果
[0164][0165]
(2)电泳检测结果：
[0166]
以样7为羊源性成分对照品，对样1～5、样8进行羊源性成分鉴别，对 照品的限制性内切酶酶切反应液应分别在202bp及91bp处各有一条dna 条带，供试品的限制性内切酶酶切反应液均无dna条带(见图3，泳道m： dna分子量marker(dl 500)；泳道1：羊源性成分对照品；泳道2：样1； 泳道3：样2；泳道4：样3；泳道5：样4；泳道6：样5；泳道7：样8。)。 结果显
示，6批样品均未检出羊源性成分。
[0167]
实施例4模板dna浓度对鉴别方法的影响
[0168]
取实施例1
‑
3中样1、样6基因组dna提取液，通过epoch超微量核 酸测定仪对核酸浓度进行测定，用水稀释至dna浓度分别为5、2.5、1.25、 0.62、0.31、0.16ng/μl，取样7基因组dna提取液，测定浓度后用水稀释 至dna浓度分别为5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.16、0.08、0.04ng/μl。将 上述dna稀释液分别作为供试品模板dna，按实施例1
‑
3方法分别进行牛、 猪及羊源性成分种属鉴别。
[0169]
结果显示，在进行牛源性成分鉴别时，当模板dna浓度在1.25～5ng/μl 时，在214bp及57bp处各有1条dna条带，当模板dna浓度小于1.25ng/μl 时，仅在214bp处有1条明显的dna条带(见图4，m：dna分子量marker (dl 500)；1：样1模板dna(5ng/μl)；2：样1模板dna(2.5ng/μl)； 3：样1模板dna(1.25ng/μl)；4：样1模板dna(0.62ng/μl)；5：样 1模板dna(0.31ng/μl)；6：样1模板dna(0.16ng/μl))；
[0170]
在进行猪源性成分鉴别时，当模板dna浓度在1.25～5ng/μl时，在196bp 及16bp处各有1条dna条带，当模板dna浓度小于1.25ng/μl时，仅在 196bp处有一条dna条带(见图5，m：dna分子量marker(dl 500)；1： 样6模板dna(5ng/μl)；2：样6模板dna(2.5ng/μl)；3：样6模板 dna(1.25ng/μl)；4：样6模板dna(0.62ng/μl)；5：样6模板dna(0.31 ng/μl)；6：样6模板dna(0.16ng/μl))；
[0171]
在进行羊源性成分鉴别时，当模板dna浓度在0.16～5ng/μl时，在202bp 及91bp处各有1条dna条带，当模板dna浓度小于0.16ng/μl时，仅在 202bp处有1条dna条带(见图6，m：dna分子量marker(dl 500)；1： 样7模板dna(5ng/μl)；2：样7模板dna(2.5ng/μl)；3：样7模板 dna(1.25ng/μl)；4：样7模板dna(0.62ng/μl)；5：样7模板dna(0.31 ng/μl)；6：样7模板dna(0.16ng/μl)；7：样7模板dna(0.08ng/μl)； 8：样7模板dna(0.04ng/μl))。
[0172]
因此，当模板dna浓度在1.25～5ng/μl时，对牛、猪及羊源性成分种 属鉴别均无影响。
[0173]
实施例5 pcr扩增条件对鉴别方法的影响
[0174]
在进行pcr扩增条件考察中，除以下pcr扩增条件不同外，其他条件 均与实施例1
‑
3方法相同，分别进行牛、猪及羊源性成分种属鉴别。
[0175]
pcr扩增条件分别为：94℃预变性5分钟，94
‑
95℃变性30秒、55
‑
59℃ 退火30秒，72℃延伸30秒、循环35次，72℃延伸5min，4℃保温结束反 应。其中退火温度是pcr扩增条件最重要的影响因素，所以主要对退火温 度点进行考察：选取了55、56、57、58、59℃分别退火30秒，其他条件不 变。
[0176]
实验结果：参见图10。
[0177]
结果显示，在进行牛源性成分鉴别时，当退火温度在55℃、56℃、57℃、 58℃、59℃时分别会扩增出相应的特异性条带，但是条带亮度57℃时最佳， 59℃时亮度最弱(见附图10)。
[0178]
因此，pcr扩增条件的退火温度在57℃时特异性条带最亮，浓度最大。
[0179]
实施例6酶切反应条件对鉴别方法的影响
[0180]
在进行酶切反应条件的考察中，除以下酶切反应条件不同外，其他条 件均与实施例1
‑
3方法相同，分别进行牛、猪及羊源性成分种属鉴别。
[0181]
酶切反应条件分别为：37℃60
‑
120min，65℃5
‑
20min，4℃保温结束反 应；其中37℃属于酶切温度是酶切的最重要影响因素，65℃为抑制酶切反 应的温度，所以对其酶切时间进行考察，分别为60min、80min、100min、 120min，其他条件优先选取65℃20min，以保证反应结束。
[0182]
实验结果：参见图11。
[0183]
结果显示，在进行牛源性成分鉴别时，当酶切条件分别为60min、80min、 100min、120min时，特异性条带亮度基本一致(见附图11)。
[0184]
因此，考察酶切条件对鉴别方法的影响时，因为60
‑
120min各个条件点 影响不大，所以从优化试验条件考虑，选取37℃60min。
[0185]
实施例7小牛血清动物源性成分鉴别方法的专属性
[0186]
实验方法：
[0187]
样品：样1(牛源性成分对照品)，样6(猪源性成分对照品)，样7(样 源性成分对照品)
[0188]
将上述3种对照品，分别按实施例1
‑
3方法进行牛、猪、羊源性种属鉴 别。
[0189]
实验结果：进行牛源性成分种属鉴别时，牛源性成分对照品分别在 214bp及57bp处各有一条dna条带，猪、羊源性成分对照品均无dna条 带；在进行猪源性成分种属鉴别时，猪源性成分对照品分别在196bp及16bp 处各有一条dna条带，牛、羊源性成分对照品均无dna条带；在进行羊 源性成分种属鉴别时，羊源性成分对照品分别在202bp及91bp处各有一条 dna条带，牛、猪源性成分对照品均无dna条带。
[0190]
结果表明，本方法具有专属性(见图7，m：dna分子量marker(dl 500)；1：猪源性成分对照品(5ng/μl)；2：牛源性成分对照品(5ng/μl)； 3：羊源性成分对照品(5ng/μl))。
[0191]
实施例8小牛血清对猪源性成分检测的影响
[0192]
为考察本方法对小牛血清中可能混入的猪源性成分的检出能力，分别 将小牛血清(样1)与猪血清(样6)按一定体积比例混合，配制了一系列 牛猪混合血清样品，使混合样品中猪血清的体积分别为样品总体积的50％、 10％、1％、0.1％、0.01％。按实施例2所述的方法，对混合样品中的猪源性 成分进行鉴别。
[0193]
结果显示，当混合样品中猪血清含量不小于1％时，本方法均可检测猪 源性成分(见图8，m：dna分子量marker(dl 500)；1：对照品；2：猪 源性成分50％；3：猪源性成分10％；4：猪源性成分1％；5：猪源性成 分0.1％；6：猪源性成分0.01％)。
[0194]
实施例9小牛血清对羊源性成分检测的影响
[0195]
为考察本方法对小牛血清中可能混入的羊源性成分的检出能力，分别 将小牛血清(样1)与羊血清(样7)按一定体积比例混合，配制了一系列 牛羊混合血清样品，使混合样品中羊血清的体积分别为样品总体积的50％、 10％、1％、0.1％、0.01％。按实施例3所述的方法，对混合样品中的羊源性 成分进行鉴别。
[0196]
结果显示，当混合样品中羊血清含量不小于1％时，本方法可检测羊源 性成分(见图9，泳道m：dna分子量marker(dl 500)；泳道1：羊源性 成分对照品；泳道2：羊源性成分50％；泳道3：羊源性成分10％；泳道4： 羊源性成分1％；泳道5：羊源性成分0.1％；泳道6：羊源性成分0.01％)。