LipR蛋白及其编码基因在调控DHA和油脂合成中的应用的制作方法

lipr蛋白及其编码基因在调控dha和油脂合成中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及脂肪酸的生物合成领域。


背景技术：

2.二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，dha)是一种ω
‑
3多不饱和脂肪酸。dha作为大脑灰质的主要成分，对于胎儿大脑形成以及婴幼儿智力发育至关重要，还具有促进婴幼儿神经系统和视觉系统的发育、预防心血管疾病、抗癌、抗抑郁和预防和改善老人痴呆等多种功效。
3.破囊壶菌科(thraustochytrids)真菌的胞内油脂可占生物量的40～50％以上，其中，dha在总油脂中高达35％～45％。破囊壶菌科真菌具有可进行高密度发酵，生物量大和培养周期短的优点，因此，是非常理想的dha的来源生物。
4.产油微生物的油脂生物合成也受到微生物细胞内的多重调控，例如，转录调控因子通过感知环境中的碳氮源信号等直接或间接调控脂肪酸合成基因的表达。
5.尽管为提高微生物中dha的产量，研究者们在菌种选育、培养基优化和改进发酵工艺等方面进行了许多研究，但是微生物中dha的产量仍然不理想，依然对提高微生物合成dha的产量，尤其是通过调控因子调控微生物细胞内dha的表达存在着迫切的需求。


技术实现要素：

6.本发明提供了转录调控因子lipr及其编码基因，以及所述lipr及其编码基因在调控dha和油脂合成中的应用。本发明还涉及用于调节lipr表达的物质或方法在调控dha和油脂合成中的应用。进一步地，本发明涉及利用lipr及其编码基因和/或用于调节lipr表达的物质或方法合成dha和油脂的方法。
7.第一方面，本发明涉及分离的lipr蛋白，所述lipr蛋白选自：
8.(1)一种蛋白，所述蛋白与seq id no：1所示的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，并且具有lipr蛋白的活性；
9.(2)一种蛋白，所述蛋白由一种多核苷酸编码，所述多核苷酸在严格条件下与seq id no:1的编码序列或其互补序列杂交，并且具有lipr蛋白的活性；
10.(3)一种蛋白，所述蛋白由一种多核苷酸编码，所述多核苷酸与seq id no:1的编码多核苷酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，并且具有lipr蛋白的活性；
11.(4)(1)，(2)或(3)的蛋白的一种变体，所述变体在一个或多个位置处包括一个或多个取代、缺失和/或插入，并且具有lipr蛋白的活性。
12.第二方面，本发明提供了编码第一方面的分离的lipr蛋白的多核苷酸。
13.第三方面，本发明提供了用于提高微生物中油脂含量的方法，所述方法包括使微生物基因组中的lipr基因表达下调或表达降低的步骤。
14.所述lipr基因表达下调可以是lipr基因被敲除、失活、缺失、阻断、敲低或者表达受到抑制，使得所述微生物下调表达lipr蛋白或不表达lipr蛋白。
15.在一些实施方式中，所述lipr基因表达下调可以基于同源重组的基因打靶方法实现，也可通过crispr系统或其它任何基因敲除或阻断的方法实现，也可通过rnai的手段敲低所述基因的表达实现。
16.在一些实施方案中，通过双载体法的同源重组实现lipr基因表达下调，具体是通过pcr分别扩增所述基因的上下游片段，分别连接在抗性基因上，然后共转化所述微生物实现。
17.在一些实施方案中，所述微生物为产油微生物，例如，破囊壶菌科真菌。优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，破囊壶菌(thraustochytrium sp.),aurantiochytrium sp.，hondaea sp.,ulkenia sp.，monorhizochytrium sp.，或aplanochytrium sp.。更优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)。
18.在一些实施方案中，所述油脂为一种或者多种多不饱和脂肪酸(pufa)和/或饱和脂肪酸。优选地，所述一种或者多种pufa例如为二十二碳六烯酸(“dha”)，二十二碳五烯酸(“dpa”)和/或二十碳三烯酸。所述饱和脂肪酸例如为棕榈酸(“pa”)，花生酸(“ad”)和/或山俞酸。
19.优选地，所述微生物为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，所述油脂为dha。更优选地，所述微生物为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，所述油脂为dha。
20.微生物基因组中的lipr基因表达下调还可以上调脂肪酸合成酶基因的转录。所述脂肪酸合成酶包括但不限于pfa1、pfa2、pfa3和fas。fas基因属于饱和脂肪酸合成酶基因。pfa1、pfa2和pfa3基因属于不饱和脂肪酸合成酶基因。
21.本技术中，lipr基因敲除突变株中pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录水平明显上调，其中饱和脂肪酸合成酶基因fas基因上调了6倍以上，而长链不饱和脂肪酸合成酶基因pfa1、pfa2和pfa3均上调了12倍以上。这与lipr基因敲除突变株中dha产量增长比例高于总油脂增长比例相一致，表明lipr蛋白通过负调控pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录影响裂殖壶菌的dha和其他油脂的合成，而且对dha的合成有更显著的调控作用。
22.第四方面，本发明提供了构建油脂含量提高的微生物的方法，所述方法包括使微生物基因组中的lipr基因表达下调或表达降低。
23.所述lipr基因表达下调可以是lipr基因被敲除、失活、缺失、阻断、敲低或者表达受到抑制，使得所述微生物下调表达lipr蛋白或不表达lipr蛋白。
24.在一些实施方式中，所述lipr基因表达下调可以基于同源重组的基因打靶方法实现，也可通过crispr系统或其它任何基因敲除或阻断的方法实现，也可通过rnai的手段敲低所述基因的表达实现。
25.在一些实施方案中，通过双载体法的同源重组实现lipr基因表达下调，具体是通过pcr分别扩增所述基因的上下游片段，分别连接在抗性基因上，然后共转化所述微生物实现。
26.在一些实施方案中，所述微生物为产油微生物，例如，破囊壶菌科真菌。优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，破囊壶菌(thraustochytrium sp.),aurantiochytrium sp.，hondaea sp.,ulkenia sp.，monorhizochytrium sp.，或
aplanochytrium sp.。更优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)。
27.在一些实施方案中，所述油脂为一种或者多种多不饱和脂肪酸(pufa)和/或饱和脂肪酸。优选地，所述一种或者多种pufa例如为二十二碳六烯酸(“dha”)，二十二碳五烯酸(“dpa”)和/或二十碳三烯酸。所述饱和脂肪酸例如为棕榈酸(“pa”)，花生酸(“ad”)和/或山俞酸。
28.优选地，所述微生物为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，所述油脂为dha和/或dpa。更优选地，所述微生物为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，所述油脂为dha。
29.微生物基因组中的lipr基因表达下调还可以上调脂肪酸合成酶基因的转录。所述脂肪酸合成酶包括但不限于pfa1、pfa2、pfa3和fas。fas基因属于饱和脂肪酸合成酶基因。pfa1、pfa2和pfa3基因属于不饱和脂肪酸合成酶基因。
30.本技术中，lipr基因表达下调的突变株中pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录水平明显上调，其中饱和脂肪酸合成酶基因fas基因上调了6倍以上，而长链不饱和脂肪酸合成酶基因pfa1、pfa2和pfa3均上调了12倍以上。这与lipr基因敲除突变株中dha产量增长比例高于总油脂增长比例相一致，表明lipr蛋白通过负调控pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录影响裂殖壶菌的dha和其他油脂的合成，而且对dha的合成有更显著的调控作用。
31.第五方面，本发明提供了利用第四方面的方法获得的微生物。
32.第六方面，本发明提供了用于生产油脂的微生物，所述微生物基因组中的lipr基因表达下调或表达降低。
33.所述lipr基因表达下调可以是lipr基因被敲除、失活、缺失、阻断、敲低或者表达受到抑制，使得所述微生物下调表达lipr蛋白或不表达lipr蛋白。
34.在一些实施方式中，所述lipr基因表达下调可以基于同源重组的基因打靶方法实现的，也可是通过crispr系统或其它任何基因敲除或阻断的方法实现的，也可是通过rnai的手段敲低所述基因的表达实现的。
35.在一些实施方案中，通过双载体法的同源重组实现lipr基因表达下调，具体是通过pcr分别扩增所述基因的上下游片段，分别连接在抗性基因上，然后共转化所述微生物实现的。
36.在一些实施方案中，所述微生物为产油微生物，例如破囊壶菌科真菌。优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，破囊壶菌(thraustochytrium sp.),aurantiochytrium sp.，hondaea sp.,ulkenia sp.，monorhizochytrium sp.，或aplanochytrium sp.。更优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)。
37.在一些实施方案中，所述油脂为一种或者多种多不饱和脂肪酸(pufa)和/或饱和脂肪酸。优选地，所述一种或者多种pufa例如为二十二碳六烯酸(“dha”)，二十二碳五烯酸(“dpa”)和/或二十碳三烯酸。所述饱和脂肪酸例如为棕榈酸(“pa”)，花生酸(“ad”)和/或山俞酸。
38.优选地，所述微生物为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，所述油脂为dha和/或dpa。更优选地，所述微生物为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，所述油脂为dha。
39.优选地，所述微生物基因组中脂肪酸合成酶基因的转录上调。所述脂肪酸合成酶包括但不限于pfa1、pfa2、pfa3和fas。fas基因属于饱和脂肪酸合成酶基因。pfa1、pfa2和pfa3基因属于不饱和脂肪酸合成酶基因。
40.本技术中，lipr基因敲除突变菌株中pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录水平明显上调，其中饱和脂肪酸合成酶基因fas基因上调了6倍以上，而长链不饱和脂肪酸合成酶基因pfa1、pfa2和pfa3均上调了12倍以上。这与lipr基因敲除突变株中dha产量增长比例高于总油脂增长比例相一致，表明lipr蛋白通过负调控pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录影响裂殖壶菌的dha和其他油脂的合成，而且对dha的合成有更显著的调控作用。
41.第七方面，本发明提供了利用第四方面的方法获得的微生物，第五方面的微生物或第六方面的微生物生产油脂的方法，所述方法包括培养所述微生物的步骤。
42.在一些实施方案中，所述微生物为产油微生物，例如，破囊壶菌科真菌。优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，破囊壶菌(thraustochytrium sp.),aurantiochytrium sp.，hondaea sp.,ulkenia sp.，monorhizochytrium sp.，或aplanochytrium sp.。更优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)。
43.在一些实施方案中，所述油脂为一种或者多种多不饱和脂肪酸(pufa)和/或饱和脂肪酸。优选地，所述一种或者多种pufa例如为二十二碳六烯酸(“dha”)，二十二碳五烯酸(“dpa”)和/或二十碳三烯酸。所述饱和脂肪酸例如为棕榈酸(“pa”)，花生酸(“ad”)和/或山俞酸。
44.优选地，所述微生物为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，所述油脂为dha和/或dpa。
45.第八方面，本发明提供了第五方面或第六方面的微生物在生产油脂中的应用。
46.在一些实施方案中，所述微生物为产油微生物，例如，破囊壶菌科真菌。优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，破囊壶菌(thraustochytrium sp.),aurantiochytrium sp.，hondaea sp.,ulkenia sp.，monorhizochytrium sp.或aplanochytrium sp.。更优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)。
47.在一些实施方案中，所述油脂为一种或者多种多不饱和脂肪酸(pufa)和/或饱和脂肪酸。优选地，所述一种或者多种pufa例如为二十二碳六烯酸(“dha”)，二十二碳五烯酸(“dpa”)和/或二十碳三烯酸。所述饱和脂肪酸例如为棕榈酸(“pa”)，花生酸(“ad”)和/或山俞酸。
48.优选地，所述微生物为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，所述油脂为dha和/或dpa。更优选地，所述微生物为裂殖壶菌(schizochytrium sp.)，所述油脂为dha。
49.本发明获得的敲除seq id no:2所示lipr蛋白的编码基因的裂殖壶菌突变株经摇瓶发酵5天后，与野生型菌株相比，敲除突变株的dha产量和总油脂产量显著高于野生型，分别比出发菌株提高了45％和34％；敲除突变株中dha和油脂合成酶基因的转录显著增强；emsa结果显示lipr蛋白可以直接与dha和油脂合成酶基因的启动子区结合，通过直接负调控dha和油脂合成酶基因的表达而调控dha和油脂的合成。说明seq id no：1所示转录调控因子lipr具有直接调控dha和总油脂合成的功能。本发明在dha和油脂合成调控研究和微生物育种方面具有重要意义。
50.名词解释：
51.锌指蛋白广泛存在于真菌、酵母、植物和动物体内，是真核生物中最主要的转录调控因子家族之一，根据cys和his残基的数目，可以分为cys2/his2(c2h2)，c3h，c3hc4和c2hc5等类型。其中，c2h2锌指蛋白占酵母菌全部基因的0.8％，在酵母菌和丝状真菌的生长、发育、次
级代谢和胁迫响应中起重要调控作用。例如，在酵母菌和丝状真菌中，c2h2调控因子mig1/mig2/mig3及其同源蛋白crea/cre1，是介导葡萄糖阻遏效应的关键调控因子。在有葡萄糖存在时，mig1等通过阻遏二级碳源利用及代谢相关基因的表达介导葡萄糖阻遏。在子囊菌中，两种c2h2锌指蛋白clr
‑
1和clr
‑
2是主要的纤维素酶基因和大部分半纤维酶基因的诱导表达所必需的。c2h2调控因子mtfa调控构巢曲霉的次级代谢和形态分化。本发明首次发现，c2h2锌指蛋白lipr在dha和油脂合成中的显著调控作用。
52.lipr是本发明通过转录组分析发现的在油脂大量合成阶段表达显著下调的调控因子，并且经验证是油脂合成的负调控蛋白。经基因敲除、emsa和rt
‑
qpcr等鉴定该调控因子直接调控裂殖壶菌中dha和油脂的合成，因此，根据其功能将其命名为lipr。lipr是现有技术中未知的调控因子，到目前为止尚未有关于其同源蛋白的相关报道。
附图说明
53.图1为本发明实施例2的lipr基因敲除突变株的构建流程图及其pcr验证。
54.图2为本发明实施例5的转录调控因子lipr与饱和脂肪酸合成酶基因fas和长链不饱和脂肪酸合成酶基因(pfa1、pfa2和pfa3)的启动子区结合的emsa结果。
具体实施方式
55.以下实施例用于更好地理解本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
56.实施例1裂殖壶菌lipr基因的克隆
57.通过转录分析，发现schizochytrium sp.(atcc20888)中一个可能的c2h2锌指蛋白编码基因(seq id no:2)的转录水平在dha和油脂大量合成阶段显著下调，该基因在第4天(油脂大量合成阶段)的转录水平仅为第2天(油脂开始合成阶段)的0.227倍。该基因预测编码一个466aa的c2h2锌指蛋白(seq id no:1)，将其命名为lipr。根据该序列，设计pcr引物5
′‑
atgatgcagcagcagcag
‑3′
和5
′‑
ttaagggctgctcgacat
‑3′
，从schizochytrium sp.(atcc20888)的cdna中扩增了lipr的开放阅读框。扩增产物经测序后，发现与基因序列完全一致，该基因无内含子。seq id no:1为schizochytrium sp.atcc20888的lipr蛋白的氨基酸序列。seq id no:2为schizochytrium sp.atcc20888的lipr基因的编码区。
58.实施例2利用同源重组构建lipr敲除突变株
59.1、裂殖壶菌lipr基因上下游片段的克隆
60.以schizochytrium sp.(atcc20888)的基因组dna为模板，根据lipr基因上下游序列信息设计引物，分别扩增lipr基因的上游相邻片段和下游相邻片段，所述引物组的序列如下：
[0061]5′‑
aggaagaacgcgacgaaa
‑3′
，和5
′‑
catacattatacgaagttatgcgggccccacttatgtt
‑3′
(用于扩增上游相邻片段)；
[0062]5′‑
ataacttcgtataatgtatgaaccccaccgaagacttt
‑3′
和5
′‑
taaatttatgcagagaat
‑3′
(用于扩增下游相邻片段)，(参见图1)。
[0063]
pcr反应条件：95℃，5min；(95℃，50s；60℃，50s；72℃，1min)
×
28个循环；72℃，
10min；25℃，1min。对pcr产物的电泳分析结果显示，分别在940bp和960bp处有特异性的预期大小的扩增条带。
[0064]
以质粒ppiczαa(invitrogen；美国)为模板，利用以下引物组pcr扩增ble抗性基因：
[0065]5′‑
ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatttttctctttc agtgacc
‑3′
；和
[0066]5′‑
ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattgagaaagc gccacgctt
‑3′
。pcr反应条件同上。电泳检测pcr产物，在1.2kb处有特异性的预期大小的扩增条带。
[0067]
电泳回收上述片段，经pcr产物纯化试剂盒纯化后，以lipr上游相邻片段和ble抗性基因为模板，利用以下引物进行融合pcr，得到lipru
‑
ble片段：
[0068]5′‑
aggaagaacgcgacgaaa
‑3′
；和5
′‑
ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttattgagaaagc gccacgctt
‑3′
。
[0069]
以lipr下游相邻片段和ble抗性基因为模板，利用以下引物组进行融合pcr，得到ble
‑
liprd片段(参见图1)：
[0070]5′‑
ataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatttttctctttc agtgacc
‑3′
；和
[0071]5′‑
taaatttatgcagagaat
‑3′
。
[0072]
pcr反应条件除延伸时间为2.5min外，其它条件同上。电泳回收纯化上述片段。
[0073]
2、裂殖壶菌的电转化
[0074]
将上述pcr扩增所获的分别带有ble抗性基因的lipr基因上游片段和下游片段通过电转化共同转入裂殖壶菌。
[0075]
本实施例选用裂殖壶菌(atcc20888)作为出发菌株。收集在种子培养基中培养到对数中后期的裂殖壶菌菌体，冰上放置20min；经预冷的无菌水清洗菌体，然后用1m山梨醇处理菌体；最后菌体重悬于1m山梨醇中。在80μl菌体中加入2μg的上下游片段，轻轻混匀，冰浴30min；将上述混合液转移到预冷的电击杯中，1.5kv，2.2s电击1～2次。电转化后的菌体中加入1ml种子培养基，在28℃，230rpm振荡培养4～6h，涂布于含40μg/ml博来霉素的gpy平板上，28℃培养3～4天，筛选转化子。
[0076]
3、lipr敲除突变株的获得
[0077]
在博来霉素平板上生长的转化子中lipr基因为ble抗性基因取代，该菌株命名为lipr::ble。将含有cre基因的质粒pjn44
‑
cre转入lipr::ble突变株中,通过cre重组酶作用于ble基因两段的loxp位点以消除抗性基因，获得lipr基因敲除菌株δlipr。对出发菌株和δlipr的pcr验证表明lipr基因已经被敲除。lipr基因敲除突变株的构建流程及其验证如图1所示。
[0078]
本实施例中裂殖壶菌的培养、感受态的制备及电转化、gpy和种子培养基的配制参见《裂殖壶菌氧化应激代谢通路的改造以提高二十二碳六烯酸产量》(黎朝晖.硕士学位论文，2019，中国农业大学)。
[0079]
实施例3在裂殖壶菌(atcc20888)中敲除lipr对dha和油脂合成的影响
[0080]
1、裂殖壶菌的摇瓶发酵
[0081]
将裂殖壶菌接种于种子培养基(每升：5g酵母膏，10g胰蛋白胨，20g海水晶，30g葡萄糖，ph7.0)，28℃，230rpm培养24h。以5％的接种量将种子液接种于发酵培养基(每升：2g酵母膏，5g谷氨酸钠，0.5g(nh4)2so4，0.26g kcl，10g nacl，1g kh2po4，100g葡萄糖，
0.5gmgso4.7h2o，0.04g cacl2.2h2o，ph6.7)，28℃，250rpm培养5天。
[0082]
2、dha和油脂的测定
[0083]
总油脂的提取采用酸热提取法(参见han et al.,2020：han x,zhao z,wen y,chen z.enhancement of docosahexaenoic acid production by overexpression of atp
‑
citrate lyase and acetyl
‑
coa carboxylase in schizochytrium sp.biotechnology for biofuels.2020,13:131)。收集50ml发酵液，8000rpm离心10min，弃上清。用滤纸包住管口，冷冻干燥至恒重。将菌体在液氮下研磨成粉末，在0.3g菌体粉末中加入6ml 4m hcl，放置30min；沸水浴8min，冰上冷却。加入16ml体积比为1:1的甲醇/氯仿，混匀，1000rpm离心10min；将有机层全部转移到10ml试管中，在通风处中挥发有机溶剂。待有机液体挥发尽后，称量总重，减去空试管重量即为总油脂重量。
[0084]
采用气相色谱法测定dha的产量和油脂的脂肪酸组成。取30mg油脂样品，加入1ml 0.5m koh甲醇溶液和1ml c19:0(1.0mg/ml)内标溶液；盖紧瓶盖置于65℃水浴反应15min；取出冷却后加入2.1ml甲醇和0.9ml 45％bf3
‑
乙醚溶液；盖紧瓶盖置于65℃水浴反应5min；取出冷却后加入1ml正己烷和2ml饱和氯化钠溶液；以1000rpm的速度离心10min。采用wufeng gc522气相色谱仪进行气谱分析，色谱柱：j&w db
‑
23(30m
×
0.25mm)；载气：氮气，流速2.0ml/min；分流比：30:1；程序升温：初始温度150℃，以4℃/min升温至200℃，保持1min，以4℃/min升温至230℃，保持9min，进样口：250℃，检测器：fid，260℃。
[0085]
3、在裂殖壶菌(atcc 20888)中敲除lipr基因促进dha和油脂的合成
[0086]
摇瓶培养发酵结果显示，敲除lipr基因对细胞的干重几乎没有影响。与出发菌株裂殖壶菌(atcc20888)的总油脂产量(12.0g/l)相比，lipr基因敲除突变株的总油脂产量为16.1g/l，提高了34.2％(表1)。lipr基因敲除突变株的总油脂含量由出发菌株(atcc20888)的51.7％提高到70.8％。
[0087]
表1裂殖壶菌atcc20888和lipr基因敲除突变株的发酵数据
[0088][0089]
lipr基因敲除突变株的dha产量为6.1g/l，比出发菌株的dha产量(4.2g/l)提高了45.2％(表1)。对lipr基因敲除突变株和出发菌株的脂肪酸组成进行分析发现，lipr基因敲除突变株的dha占总脂肪酸(tfas)的40.0％，比出发菌株的dha％(36.6％)稍高(表2)。以上结果表明在裂殖壶菌(atcc20888)中缺失lipr明显地促进了dha和总油脂的合成。
[0090]
表2裂殖壶菌atcc20888和lipr基因敲除突变株油脂的脂肪酸组成
[0091][0092]
实施例4在裂殖壶菌中敲除lipr基因促进dha和脂肪酸合成酶基因的转录
[0093]
在裂殖壶菌(atcc20888)中敲除lipr基因显著地促进了dha和油脂的合成。在裂殖壶菌中，dha和dpa的合成由长链不饱和脂肪酸合成酶(pfa1、pfa2和pfa3)催化，而饱和脂肪酸的合成由饱和脂肪酸合成酶fas负责。因为lipr是具有锌指结构的转录调控因子，可能在裂殖壶菌中起到调控相关基因转录的功能。因此，我们通过rt
‑
qpcr检测了lipr基因敲除突变株和出发菌株中饱和脂肪酸合成酶基因fas和长链不饱和脂肪酸合成酶基因(pfa1、pfa2和pfa3)的转录情况。
[0094]
分别提取总rna，反转录合成cdna第一链，以该cdna第一链为模板，采用以下引物组扩增基因fas的特异片段(99bp)：
[0095]
5'
‑
gcgaccaacaacacggac
‑
3'，和
[0096]
5'
‑
ctgggactccacaaatcc
‑
3'；
[0097]
采用以下引物组扩增pfa1基因的特异片段(141bp)：
[0098]
5'
‑
cgcctcggattcacttcg
‑
3'，和
[0099]
5'
‑
gccctgagcaatgtccac
‑
3'；
[0100]
采用以下引物组扩增pfa2基因的特异片段(134bp)：
[0101]
5'
‑
gacattcaccgcatttgg
‑
3'，和
[0102]
5'
‑
aactcttgctgctggctc
‑
3'；
[0103]
采用以下引物组扩增pfa3基因的特异片段(179bp)：
[0104]
5'
‑
acgataacgaccacaccc
‑
3'，和
[0105]
5'
‑
gtcagacacagacacggc
‑
3'；
[0106]
采用以下引物组扩增actin基因的特异片段(130bp)：
[0107]
5'
‑
gcgacatcaaggagaagc
‑
3'，和
[0108]
5'
‑
gaaggacggctggaagag
‑
3'；
[0109]
以作为内参进行实时定量分析。实时荧光定量pcr在实时荧光定量pcr仪applied biosystems 7500real time pcr system(abi,usa)上进行，一次平行试验设3次重复。利用livak kj和schmittgen td(2001)报道的方法，即2
‑
δct计算相对表达量。
[0110]
与出发菌株相比，lipr基因敲除突变株中pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录水平明显上调，其中饱和脂肪酸合成酶基因fas基因上调了6倍以上，而三种长链不饱和脂肪酸合成酶基因pfa1、pfa2和pfa3均上调了12倍以上(表3)。这也与lipr基因敲除突变株中dha产量增长比例高于总油脂增长比例相一致，表明lipr蛋白通过负调控pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录影响裂殖壶菌的dha和油脂合成，其中，对dha的合成有更强的调控作用。
[0111]
表3裂殖壶菌(atcc20888)和lipr基因敲除突变株中的dha和饱和脂肪酸合成酶基因的转录分析
[0112]
基因功能出发菌株(％)δlipr(％)fas饱和脂肪酸合成酶100631pfa1长链不饱和脂肪酸合成酶11001231pfa2长链不饱和脂肪酸合成酶21001386pfa3长链不饱和脂肪酸合成酶31002690
[0113]
实施例5转录调控因子lipr直接调控dha和饱和脂肪酸合成酶基因的转录
[0114]
蛋白lipr通过负调控pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录影响裂殖壶菌的dha和油脂合成，我们通过emsa检测了lipr是否通过结合到dha和饱和脂肪酸合成酶基因的启动子区而直接调控这些基因的转录。
[0115]
采用以下引物组扩增lipr基因的orf(1401bp)：
[0116]
5'
‑
cgggatccatgatgcagcagcagcag
‑
3'，和5'
‑
cccaagcttttaagggctgctcgacat
‑
3',
[0117]
克隆至pet
‑
28a( )上,获得蛋白表达质粒pet
‑
lipr。将表达载体在e.coli rosetta(de3)中进行表达。将大肠杆菌接种到含有卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基中，培养至od
600
达到0.4
‑
0.6时，加入iptg至终浓度为0.1mm,37℃，振荡培养3h。离心收集菌体，菌体重悬于lysis buffer(20mm tris,500mm nacl,5mm imidazole,5％glycerol,ph7.9)中。超声波破碎(200w,超声3s,间隔5s,破碎次数根据菌量确定)菌体。离心后，采用ni
‑
nta亲和层析(qiagen，德国)从上清中纯化lipr蛋白。emsas采用dig gel shift kit(roche)按照说明书进行。
[0118]
采用以下引物组扩增基因fas的启动子区片段(548bp)：
[0119]
5'
‑
gccggcggcgtctgcact
‑
3'，和
[0120]
5'
‑
ggagggggggggggcgcg
‑
3'；
[0121]
采用以下引物组扩增pfa1基因的启动子区片段(591bp)：
[0122]
5'
‑
tctccgcgtcccactctt
‑
3'，和
[0123]
5'
‑
tctggcgatgccgtcgcc
‑
3'；
[0124]
采用以下引物组扩增pfa2基因的启动子区片段(660bp)：
[0125]
5'
‑
ccgaggaggagcagcaag
‑
3'，和5'
‑
ttccgagcggccattttg
‑
3'；
[0126]
采用以下引物组扩增pfa3基因的启动子区片段(524bp)：
[0127]
5'
‑
cgacaaggccggcggcgt
‑
3'，和
[0128]
5'
‑
tctccctctcgtggctgc
‑
3'。
[0129]
将以上dha片段分别用地高辛(dig
‑
11
‑
ddutp)在3'端进行标记。dig标记的dna探针与his6‑
lipr蛋白在结合反应体系中25℃下孵育30min。可在结合体系中加入150倍的未标记的特异性探针和未标记的非特异性探针以检验结合的特异性。利用5％的非变性聚丙烯酰胺凝胶对结合蛋白的探针和游离探针进行分离，以0.5
×
tbe buffer为缓冲液,冰上100v恒压电泳1.5h。
[0130]
emsas结果(参见图2)显示，lipr蛋白可特异性地结合在长链不饱和脂肪酸合成酶基因pfa1、pfa2、pfa3和饱和脂肪酸合成酶基因fas基因的启动子区，表明lipr蛋白对以上基因的转录调控是直接调控的。结合对lipr基因敲除突变和出发菌株中相关基因的实时荧光定量pcr结果，表明lipr通过结合到dha和饱和脂肪酸合成酶基因的启动子区，阻遏这些基因的转录。而在裂殖壶菌中敲除了lipr基因，lipr蛋白不能表达，dha和饱和脂肪酸合成酶基因的转录处于脱阻遏状态，dha和饱和脂肪酸合成酶基因表达明显上调。而脂肪酸合成酶基因的大量转录则极大地促进了dha和其它油脂的合成。因为lipr对长链不饱和脂肪酸合成酶基因pfa1、pfa2、pfa3的调控作用更强，因此，敲除了lipr基因对dha合成的促进作用也更显著。
[0131]
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。