用于孕期维生素D缺乏风险评估检测试剂盒与应用方法与流程

用于孕期维生素d缺乏风险评估检测试剂盒与应用方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学，尤其是涉及基于maldi
‑
tof system(时间飞行质谱生物芯片系统)检测孕期维生素d相关位点多态性的引物，试剂盒和方法。


背景技术：

2.维生素d不仅是脂溶性维生素，还是机体重要的类固醇激素，其主要作用是促进小肠粘膜细胞对钙和磷的吸收，提高血钙、血磷浓度，有利于新骨生成和钙化，此外维生素d还有促进皮肤细胞生长、分化及调节免疫功能作用。
3.维生素d进入肝脏后，被25
‑
羟化酶(cyp2r1,cyp27a1,cyp3a4基因编码)转化成25
‑
羟基维生素d[25
‑
hydroxyvitamin d,25(oh)d]，因25(oh)d生物学活性低,在血液中需与维生素d结合蛋白(gc基因编码)结合而被转运至肾脏，其在肾脏1
‑
α羟化酶(cyp27b1基因编码)作用下转化成维生素d的活性形式1,25
‑
二羟维生素d[1,25
‑
hydroxyvitamin d,1,25(oh)2d],1,25(oh)2d与维生素d受体结合后可发挥多种生物学作用，而25(oh)d和1,25(oh)2d被24
‑
羟化酶(cyp24a1基因编码)降解排出体外，以保护靶器官或组织免受过量维生素d信号传导。近年来维生素d转运、代谢通路中相关基因多态性与维生素d水平和疾病易感性成为研究的热点。
[0004]
怀孕期间，孕妇的新陈代谢会发生多种生理变化，适量维生素d的补充，不仅对孕妇自身健康至关重要，与胎儿的健康发展也存在关联，临床研究提示，孕期维生素d缺乏将会增加发生先兆子痫、妊娠期糖尿病和剖宫产的几率，同时还会影响胎儿骨骼发展，增加低体重出生儿，儿童过敏的几率等。
[0005]
研究表明，由于维生素d代谢相关基因多态性的影响导致不同个体维生素d补充效果存在差异，因此本领域需要可以通过对维生素d基因多态性的筛查实现孕期个体化精准补充维生素d的方法。


技术实现要素：

[0006]
本发明的第一目的在于提供用于筛查孕期维生素d缺乏风险预测的引物组。
[0007]
本发明的第二目的在于为了解决现有的孕期维生素d缺乏风险预测产品中基因多态性测序价格昂贵的问题，提供基于maldi
‑
tof system(时间飞行质谱生物芯片系统)的用于孕期维生素d缺乏风险评估检测试剂盒。
[0008]
本发明的第三目的在于提供采用所述检测试剂盒筛查孕期维生素d缺乏风险的方法。
[0009]
所述用于筛查孕期维生素d缺乏风险预测的引物组，其用于扩增维生素代谢基因单核苷酸多态性(snp)位点；所述snp位点包括rs2228570、rs1544410、rs7975232、rs16846876、rs17467825、rs2282679、rs3755967、rs2298850、rs1155563、rs4588、rs7041、rs2298849、rs2242480、rs2246709、rs2209314、rs6013897、rs933994等；引物长度18～30bp。
[0010]
所述引物组可为seq id no：1～51所示。
[0011]
所述用于孕期维生素d缺乏风险评估检测试剂盒包括：
[0012]
1)如上所述的引物组；
[0013]
2)用于多重pcr的反应液，组分组成如表1所示；
[0014]
表1
[0015][0016]
采用所述检测试剂盒筛查孕期维生素d缺乏风险的方法，包括以下步骤：
[0017]
1)采集孕妇血液样品，提取基因组dna；
[0018]
2)采用引物组对基因组dna的目的片段进行pcr扩增，包括至少一次基因片段扩增、至少一次产物碱性磷酸酶处理和至少一次单碱基引物延伸反应扩增，得到扩增产物混合液；
[0019]
3)将扩增产物混合液通过树脂纯化得到扩增产物；
[0020]
4)采用massarray analyzer compac质谱检测扩增产物进行检测分析并输出结果。
[0021]
所述样品包括人体外周血。
[0022]
为了达到上述目的，本发明通过如下技术方案实现的：经过多重pcr扩增后的产物，加入snp序列特异延伸引物，在snp位点上，延伸1个碱基，不同基因型延伸不同碱基，而后用瞬时纳秒(10
‑
9s)强激光激发，在一非电场漂移区内按照其质荷比率得以分离，根据延伸碱基的质量不同在真空小管中飞行到达检测器时间不同来区分不同基因型。
[0023]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0024]
1、超高灵敏度：检测下限为0.4ng。
[0025]
2、超高灵活性：自行设计多重pcr，普通引物合成，通用试剂盒，芯片可分次使用，无需优化pcr条件，在标准条件即可快速建立新检测，从设计到结果仅需两天。
[0026]
3、高质量数据：全自动分析数据，完成基因分型报告，并赋予质谱获得样品状态及结果可信度分析。
[0027]
4、高pcr重数与转化成功率：10～36重pcr均能得到较好结果，最高可达40重；>95％的snp位点能用这个平台进行分析研究。
[0028]
5、高准确度：通过正反双向设计引物，能有效检测插入缺失indel和转位融合基
因，准确率>99.7％。
[0029]
6、高样本通量：每天可处理样品数3,000以上，100,000个基因分型。
[0030]
7、高性价比：同时测定10～40个snp位点，毋需荧光标记，耗材成本和样本用量很低。
[0031]
8、低dna样本量和质量要求：每组pcr反应只需10ng dna。
附图说明
[0032]
图1为位点rs2228570不同碱基的质谱聚类图。
[0033]
图2为位点rs1544410不同碱基的质谱聚类图。
[0034]
图3为位点rs7975232不同碱基的质谱聚类图。
[0035]
图4为位点rs16846876不同碱基的质谱聚类图。
[0036]
图5为位点rs17467825不同碱基的质谱聚类图。
[0037]
图6为位点rs2282679不同碱基的质谱聚类图。
[0038]
图7为位点rs3755967不同碱基的质谱聚类图。
[0039]
图8为位点rs2298850不同碱基的质谱聚类图。
[0040]
图9为位点rs1155563不同碱基的质谱聚类图。
[0041]
图10为位点rs4588不同碱基的质谱聚类图。
[0042]
图11为位点rs7041不同碱基的质谱聚类图。
[0043]
图12为位点rs2298849不同碱基的质谱聚类图。
[0044]
图13为位点rs2242480不同碱基的质谱聚类图。
[0045]
图14为位点rs2246709不同碱基的质谱聚类图。
[0046]
图15为位点rs2209314不同碱基的质谱聚类图。
[0047]
图16为位点rs6013897不同碱基的质谱聚类图。
[0048]
图17为位点rs933994不同碱基的质谱聚类图。
[0049]
图18为飞行时间质谱基本流程图。
具体实施方式
[0050]
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0051]
实施例1
[0052]
引物组合物的设计
[0053]
本发明基于gc基因、vdr基因、cyp3a4基因、cyp27a1基因和cyp24a1基因中筛选出了17个snp位点体系的优化选择，结合其snp位点体系的特点，设计pcr引物组合物用于扩增不同基因上包含17个snp位点的dna片段，引物长度范围多为20～35bp，pcr扩增产物长度为100～200bp之间，gc含量以40％～60％为宜并尽量避免引物本身产生发夹结构及5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的连续排列。另外，由于质谱检测采用的是多重pcr方法，同一反应体系内引物数量多，因此要格外注意引物间出现互补，需要绝对避免snp延伸引物3’端与其他引物超过3个碱基的互补，否则会出现非特异性延伸，极大干扰检测结果。此外，所设计的引物应与基因组中其他序列无明显同源性，防止出现错误的检测结果。前引物和后引物的5’端额外都有10bp长度的接头序列：acgttggatg，俗称“保护碱基”，保护碱基的序列使得pcr
引物的分子量增大，可以避免反应剩余的pcr引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。对于单碱基延伸引物设计原则为：引物扩增的第一个碱基即为待测碱基，而且避免发夹结构和重复核苷酸序列。
[0054]
本发明用于检测维生素d代谢相关基因为vdr(rs2228570、rs1544410、rs7975232)；gc(rs16846876、rs17467825、rs2282679、rs3755967、rs2298850、rs1155563、rs4588、rs7041、rs2298849)；cyp3a4(rs2242480、rs2246709)；cyp24a1(rs2209314、rs6013897)；cyp27a1(rs933994)
[0055]
所述引物组为seq id no：1～51所示。
[0056]
实施例2
[0057]
下面结合实施例1对本发明试剂盒用法进行详细描述，实施例2在本发明技术前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。
[0058]
s1：dna提取：
[0059]
1、样品处理：于200ul孕妇全血中加入2倍体积的buffer tbp，充分混匀，室温放置1min，直至红细胞完全裂解。8,000rpm，离心1min，弃上清。用500μl te buffer重悬沉淀，8,000rpm，离心1min，弃上清，用te buffer洗涤一次至沉淀为白色，再加入200μl pbs solution。
[0060]
2、加入20μl proteinase k，混匀。再加入200μl buffer dl，震荡混匀，56℃水浴10min。混合液变澄清透明为裂解完全。
[0061]
3、向上述离心管中加入200μl的无水乙醇，充分颠倒混匀。
[0062]
4、将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10,000rpm室温离心1min，倒掉收集管中废液。
[0063]
5、将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500μl gw solution，10,000rpm离心30s倒掉废液。
[0064]
6、将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入700μl wash solution，10,000rpm离心30s倒掉废液。
[0065]
7、重复步骤6一次。
[0066]
8.将吸附柱重新放回收集管中，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的wash solution。将吸附柱盖子打开于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的wash solution。
[0067]
9.取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50μl ce buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集dna溶液。
[0068]
s2：dna质量检测：
[0069]
1.取5μldna溶液1％琼脂糖、1x tae缓冲溶液电泳(电压120～180v)检测，单一条带说明dna完整无降解，有明显的条带说明浓度可以满足pcr要求；
[0070]
2.分光光度计检测浓度和纯度，取1μl检od值，od260/280在1.7～2.0，说明dna质量较好，小于1.7有蛋白污染，大于2.0有rna污染。
[0071]
s3：引物设计
[0072]
设计引物软件用sequenom公司genotyping tools及massarray assay design软件设计待测位点的pcr扩增引物及单碱基延伸引物。特异性扩增引物序列和单碱基延伸引
物序列见表5。
[0073]
1、引物长度18～30bp，pcr产物80～200bp；
[0074]
2、tm值55～65℃，退火温度60℃左右；
[0075]
3、gc含量40～70％；
[0076]
4、要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。
[0077]
s4:pcr扩增
[0078]
1、采用多重pcr技术，在384孔板中进行，每个反应体系的总体积是5μl，反应体系见表1。
[0079]
2、pcr反应条件:
[0080][0081]
s5：pcr产物碱性磷酸酶处理
[0082]
pcr反应结束后，将pcr产物用sap(shrimp alikaiinephosphtase虾碱性磷酸酶)处理，除去反应中的dntps，按表2次序配制sap反应液(以384个样本为例)
[0083]
表2 sap反应液组分组成。
[0084][0085]
注：以上384孔反应液有4％过量。
[0086]
1、取一排12联管，将sap反应液以每孔66μl分装，短暂离心后，用10μl排枪分装于384孔pcr反应板，每孔加2μl，封膜、离心。
[0087]
2、将已加入sap反应液的384孔板放入pcr仪中，运行名为“sap”的反应程序。
[0088]
3、sap程序：37℃,40min；85℃,5min；4℃,forever。
[0089]
4、反应结束，将384孔板取出短暂离心备用。
[0090]
s6：延伸反应
[0091]
按表3配制iplex反应试剂。
[0092]
表3 iplex反应试剂。
[0093][0094][0095]
注：以上384孔反应液有4％过量。
[0096]
1、取一排12联管，将iplex反应液以每孔66μl分装，短暂离心后，用10μl排枪分装于384孔pcr反应板，每孔加2μl，封膜、离心。
[0097]
2、将已加入iplex反应液的384孔板放入pcr仪中，运行名为“extension”的反应程序。
[0098][0099]
3、反应结束，将384孔板取出短暂离心备用。
[0100]
s7：产物纯化
[0101]
1、取6mg树脂在384孔树脂刮板上，均匀覆盖，刮去多余的树脂，放置20min。
[0102]
2、将反应结束的384孔板1000rpm离心1min，每孔加入25μl去离子水，倒置在树脂板上面(注意固定，不能移位)，然后反置将树脂板扣在384孔板上，敲击使树脂落入384孔板，封膜。
[0103]
3、以384孔板的长轴为轴心，翻转384孔板20min，3500rpm、5min离心后备用。
[0104]
s8：质谱检测
[0105]
1、nanodispenser spectrochip芯片点样，将检测样品从384孔反应板转移到表面覆盖基质的massarrayspectrochip芯片。
[0106]
2、massarray analyzer compac质谱检测。
[0107]
3、将样品转移到spectrochip芯片后，即可放入质谱仪进行检测，每个检测点只需3～5s，全自动分析。
[0108]
4、typer软件分析实验结果，获得分型数据(参见图1～17)。
[0109]
实施例3：
[0110]
为了验证本试剂盒能够准确检测5个基因的17个snp位点多态性，对10个已使用本
发明所涉及的试剂盒检测过的待测样品同时进行一代测序验证。
[0111]
一代测序结果与使用本发明所涉及的试剂盒的检测结果一致(见表4)，表明本发明能够准确检测相应snp位点的多态性。
[0112]
表4：两种检测方法结果对比：
[0113]
[0114][0115]
*
专利：使用本发明所涉及的试剂盒检测结果；
[0116]
#
一代：一代测序结果。
[0117]
表5：引物组序列
[0118]
[0119][0120][0121]
本发明所述的maldi
‑
tof system(时间飞行质谱生物芯片系统)是
由美国西格诺公司(sequenom,inc.)独家研制并生产的基因分型检测系统，也是目前唯一采用飞行时间质谱的原理直接进行snp分型检测的设备。其主要特点是：经过多重pcr扩增后的产物，加入snp序列特异延伸引物，在snp位点上，延伸1个碱基，不同基因型延伸不同碱基，而后用瞬时纳秒(10
‑9s)强激光激发，在一非电场漂移区内按照其质荷比率得以分离，根据延伸碱基的质量不同在真空小管中飞行到达检测器时间不同来区分不同基因型，基本流程如图18所示。
[0122]
本发明所述的孕期维生素d缺乏风险预测的检测试剂盒，包括引物组和多重pcr反应液，能够对目的基因进行单管多重pcr基因扩增并纯化，使用方便，实用性好，对纯化后的pcr产物进行时间飞行质谱生物芯片检测，不涉及探针、荧光标记和凝胶电泳等手段，检测准确、快速，性价比高，更适合进行较全面的孕期维生素d缺乏风险预测。