一种生物样本核酸释放保存剂的制作方法

1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种新型的无需进行后续核酸提取又能直接用于检测的保存剂且裂解后所释放的样本核酸（包括dna与rna）可以稳定的长期保存的保存剂及制备方法。


背景技术：

2.核酸是指脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子聚合物，是生命的最基本物质之一，是所有已知生命形式必不可少的组成物质，是所有生物分子中最重要的物质，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，核酸由核苷酸组成，而核苷酸单体由五碳糖、磷酸基和含氮碱基组成；如果五碳糖是核糖，则形成的聚合物是rna；如果五碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是dna。
3.近年来，核酸检测在各个领域的应用越来越多，经常涉及处理各种样本（包括：组织、鼻拭子、咽拭子、血液、血清、唾液、尿液等)检测和基因扩增。通常情况下，人们利用各种品牌的核酸提取试剂盒来实现上述各种样品的处理以及核酸的提取。
4.核酸检测具有高灵敏度和高特异性的天然优势，样本中核酸的提取、纯化和保存直接影响下游的检测质量，利用核酸提取试剂盒提取一个样品核酸，不仅耗时长，操作步骤繁琐，而且消耗的费用也不低。
5.目前已有几种用于直接处理检测样本而无需提纯核酸的试剂面世，申请号202010130611.3公布了一种可以裂解样本的试剂，搭配其独有的pcr试剂，可以直接检测其中病毒核酸。申请号为201510973871.6的专利同样也是公布了一种可以直接检测常见样本类型中的病毒核酸的方法，其原理是通过蛋白质变性剂使得病毒外壳蛋白变性，从而释放出病毒核酸，然后再用特异性的引物和探针进行pcr检测。公开号为108823201b发明了一种rna核酸释放剂及其用应用，可以使样本中的rna释放出来，然后可代替胍盐或尿素，用于水煮法rna提取，简化了rna提取物在pcr之前的纯化过程。已经商业化应用的保存样本核酸的试剂，如赛默飞公司（thermofisher）的rnalater， rnalater中的样本rna可以在4℃下稳定保存一个月，室温下保存7天，但rnalater中的rna样本不能直接用于下游的pcr检测，必须经过繁琐的纯化步骤后才能进行pcr扩增。但是上述技术方案仍然存在如下问题。
6.上述技术方案主要用于检测病毒、细菌等，应用范围窄。
7.上述技术方案并没有提供一种样本经裂解释放出的核酸长期保存或运输的方法。
8.上述技术方案无法直接进行pcr扩增，还要进行传统的核酸纯化，操作繁琐。
9.综上可知，现有技术方案实际使用上显然存在明显缺陷与不便，可以实现直接扩增但不能长期保存核酸，可以长期保存核酸但是不能直接扩增，所以有必要加以改进。


技术实现要素：

10.为解决上述技术的不足，本发明的目的在于提供一种无需后续提取核酸又能直接用于检测保存的保存剂及其制备方法，不仅可裂解常见的检测样本（口腔拭子、咽拭子、阴
道拭子、肛拭子、血液、尿液，真菌等），而且能直接用于下游的pcr检测或高通量测序，同时，裂解后所释放的样本核酸（包括dna和rna）可以稳定的长期保存，其中，dna可以在室温条件下保存半年，2
‑
8℃下保存一年，
‑
20℃以下长期保存；rna则可以在室温条件下保存一个月，2
‑
8℃下保存半年，
‑
20℃以下长期保存；在质量控制上，未加入待测样本时本发明所述的生物核酸释放保存剂颜色为粉红色或葡萄紫色，加入样本经过完全处理后，则变成橙黄色或橙绿色，因此可以用肉眼得知样本是否被完全裂解并释放核酸，后续将处理后的样本加入pcr反应体系时，体系颜色又变成粉红色，同时可以对pcr的加样进行质量控制；使用该方法，耗时短，效率高，操作简便，生产成本低，保存时间长，极具市场推广价值。
11.为了实现上述目的，本发明“一种生物样本核酸释放保存剂”提供一种无需后续提取核酸又能直接用于检测保存的保存剂，该保存剂包含了的tween20（0.01%
‑
10%，v/v）、糖原（2
‑
500ng/μl）、甲酰胺（2
‑
500ng/μl）、人工合成的25nt的poly a（2
‑
500ng/μl）、氢氧化钾（0.01mm
‑
50mm），甲酚红（0.01%
‑
10%，质量/体积），溶剂为无核酸酶水。
12.根据本发明所述的一种生物样本核酸释放保存剂进行核酸释放，本发明还提供了一种核酸免提取试剂的使用方法，包括如下步骤。
13.取待测样本置于所述一种生物样本核酸释放保存剂中，混匀，得到混合溶液，按不同的操作方法，对混合溶液直接进行核酸检测。
14.根据本发明所述的一种生物样本核酸释放保存剂进行核酸释放，所述待测样本包括口腔拭子、咽拭子、阴道拭子、尿液、肛拭子、菌落、血液、真菌样本。
15.根据本发明所述的一种生物样本核酸释放保存剂进行核酸释放，所述操作方法包括：口腔拭子、咽拭子、阴道拭子、肛拭子浸没所述的一种生物样本核酸释放保存剂混匀；尿液样本经3000rpm/min离心后，弃上清，将尿残渣与0.5
‑
3ml所述的一种生物样本核酸释放保存剂混匀，血液与所述的一种生物样本核酸释放保存剂按照体积比1:24
‑
149的比例混匀；菌落挑起后与0.5
‑
3ml 的所述的生物核酸释放保存剂混匀再剧烈振荡40s即可。
16.根据本发明所述的一种生物样本核酸释放保存剂释放出的核酸（包括dna和rna）可以稳定的长期保存，其中，dna可以在室温条件下保存半年，2
‑
8℃下保存一年，
‑
20℃以下长期保存；rna则可以在室温条件下保存一个月，2
‑
8℃下保存半年，
‑
20℃以下长期保存。
17.根据本发明所述的一种生物样本核酸释放保存剂，通过各组分的特殊作用机理，能够在2℃
‑
30℃的温度范围内具有较强的细胞裂解能力，作用后裂解不仅速度快，而且无需额外加热，无需后续核酸提取。
18.根据本发明所述的生物样本核酸释放保存剂，加样做pcr时可做质量控制，未加入样本时本发明所述的一种生物样本核酸释放保存剂颜色为粉红色或葡萄紫色，加入样本经过完全处理后，则变成橙黄色或橙绿色，因此可以用肉眼得知样本是否被完全裂解并释放核酸；同时，后续将处理后的样本加入pcr反应体系时，体系颜色又变成粉红色，同时可以对pcr的加样进行质量控制。
附图说明
19.图1为人口腔拭子β
‑
actin的核酸检测实验结果。
20.图2为人口腔拭子（样本a）在室温下（25℃）与人口腔拭子（样本a）在冰箱中（2℃～8℃）下释放出的核酸保存的情况检测结果。
21.图3为人口腔拭子（样本b）在室温下（25℃）与人口腔拭子（样本b）在冰箱中（2℃～8℃）下释放出的核酸保存的情况检测结果。
22.图4为人口腔拭子（样本c）在室温下（25℃）与人口腔拭子（样本c）在冰箱中（2℃～8℃）下释放出的核酸保存的情况检测结果。
具体实施方式
23.以下具体实施方式进一步阐明本发明“一种生物样本核酸释放保存剂”的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、条件、步骤及应用所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
24.本发明“一种生物样本核酸释放保存剂”提供一种无需后续提取核酸又能直接用于检测保存的保存剂，该保存剂包含了的tween20（0.01%
‑
10%，v/v）、糖原（2
‑
500ng/μl）、甲酰胺（2
‑
500ng/μl）、人工合成的25nt的poly a（2
‑
500ng/μl）、氢氧化钾（0.01mm
‑
50mm），甲酚红（0.01%
‑
10%，质量/体积），溶剂为无核酸酶水。
25.本发明使用浓度范围为0.01%
‑
10%的tween20作为主要的细胞裂解物，作为一种温和的表面活性剂，它可以使细胞膜、核膜、线粒体膜以及叶绿体膜崩解，进而释放出内含物，同时又不会使蛋白质变性，有利于保证下游的pcr中酶的活性不受影响；因tween20作用十分温和，也会使细胞内的脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶保持活性。
26.为了保证dna和rna不会受到降解，我们创新性得向释放剂内添加了糖原、甲酰胺以及人工合成的25nt的poly a，浓度均为2
‑
500ng/μl范围内，这三种保护剂的作用有以下三个：可以竞争性得抢夺rnase，从而保护目标rna；保护目标rna不受管壁静电的吸附，保证其有效浓度始终不变；甲酰胺还是pcr扩增的促进剂，可以促进pcr反应。
27.另外，为了进一步增加该溶液系统的稳定性和崩解细胞壁（真菌）的效率，该试剂内还有0.01mm
‑
50mm浓度的氢氧化钾，在碱性环境中，真菌的细胞壁更加容易破壁，从而释放出核酸物质。
28.为了能实现质量控制，我们添加了浓度为0.01
‑
10%甲酚红的指示剂，未加入样本时本释放剂颜色为粉红色或葡萄紫色，加入样本经过完全处理后，则变成橙黄色或橙绿色，因此可以很明显得用肉眼得知样本是否被完全裂解并释放核酸；同时，后续将处理后的样本加入pcr反应体系时，体系颜色又变成粉红色。
29.为了验证本发明一种生物样本核酸释放保存剂的效果，本发明还进行如果若干实施例，各实施例的检测结果见图1，图2，图3，图4。
30.实施例1：人口腔拭子β
‑
actin的核酸检测。
31.一、检测方法包括如下步骤。
32.步骤一。
33.取一个人的口腔拭子一枚，将拭子直接伸入到1ml的本样本释放剂中，上下颠倒几次待试剂颜色由葡萄紫变成橙绿色后弃掉拭子，得到混匀溶液。
34.步骤二。
35.分别取2μl、4μl和8μl的处理后样本配置qpcr体系，每个体积的样本做三个平行实验，fam通道检测人β
‑
actin的mrna，该引物设计（人β
‑
actin mrna的检测引物和探针：hb
‑
fcgagcacagagcctcgc；hb
‑
rcatcatccatggtgagctgg ；hb
‑
pfam
‑ꢀ
atccgccgcccgtcca
ꢀ‑
mgb）
为跨内含子引物，只能特异性的扩增人β
‑
actin的mrna，而不能扩增其编码dna。
36.二、pcr扩增。
37.检测设备abi 7500，反应条件为：50℃条件作用下反应5min，95℃条件作用下反应2min;在95℃条件作用下反应10s, 在60℃条件作用下反应30s,并进行45个循环，于60℃下采集荧光。
38.三、实验结果。
39.参见图1，可见，本发明的一种生物样本核酸释放保存剂有优异的裂解释放作用，而且随着释放剂加入量成倍的增加，pcr的ct也按照1个递减，说明该释放剂对pcr没有抑制作用。
40.实施例2：人口腔拭子人口腔拭子在室温下（25℃）与在冰箱中（2℃～8℃）下释放出的核酸保存的情况检测结果。
41.步骤一。
42.取不同三人的口腔拭子（样本a、样本b、样本c），将不同样本的拭子分别直接伸入到不同的1ml的本样本释放剂中，上下颠倒几次待试剂颜色由葡萄紫变成橙绿色后弃掉拭子，得到混匀溶液,将每个样本平均分成两份，一份置于室温（25℃），另一份置于2
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8℃的冰箱中。
43.步骤二。
44.分别与第1天、第2天、第3天直至第15天按照示例一步骤二和pcr扩增方法对其进行pcr检测。
45.三、实验结果。
46.参见图 2，图 3，图4，可见，本发明室温下（25℃）与在冰箱中（2℃～8℃）下释放出的核酸保存的情况相差不大，说明本发明在常温下可保存核酸样本15天，该条件符合实际生活需求。
47.综上所述，本发明的目的在于提供一种无需后续提取核酸又能直接用于检测保存的保存剂及其制备方法，不仅可裂解常见的检测样本（口腔拭子、咽拭子、阴道拭子、肛拭子、血液、尿液、真菌等），而且能直接用于下游的pcr检测或高通量测序，同时，裂解后所释放的样本核酸（包括dna和rna）可以稳定的长期保存，其中，dna可以在室温条件下保存半年，2
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8℃下保存一年，
‑
20℃以下长期保存；rna则可以在室温条件下保存一个月，2
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8℃下保存半年，
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20℃以下长期保存；在质量控制上，未加入待测样本时本发明所述的生物核酸释放保存剂颜色为粉红色或葡萄紫色，加入样本经过完全处理后，则变成橙黄色或橙绿色，因此可以用肉眼得知样本是否被完全裂解并释放核酸，后续将处理后的样本加入pcr反应体系时，体系颜色又变成粉红色，同时可以对pcr的加样进行质量控制；使用该方法，耗时短，效率高，操作简便，生产成本低，保存时间长，极具市场推广价值。
48.对于本领域的技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和构思，上述处理时间、 样本、温度可根据具体需要进行调整，而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍应属于本发明创造的保护范围内。