一种基于蜂巢芯片的检测棘球蚴不同虫种的试剂盒及检测方法与流程

mediated isothermal amplification，lamp）技术。该技术已成功地应用于sars、禽流感、hiv、h1n1流感等疾病的检测中，也广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断。该技术的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测可以通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，适合基层快速诊断。是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换dna聚合酶(bst dna polymerase)的作用下，60
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65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10^9～10^10倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在dna合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dntps)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。
6.由于环介导等温扩增反应不需要pcr仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。由于该技术灵敏度高，但存在一旦开盖容易形成气溶胶污染的问题，目前国内大多数实验室不能严格分区，假阳性问题比较严重。因此，本发明在降低污染方面进行改进，采用微流控体系集成在一个蜂巢芯片上，一方面便于高通量快速检测，另一方面锚定了引物在芯片上，具有微流控的毛细管而降低污染。在包虫检测中，目前仍停留在lamp的单管检测虫种，尚未进行固相载体制备相关的针对肠道原虫的基因芯片。本发明可以实现同时高效检测粪便样本中多个虫种鉴定。
7.

技术实现要素：

8.本发明要解决的技术问题之一在于提供一种两型包虫虫种高效检测基因芯片试剂盒。本发明以棘球绦虫常见的、危害严重的两个虫种即细粒棘球蚴和多房棘球蚴为研究对象，建立了一种快速，敏感，特异的检测试剂盒。
9.本发明要解决的技术问题之二在于提供一种细粒棘球蚴和多房棘球蚴这两种虫种的微流控偶联lamp的检测方法。两种包虫lamp的特异性引物合成，解决了进行多次pcr检测及电泳的繁琐步骤，一次反应可以达到同时检测多个基因，明确虫种的种类，大大减轻了工作量，缩短了检测时间，降低了检测成本，具备更大的发展趋势。
10.为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：在本发明的第一方面，提供一种基于蜂巢芯片的检测棘球蚴(echinococcosis)不同虫种的快速检测方法，其用于同时检测细粒棘球蚴病（echinococcosis granulosus, e.granulosus）和多房棘球蚴病（echinococcus multilocularis，e. multilocularis ），共计2种虫株，该试剂盒包括如下引物：细粒棘球蚴引物序列如seq id no.1-4所示；多房棘球蚴引物序列如seq id no.5-8所示。
11.作为本发明优选的技术方案，该试剂盒还包括lamp反应体系如下：
作为本发明优选的技术方案，所述引物冻干后固化到芯片上，制成蜂巢芯片；所述试剂盒还包括显色剂，例如，钙黄绿素等。
12.在本发明的第二方面，提供一种基于蜂巢芯片的检测棘球蚴不同虫种的方法，该方法包括如下步骤：（1） 引物设计与筛选；所述设计的引物序列为：所述的如seq id no.1-4所示的细粒棘球蚴引物序列；所述的如seq id no.5-8所示的多房棘球蚴引物序列；（2）质粒构建：采用基因合成作为模板，并构建质粒，作为验证；每个虫株具有各自的模板；（3）建立单管lamp方法，对所设计的引物进行lamp检测，得到有效的扩增引物；（4）按照步骤（3）的lamp反应条件进行基因芯片扩增特异性验证；（5）按照步骤（4）的lamp反应条件进行基因芯片灵敏性验证；（6）进一步采用所述引物进行体外的包囊验证；（7）采用所述引物进行实际样本的检测。
13.作为本发明优选的技术方案，步骤（2）具体为：所述细粒棘球蚴的模板质粒的核苷酸序列如seq id no.9-10所示；所述细粒棘球蚴的模板质粒的核苷酸序列如seq id no11所示。
14.作为本发明优选的技术方案，步骤（3）、步骤（4）和步骤（5）中，所述的lamp反应条件为：
以上混合后，放置pcr仪器的60度1小时，然后观察荧光，及电泳。
15.在本发明的第三方面，提供用于检测棘球蚴不同虫种的引物组，包括以下引物序列：细粒棘球蚴引物序列如seq id no.1-4所示；多房棘球蚴引物序列如seq id no.5-8所示。
16.在本发明的第四方面，提供所述的引物组在制备基于蜂巢芯片的检测棘球蚴不同虫种的试剂盒中的应用。
17.在本发明的第五方面，提供一种棘球蚴不同虫种的生物核酸检测方法，包括如下步骤: (1)将所述引物冻干后固化到芯片上，制成lamp微流控芯片；(2)选择合适的lamp反应体系，添加显色剂，加入芯片中；(3)反应结果通过肉眼或仪器判读。
18.作为本发明优选的技术方案，步骤（1）具体为：采用若干根毛细管组装至定制基座中进行固定形成lamp微流控芯片；然后，将所述引物溶于引物固定液，分别吸取针对不同靶标的引物固定液，按照预先设计好的排列顺序加入到毛细管芯片上所对应的毛细管反应孔中；留出两根毛细管，其中一根固定阳性对照引物组，作为阳性对照孔，最后一根不固定引物组，作为阴性对照孔；将毛细管进行干燥处理，使引物固定于毛细管内壁。
19.作为本发明优选的技术方案，步骤（2）具体为: 将待检测样本、lamp反应试剂及显色剂加入微阵列芯片的反应孔中，63℃反应1小时。
20.作为本发明优选的技术方案，步骤（3）中所述反应结果检测及数据分析具体为：
lamp反应结束后，通过紫外荧光检测芯片上所有反应孔的显色情况，在阳性对照孔显色，而阴性对照孔不显色的情况下，判读所检测结果为“阳性”或“阴性”。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1 本发明的检测2型棘球蚴绦虫的方法中，针对这两型棘球绦虫进行生物信息学分析，设计出可以同时区别出两型棘球绦虫的引物，可大大节约了时间成本，降低了操作难度。
22.2 本发明引物具有良好的特异性，可以区分两型棘球绦虫的靶标。
23.3 本发明引物具有良好的灵敏性，可以同时检测到5ng/μl的混合模板。其中a型的引物检测范围可以达到1pg/μl 级别的浓度。
24.4 本发明中蜂巢芯片检测方法可用于快速高效的检测出实际样本中的靶标，有利于方便快捷的进行棘球蚴感染的样本筛选。
25.5 本发明在降低污染方面进行改进，采用微流控体系集成在一个蜂巢芯片上，一方面便于高通量快速检测，另一方面锚定了引物在芯片上，具有微流控的毛细管而降低污染。
26.6 在包虫检测中，目前仍停留在lamp的单管检测虫种和在蜂巢芯片上制备包虫的两种类型的基因芯片，尚未进行固相载体制备相关的针对肠道原虫的基因芯片。本发明可以实现同时高效检测粪便样本中多个虫种鉴定。
27.通过各种验证表明本发明具有快速、敏感、特异性强的特点，解决了基层没有pcr仪检测和电泳的繁琐步骤，一次反应可以达到同时检测多个基因，明确虫种的虫种，大大减轻了工作量，缩短了检测时间，降低了检测成本，具备更大的发展趋势。
附图说明
28.图1是本发明实施例3中细粒棘球蚴（a型）的引物筛选lamp扩增结果示意图。图1中，1-10的引物来自自主设计，进行检验，1-5采用细粒棘球蚴（a型）模板作为检测样本，分别5组的测试引物检验，发现第四组有典型性阳性扩增；6-10采用多房棘球蚴（b型）模板作为检测样本，分别5组的测试引物检验，未发现典型性阳性扩增。在右侧的电泳图中1-10代表同上，m代表棉花模板，作为单管检测的反应体系阳性对照。
29.图2是本发明实施例3中多房棘球蚴（b型）的引物筛选lamp扩增结果示意图。图2中n1，p1代表采用阳性对照棉花mon88913的引物及引物加模板； n2，p2代表e-gm的引物及引物加模板； n3，p3代表em-o的引物及引物加模板；n4，p4代表em-n的引物及引物加模板。
30.图3 是本发明实施例4中基因芯片检测虫种间交叉反应（特异性）实验示意图。
31.图4是本发明实施例4中两型棘球绦虫的引物在单管测试中的灵敏性实验示意图。图4中m代表阳性对照棉花mon88913,1-5代表a型的引物浓度从10ng/μl、1ng/μl、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl，1
’-5’
代表b型的em-n引物浓度从10ng/μl、1ng/μl、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl。
32.图5是本发明实施例5中a和b型棘球绦虫的引物在蜂巢芯片中的灵敏性实验结果示意图。
33.图6是本发明实施例6中体外的包囊验证结果示意图。
34.图7是本发明实施例7中实验样本的检测结果示意图；图7中：1.阳性对照：棉花模板mon88913； 2.包囊em；3-8.eg。
35.具体实施方式
36.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
37.实验平台本发明依托的检测平台是上海交通大学提供的蜂巢芯片（平台），其具体内容参见专利申请号为201510901558.1，发明名称为一种基于毛细管微阵列的核酸高通量快速检测方法的发明专利申请公开的内容。该蜂巢芯片（平台）利用毛细管组装、浇铸、机械加工等方式加工出微阵列，内含若干亲水性垂直微管道，阵列的外表面采用化学方法进行超疏水性修饰；将若干组核酸扩增引物分别加入若干微管道中并干燥固定，将微阵列置于反应管中；然后利用特殊加样装置通过虹吸方式将核酸扩增反应组分一次性引入各微管道中，放入温控装置中进行扩增反应；通过在反应中连续测量或反应后一次测量微管道内的荧光信号分别实现实时检测和终点检测；扩增产物也可回收用于后续其它用途。该平台的优势是可在一次反应中快速方便地实现对多个核酸靶标的检测，在核酸多重检测、现场检测等领域有广泛的应用。
38.本发明中的蜂巢芯片（平台），可非常简单地在微小体系内实现核酸扩增试剂的快速并行进样及扩增反应的快速并行进行。相比较现有方法，有其特有的优点如，检测通量高、实验操作简单、样品耗费少、检测费用低、无需昂贵设备等。可以在传染病快速诊断、出入境检验检疫、转基因作物产品现场检测、食品水源微生物现场检测、犯罪现场证物鉴定及生物反恐等领域得到广泛的应用。
39.蜂巢芯片（平台）的具体检测方法为：（1）将若干组核酸扩增引物分别加入毛细管微阵列上的若干微管道中，干燥，方便核酸扩增引物附于微管道内壁，再将毛细管微阵列固定于透明反应管中；（2）将含有样品核酸的核酸扩增反应组分加入微管道中，形成核酸扩增体系，封住反应管口；（3）将装有核酸扩增体系的反应管置于控温条件下进行扩增反应；（4）通过对扩增反应连续荧光信号测量实现实时检测或对扩增反应结束后一次荧光信号测量实现终点检测。
40.其中，毛细管微阵列中若干个微管道以阵列方式贯穿排布于基底上，并且微管道端部有少部分露出基底表面；基底的上表面、微管道露出基底部分的外表面以及微管道底端内表面均为疏水性表面；所述疏水性表面可通过在相应表面涂覆一层疏水性涂料来实现。所述基底的材质包括塑料、玻璃、金属及其它高分子材料；其中，所述其它高分子材料如聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、橡胶等；微管道为亲水性毛细管，微管道露出基底的部分及微管道的底端表面为疏水的，而微管道本身的材质为亲水的。所述（1）加入具体指将核酸扩增引物溶于交联剂中后再加入微管道中；所述交联剂为以下三种混合液中的任意一种：
a、质量百分比为0.1-1％的壳聚糖的乙酸水溶液，ph为4.5-6.0；b、质量百分比为0.1-1％的明胶水溶液；c、质量百分比为0.05-5％的聚乙二醇水溶液。
41.所述（1）加入的反应组分具体指通过倒置虹吸方式将其引入各微管道中。倒置虹吸方式是指：将充满核酸扩增反应组分溶液的加样装置样品池朝下插入反应管中，核酸扩增反应组分与亲水性微管道内壁顶端接触后靠虹吸作用迅速充满亲水性管道，之后再移除加样装置。所述（4）测量可以是借助荧光检测设备或光度检测设备进行检测，也可以是通过肉眼辨别颜色或亮度差异，即每次测量前需用相应发射波长的光源照射微管道内反应物，再进行测量。所述方法中，（3）中的温控的装置及（4）的所述测量可集成于一个自动化装置，由软件程序控制其自动运行。所述方法既可以在单个反应管中单独实现，也可以在集成的8连管、96孔板或384孔板中并行实现。
42.该平台的优势是：（1）利用毛细管微阵列和亲疏水特性，采用特殊设计的加样装置可快速便捷地将反应液一次性加入多个微管道中，从而提高了一次检测的通量和检测效率；（2）采用微管道作为反应腔也大大减小了试剂样品用量，从而降低了检测成本；（3）适用于各种核酸高通量快速检测领域，如传染病快速检测、出入境检验检疫、食品安全和转基因检测、刑侦鉴定等。
43.实施例1 两型棘球蚴虫种的检测引物设计（1）依据生物信息学分析，分别采用不同的目标基因进行靶标设计。
44.（2）引物设计与筛选；细粒棘球蚴（a型）和多房棘球蚴（b型）引物序列为：a型的引物：b型的引物：实施例2 质粒构建；
鉴于实验样本的模板复杂度高，采用基因合成作为模板，并构建质粒，作为验证。
45.每个虫株具有各自的模板。
46.针对a型虫种：针对a型虫种：针对b型虫种：实施例3 建立单管lamp方法，对所设计的引物进行lamp检测，得到有效的扩增引物本实施例所采用lamp反应体系如下：以上混合后，放置pcr仪器的60度1小时，然后观察荧光，及电泳。
47.一、关于a型的引物筛选：包虫线粒体基因序列区域还含有多个基因，不仅包括nadh1、nadh5，还包括coi基因。现针对coi进行细粒棘球蚴的特异性引物设计。序列比对发现，该区域保守性太强，在多种虫中均存在高度同源的序列信息，特异性不够。因此，设计a引物5组，同时合成a型和b型的引物匹配长度模板。
48.检测策略：检测a型，采用a（seq id no.9）和b（seq id no.10）两种模板，证实是否具有特异性；如两者结果皆为阳性，则定义为通用型；如只有a模板阳性，则为a的特异性引
物。筛选引物具体见表1：表1如图1所示，检测a型，采用a（seq id no.9）和b（seq id no.10）两种模板；检测b型，采用b（seq id no.11）的模板。结果表明筛选到a和b的特异性引物各1组，采用质粒合成的模板检测有效，见表2。
49.表2二、关于b型的引物筛选线粒体序列在包虫具有分型基因的特异性，通过文献回顾发现针对nadh dehydrogenase subunit基因进行两种虫种的鉴别，因此把这两种虫种的nadh序列比对，发现两种虫种高度相似，无法区别；设计ab通用型鉴定引物1组，b型鉴定引物2组，一组来自文献，一组为自行设计引物。
50.检测策略：同时检测通用型及b型，如两者结果皆为阳性，则为b型；如通用型结果为阳性，b为阴性，则为a型。筛选引物具体见表3：表3
如图2所示，图2中n1，p1代表采用阳性对照棉花mon88913的引物及引物加模板； n2，p2代表e-gm的引物及引物加模板； n3，p3代表em-o的引物及引物加模板；n4，p4代表em-n的引物及引物加模板。通过表3获得多房棘球绦虫的有效检测引物。
51.实施例4 按照实施例3的lamp反应条件进行基因芯片扩增特异性验证（1）包囊的dna抽提采用天根的组织dna抽提试剂盒完成。
52.（2）芯片组成见表4：表4 注明：（1）检测指标 eg、em各三个孔，作为三个技术重复；（2）阳性、阴性对照各两个孔，两个技术重复。
53.（3）单管lamp的验证引物有效性所采用lamp反应体系如下：
以上混合后，放置pcr仪器的60度1小时，然后观察荧光，及电泳。
54.结果如图3所示，单一模板引物有效性测试（3反应）；分别利用模板eg-coi-template（阳性），em-coi-template（阴性），em-n-template（阳性）与芯片进行反应，检测引物在芯片上是有效性的。
55.实施例5 按照实施例4的lamp反应条件进行基因芯片灵敏性验证；（1）包囊的dna抽提采用天根的组织dna抽提试剂盒完成。
56.（2）单管lamp的验证引物有效性所采用lamp反应体系如下：
以上混合后，放置pcr仪器的60度1小时，然后观察荧光，及电泳。
57.结果：采用不同的模板浓度，进行灵敏度检测。sad1是该体系的阳性对照。发现a型的引物灵敏度可达1pg/μl，b型引物的检出灵敏度也可达到5ng/μl。
58.在单一管引物灵敏性测试，实验样本浓度设立如下：合成质粒模板稀释不同的浓度梯度反应，结果如图4所示，m代表阳性对照棉花mon88913,1-5代表a型的引物浓度从10ng/μl、1ng/μl、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl，1
’-5’
代表b型的em-n引物浓度从10ng/μl、1ng/μl、100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl。结果表明eg（a型引物）的检测灵敏度可达1 pg/μl，而em（b型引物）的检测灵敏度仅达到10ng/μl，说明本发明中设计的检测的两型虫种的引物灵敏度不同。如果把两型虫种的引物绑定在蜂巢芯片中检测，图5是本发明实施例5中a和b型棘球绦虫的引物在蜂巢芯片中的灵敏性实验结果示意图。我们可以发现，在5ng/ul浓度下，可以同时检测出两种棘球蚴绦虫虫种的阳性质粒模板，这也表明蜂巢芯片的使用可以提高em的检测灵敏度达到10 pg/μl。
59.实施例6 采用a型和b型的引物进行实验室验证。
60.以普通pcr已经扩增并经过测序获知的样本，采用本发明的检测引物对其dna进行检测，如图6所示发现本发明的特异引物均可检测出包囊的虫种类型。
61.棘球蚴在中间宿主体内播散可形成新的棘球蚴，所以从现场的中间宿主内脏中获得棘球蚴，进行a型和b型的验证。棘球蚴由囊壁和囊内容物（生发囊、原头囊、囊液等）组成，通过组织dna提取试剂盒购自使用天根生化科技有限公司血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)提取dna，按试剂盒说明书操作，-20℃保存。pcr mix购自bio-serve公司。
62.样本按照文献minoru nakao 等（mitochondrial genetic code in cestodes. molecular and biochemical parasitology, 2000, 111: 415
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424）和周正斌等（检测动物棘球蚴的3种pcr方法的比较，国际医学寄生虫病杂志，2011,38（3）：148-152）中的引物（表5）依照表6的反应体系和表7的反应程序进行实际样本中所感染的病原体确认。
63.表5： 半巢氏pcr引物验证实际样本半巢氏pcr反应体系相同表6，反应程序见表7。
64.表6：单管pcr扩增反应体系表7：半巢氏pcr循环参数pcr产物鉴定：取5μl pcr产物于2%琼脂胶上进行电泳分析（120v/40min）。
65.注意：每个样品至少用平行pcr扩增3次，每次均用阳性、阴性对照。获得的阳性检测样本进行测序证实为细粒棘球蚴和多房棘球蚴。
66.实施例7 采用a型和b型的引物进行实际样本的检测。
67.采用如下步骤:（1）lamp微流控芯片的制作及处理：将10根疏水化处理后的毛细管组装至定制基座中，并进行固定处理、备用；（2）引物固定：将实施例1中引物溶于引物固定液，分别吸取针对不同靶标的引物固定液，按照预先设计好的排列顺序加入到毛细管芯片上所对应的毛细管反应孔中；留出两根毛细管，其中一根固定阳性对照引物组，作为阳性对照孔，最后一根不固定引物组，作为阴性对照孔。将毛细管进行干燥处理，使引物固定于毛细管内壁；（3）芯片上的lamp反应：将待检测样本、lamp反应试剂及钙黄绿素通过辅助加样装置加入微阵列芯片的反应孔中，63℃反应1小时；（4）结果检测及数据分析：lamp反应结束后，通过紫外荧光检测芯片上所有反应孔的显色情况，在阳性对照孔显色，而阴性对照孔不显色的情况下，判读所检测结果为“阳性”或“阴性”。
68.以普通pcr已经扩增并经过测序获知的样本，采用本发明的检测引物对其dna进行检测，如图7所示发现3例经普通pcr验证的含有eg样本，经蜂巢芯片的eg引物检测，有66.7%的一致性（2/3）。每个样本采用两个复孔，即3和6、4和7、5和8是复孔。其中3和6中的eg样本检测结果不一致，分析可能由于核酸的降解。我们还需要后续大量样本进行验证。