复合型微生物菌剂及其制备方法和应用与流程

复合型微生物菌剂及其制备方法和应用
【技术领域】
1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及复合型微生物菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum f.sp.cubense)是引起植物枯萎病的致病菌之一，而香蕉枯萎病是目前香蕉种植过程中危害最为巨大的疾病，香蕉枯萎病的发生严重影响了香蕉植株的生长和香蕉产量，目前针对枯萎病普遍采用的是化学防治法，即通过化学药剂来实现对枯萎病的治疗，但是由于微生物变异快的特点，往往需要不定期更换化学药剂，当然，目前也有通过微生物菌剂的来防治香蕉枯萎病，例如可通过某些具有寄生、抗病功能的内生真菌或某些细菌分泌物具有抑菌功能的芽孢杆菌等。随着对微生物的进一步研究，越来越多的微生物菌株被发现在抑制枯萎病上有作用，但是，对于生物防治领域来讲，获得越多的具有抗病性的微生物丰富种质库是目前进行生物防治的第一步，为此，本领域的技术人员一直在不停的筛选新的具有良好抗病性的菌株，为后期的生物防治进行应用；在实际的生防菌应用过程中，本领域技术人员还发现，有些菌株随着施用时间的增加，对尖孢镰刀菌的抑制作用在减弱，为此，筛选新菌株，不同菌株交替使用显得更为必要。


技术实现要素：

3.鉴于上述内容，有必要提供一种能抑制尖孢镰刀菌生长，提高香蕉对香蕉枯萎病的抗性，加快香蕉挂果时间，降低香蕉枯萎病发病率的新菌株及对该菌株的应用。
4.为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
5.复合微生物菌剂，该菌剂包括菌株香蕉茎内生秆菌bacillus velezensis wxh1和/或土壤生防菌bacillus subtilis wxh2；所述香蕉茎内生秆菌bacillus velezensis wxh1其保藏编号为 gdmcc no.61657保藏于：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院 59号楼5楼，保藏日期为2021年05月11日；所述土壤生防菌bacillus subtilis wxh2其保藏编号为gdmcc no.61658保藏于：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100 号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年05月11日。
6.进一步的，所述复合微生物菌剂还包括酵母菌。
7.本发明还包括包含所述复合微生物菌剂的发酵剂；所述复合菌剂中：菌株香蕉茎内生秆菌bacillus velezensis wxh1、土壤生防菌bacillus subtilis wxh2和酵母菌按照质量比为 1
‑
2:1
‑
2:1
‑
3混合制得。
8.本发明还包括包含所述复合微生物菌剂的有机肥。
9.本发明还包括所述复合微生物菌剂在制备有机肥上的应用。
10.本发明还包括所述复合微生物菌剂在抑制尖孢镰刀菌生长、防治香蕉枯萎病、加快香蕉挂果时间和/或降低香蕉枯萎病患病土壤生物多样性上的应用。
11.本发明还包括一种所述有机肥的制备方法，所述方法为：将原料按照如下质量百分数称量各原料：40％木薯渣、30％牛粪、20％落叶、10％树枝，充分混匀后粉碎；然后按照
底料总质量的5％接种量添加所述的发酵剂(该发酵剂由菌株香蕉茎内生秆菌bacillus velezensiswxh1、土壤生防菌bacillus subtilis wxh2和安琪酵母菌按照质量比为1:1:1组成)；在常温下堆沤21d即得有机肥。
12.本发明还包括一种防治香蕉枯萎病发病率的施肥方法，所述方法为：在香蕉四叶期，按照20g/株的施肥量向香蕉根部施加所述的有机肥；所述施肥方法为：将有机肥铺满以香蕉植株为中心1米为半径的范围内。
13.本发明具有如下有益效果：
14.本发明的复合菌剂包括香蕉茎内生秆菌bacillus velezensis wxh1和土壤生防菌bacillussubtilis wxh2，这两株菌株是由申请人自行从香蕉的根围土壤中筛选得来的；经鉴定表明菌株 wxh1和菌株wxh2均有抑制尖孢镰刀菌生长的作用，能有效防治香蕉枯萎病、加快香蕉挂果时间的作用，将上述两菌剂制备成发酵剂添加到有机肥中，能有提高香蕉对枯萎病的抗病性，降低染病土壤的生物多样性，是一种能加快香蕉挂果、对香蕉枯萎病有防治作用的生防菌株。
【附图说明】
15.图1为本发明wxh1菌株在平皿上的形态图；
16.图2为本发明wxh2菌株在平皿上的形态图；
17.图3
‑
图4为本发明wxh1和wxh2菌株的系统发育树图；
18.图5为菌株wxh1和尖孢镰刀菌的平板拮抗实验图，图中：
①
为wxh1和尖孢镰刀菌(foc1) 的平板拮抗实验图；
②
为wxh1和尖孢镰刀菌(foc4)的平板拮抗实验图；a为未接种菌株 wxh1平皿的对照组，b为接种了菌株wxh1平皿的实验组；
19.图6为菌株wxh2和尖孢镰刀菌的平板拮抗实验图，图中：
①
为wxh2和尖孢镰刀菌(foc1) 的平板拮抗实验图；
②
为wxh2和尖孢镰刀菌(foc4)的平板拮抗实验图；a为未接种菌株 wxh1平皿的对照组，b为接种了菌株wxh1平皿的实验组；
20.图7为菌株wxh1和wxh2对尖孢镰刀菌(foc1)的抑制生长结果图；
21.图8为菌株wxh1和wxh2对尖孢镰刀菌(foc4)的抑制生长结果图；
22.图9为菌株wxh1和wxh2代谢产物对尖孢镰刀菌(foc1)的抑制孔板实验结果图；
23.图10为菌株wxh1和wxh2代谢产物对尖孢镰刀菌(foc4)的抑制孔板实验结果图；
24.图11为菌株wxh1和wxh2代谢产物对尖孢镰刀菌(foc1)的抑制结果图；
25.图12为菌株wxh1和wxh2代谢产物对尖孢镰刀菌(foc4)的抑制结果图；
26.图13为施加了实验组有机肥的香蕉田间种植结果图，图中，
①
为香蕉植株；
②
为香蕉茎秆解剖图；
③
为香蕉叶片图；
27.图14为施加了对照组有机肥的香蕉田间种植结果图，图中，
①
为香蕉植株；
②
为香蕉茎秆解剖图；
③
为香蕉叶片图；
28.图15为施加复合菌剂发酵有机肥对香蕉发病率的影响结果图；
29.图16为施加复合菌剂发酵有机肥对香蕉产量的影响结果图；
30.图17
‑
图18为土壤微生物alpha多样性分析结果图；其中图17为：alpha多样性chao1 类型；图18为alpha多样性中的shannon类型；
31.图19
‑
图20为土壤微生物门水平物种丰度和venn图的结果图；其中图19为：门水平
物种丰度多样性；图20为属水平物种丰度；
32.图21为土壤微生物beta多样性分析结果图；
33.图22为土壤微生物多样性种水平物种丰度的结果图；
34.图23为土壤微生物门水平三组样品的物种组成分析的结果图；
35.图24为土壤微生物多样性在属分类学水平上的系统进化树的结果图；
36.图25
‑
图27为土壤微生物多样性物种相关性网络图的结果图；
37.图28为土壤微生物bugbase表型分析的结果图；其中a图为门水平致病性预测b图为种属水平c图为致病性预测趋势d图为物种多样性阈值；
38.图29为挂果统计数据的结果图；
39.图30为平板对峙显微镜观察的结果图。
【具体实施方式】
40.本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
41.本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
42.实施例1：
43.本实施例筛选出两株对香蕉枯萎病有防治作用的杆菌，分别为：
44.香蕉茎内生秆菌bacillus velezensis wxh1，其保藏编号为gdmcc no.61657保藏于：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021 年05月11日。
45.土壤生防菌bacillus subtilis wxh2，其保藏编号为gdmcc no.61658保藏于：广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年05 月11日。
46.上述菌株于2019年从香蕉种植实验农场的香蕉根际土壤中采集。
47.对本实施例的微生物进行形态学分类和分子生物学鉴定具体如下：
48.1、菌株的形态学分类：
49.将菌株wxh1接种在lb培养基上，观察菌落形态特征，如图1所示该菌落在平皿上呈白色，菌落边缘光滑、中间凹陷，单菌落呈球状；将菌株wxh2接种在lb培养基上，观察菌落形态特征，如图2所示该菌落在平皿上呈白色，菌落边缘光滑，单菌落呈球状。
50.2、分子生物学鉴定
51.对上述菌株进行测序、验证：采用通用引物：5'
‑
cctacgggaggcagcag
‑
3'和 5'
‑
attaccgcggcgctgctgg
‑
3'对菌株的16s rrna基因序列进行扩增，然后通过与 genbank中的ezbiocloud数据库和blastn数据库进行比较，构建两菌株的系统发育树图：如图3
‑
图4所示，菌株wxh1和菌株wxh2都与芽孢杆菌bacillus sp.都具有99.7％的相似性，但是两者不同种，其中菌株wxh1与内生杆菌bacillus velezensis聚类到一支，而菌株wxh2 与内生杆菌bacillus subtilis聚类到一支。因此，说明上述两个菌株，同属于bacillus属，但是不同种。
52.实施例2：
或wxh2的代谢产物添加量达到40％时，开始对尖孢镰刀菌foc1起到抑制作用：当达到60％浓度时，wxh1或wxh2代谢产物完全抑制了菌丝体的生长。
71.图10为wxh1和wxh2代谢产物对尖孢镰刀菌foc4的抑制结果图，从图中可见，当wxh1 的代谢产物添加量达到40％时，开始对尖孢镰刀菌foc4起到抑制作用：当wxh2的代谢产物添加量达到60％浓度时，wxh2代谢产物抑制了尖孢镰刀菌foc4的生长,此外wxh1对foc4的抑制效果强于wxh1，当达到80％以上时，wxh1或wxh2代谢产物完全抑制了菌丝体的生长。
72.图11为菌株wxh1和wxh2代谢产物对尖孢镰刀菌(foc1)的抑制结果图，从数据中可以看到具有wxh1次级代谢物对尖孢镰刀菌(foc1)的抑制生长能力大于wxh2菌次级代谢物。
73.图12为菌株wxh1和wxh2代谢产物对尖孢镰刀菌(foc4)的抑制结果图，从数据中可以看到具有wxh1次级代谢物对尖孢镰刀菌(foc4)的抑制生长能力略大于wxh2菌次级代谢物。
74.实施例4：
75.本实施例利用上述的菌株wxh2和菌株wxh1制备菌剂抑制香蕉枯萎病。
76.本实施例使用复合菌剂：由土壤生防菌bacillus subtilis wxh2、香蕉茎内生秆菌bacillusvelezensis wxh1菌株和酵母菌制备成菌粉后按照质量比为1
‑
2:1
‑
2:1
‑
3混合制备得到。其中酵母菌购买自安琪公司，型号为：耐高温高活性酵母。
77.本实施例实验组有机肥的制备方法为：按照如下质量百分比称量各原料：40％木薯渣、 30％牛粪、20％落叶(可选芭蕉叶)、10％树枝(可选杉木树枝)，充分混匀后粉碎、然后按照底料总质量的5％添加上述的混合菌粉；在常温下堆沤21d即得有机肥。
78.本实施例对照组有机肥的制备方法为：40％木薯渣、30％牛粪、20％落叶(可选芭蕉叶)、 10％树枝(可选杉木树枝)，充分混匀后粉碎；不添加复合菌粉，在常温下堆沤21d即得有机肥。
79.有机肥制备好后，进行大田试验，大田试验分为实验组和对照组：
80.实验组：按照20g/株的施肥量施加实验组有机肥；
81.对照组：按照20g/株的施肥量施加对照组有机肥；
82.其它种植管理方法采用常规管理方法，种植管理120天后，观察发现：
83.如图13所示，图中为施加了实验组有机肥的香蕉；如图14所示，图中为施加了对照组有机肥的香蕉，从图13
‑
14可见，未添加本技术菌株的有机肥，其表现出较强的枯萎病，图 14
①
图的香蕉叶片表现出叶片变黄、发育迟缓、枯萎症状，而图13
①
并未出现上述症状；图 14
②
、
③
茎秆、叶片上出现黑色条纹以及根腐烂、穿过茎的纵向切片显示严重坏死的茎秆组织，这与香蕉镰刀菌枯萎表型的报道一致。由此说明本技术的菌株在大田应用上能有效防治香蕉枯萎病。申请人采用如下公式对香蕉枯萎病发病率进行计算：
84.香蕉枯萎病发病率计算公式：对香蕉枯萎病发病率进行了估计：p＝a/b；a＝香蕉发病数目； b＝香蕉种植棵树实验组；
85.结果如图15所示，未添加复合菌剂发酵的对照组(control)其发病率为36％；添加复合菌剂发酵的实验组其发病率为5.6％显著低于对照组。
86.除了上述发病率外，申请人还对两组实验的产量和挂果时间进行统计、计算；结果如下：
87.(1)经两季的株产量进行统计计算，结果如图16所示，添加复合菌剂发酵的实验组其产量为23kg、未添加复合菌剂发酵的对照组(control)其产量为23kg。由此可见，菌株wxh1 和菌株wxh2并未对香蕉产量造成影响。
88.(2)经过两季的挂过时间进行统计计算，结果发现添加复合菌剂发酵的实验组其挂果时间比未添加复合菌剂发酵的对照组(control)的挂果时间提早，差异显著：具体如图29所示，对照组的3
‑
12月挂果率为23％，而实验组的挂果率为69％。由此可见，施用含菌株wxh2和菌株wxh1复合菌剂的有机肥能使香蕉挂果率显著提高；
89.其中，挂果率的计算为：挂果指数＝∑(挂果株数值)/(实验株数总和)；
90.实施例5：
91.本实施例研究复合菌剂对土壤微生物多样性的影响：
92.为了研究wxh1和wxh2孢子引起的土壤微生物群落结构和组成的变化，我们将土壤分为三类进行土壤多样性的研究，包括健康组(health)，疾病组(disease)和生物防治组(bsrs)。
93.每组取3个土壤样本，进行测序数据、计算得到土壤微生物alpha多样性分析结果图，具体如图17
‑
图18所示，chao1揭示细菌α多样性没有明显差异(图17)，但shannon显示，三类土壤类型之间的物种多样性差异显着。在生防菌株中，细菌群落产生的α多样性显着低于健康组(图18)。生物防治组和健康组的每个样品的群落组成都在菌群水平进行计数。属于类杆菌的最重要的otu富含健康组和生物防治组调控的土壤。在生物防治组菌株调节的土壤中，菌类的相对丰度较高，而γ
‑
变形杆菌的相对丰度较低(图19)。门水平疾病组与健康组和生物防治组的结果相比，发现两者之间的差异非常大。疾病组(346)和健康组(3321) 中的细菌种类多于生物防治组(104)，表明生物防治组土壤微生物种类的多样性相对较低(图 20)。此外，使用相同的方法评估独特物种特征的重要性。属水平在健康组(17)中，独特的细菌otu比患病土壤(12)更多，而生物防治组菌株对土壤进行调节(9)(图20)。在最高的5个丰度水平的香蕉种类上，香蕉枯萎病的土壤微生物丰度较低(图23)。但是主坐标分析(pca)与布雷
‑
柯蒂斯距离的结果表明，三种土壤类型之间的细菌群落没有显着差异(图 22)。土壤微生物群落的结构和组成与香蕉枯萎病的低发生率相关。
94.图24为多样本分类树状图；图中多样本分类树状图比较了分支上不同组或样本的序列丰度差异，该差异由彩色饼图表示。饼图区域越大，分支处的序列丰度就越大，并且不同的颜色代表不同的组或样本。颜色的扇形区域越大，该分支上相应组或样本的序列就比其他组或样本更多。
95.计算了物种之间的相关性，并进行了统计检验。基于python绘制了生物防治菌株调控土壤群(bsrs)共表达分析网络图健康组疾病组，结果如图25
‑
图27所示，在生物控制菌株调控的土壤群微生物特征网络中有更多的节点和链接。对细菌特征网络的进一步了解显示出较高的平均度，某些属，如归类为ideonella_sp，haliangium，tepidum，labilithrix luteolac， sphingomonas_sp，tepidisphaera mucosa和candidatus_alborgensis的生物控制菌株在土壤中具有较强的相关性和较高的相对丰度、组细菌网络。在健康的土壤特征网络中，有更多的结点和链接，特征网络包括槟榔属，大雄虫，黄杆菌属，特里莫纳斯菌，绿藻弧菌，西维氏细杆菌，嗜气单胞菌，chujiibacter soli和nitrospira japonica。疾病特征网络在诸如ldeonella_sp，鞘氨醇单孢菌，flavisolibacter，ginsengiterrae，糖酵母
菌，盖伊氏菌，longimicrobium terrae， mucilaginibacter_sp saburae等病虫害特征网络中具有较高的亲密性。
96.为了确定土壤细菌群落的特性是否可以作为预测潜在病原体表型的方法，bugbase首先通过预测的16s拷贝数对otu进行了标准化，然后使用提供的预先计算的文件预测了微生物表型。在生物学数据集中每个样本的整个覆盖阈值范围(0到1，以0.01为增量)中估计相对性状丰度。bugbase为用户数据中的每个功能选择所有样本中的最高覆盖阈值(0.48、0.59、 0.55)(图28a)。生成了具有特征性状的群体的相对丰富度的分类单元贡献图。潜在的致病性结果表明，患病细菌群落的相对丰度显着高于健康土壤样品，而生物防治菌株可调节土壤 (图28b)。如g_burkholderia g_candidatus g_solibacter g_klebsiella marensis和tenuis(图 28b)。此外，在phylum级别，病菌中的细菌相对相对丰度也明显更高，细菌群落的相对丰度也明显更高(图28c)。
97.综上说明，使用本技术的菌株能有效降低疾病土壤的生物多样性。
98.综上所述，本发明的复合菌剂包括香蕉茎内生秆菌bacillus velezensis wxh1和土壤生防菌bacillus subtilis wxh2菌株均有抑制尖孢镰刀菌生长的作用，能有效防治香蕉枯萎病、加快香蕉挂果时间，能有提高香蕉对枯萎病的抗病性，降低染病土壤的生物多样性，是一种性能良好的生防菌株。
99.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。