一种用于血清外泌体中HBV-DNA与HBV感染及进展的相关性分析的实验方法与流程

一种用于血清外泌体中hbv
‑
dna与hbv感染及进展的相关性分析的实验方法
技术领域
1.本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种用于血清外泌体中hbv
‑
dna与hbv感染及进展的相关性分析的实验方法。


背景技术：

2.乙型肝炎(hepatitis b)是由乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)感染肝脏引起的疾病。who最新统计数据显示，全球hbv感染人数众多，非洲及西太平洋地区感染率最高，病毒携带率大于6％，而中国也是重灾区，我国目前hbv携带者占总人口的6％左右，形势非常严峻，hbv感染损伤肝细胞，危害大，所有hbv慢性感染者都有最终转归为肝硬化和肝癌的风险。目前，其诊断主要依据是hbv
‑
dna核酸检测及乙型肝炎病毒血清标记物检测和肝功能检查等辅助性检测。最新版hbv治疗指南规定只有当hbv
‑
dna及肝功能指标alt同时升高时符合治疗标准，然而，hbv
‑
dna低水平复制的治疗与否取决于肝脏穿刺活检，事实上，穿刺活检为有创性检查，病人难于接受，开展率不高，因此，需要寻找更为敏感的检测及手段以真实反应肝脏病变程度为临床治疗提供依据。


技术实现要素：

3.本发明通过临床血清标本检测及提取外泌体检测相关指标，比较分析外泌体中hbv
‑
dna水平的敏感性及其与血清生化检测指标之间的相关性，以修正和补充治疗的标准，帮助临床准确制定治疗策略，防止漏诊和延误病情。
4.本发明采用的技术方案：
5.一种用于血清外泌体中hbv
‑
dna与hbv感染及进展的相关性分析的实验方法，包括以下步骤：
6.步骤1：血清中外泌体的提取与鉴定；
7.步骤2：外泌体内hbv
‑
dna的提取；
8.步骤3：qrt
‑
pcr定量检测外泌体中hbv
‑
dna；
9.步骤4：统计学分析处理。
10.优选的，在步骤1中，血清中外泌体提取过程为：
11.收集六组血清，运用exoquick
‑
tc外泌体提取试剂盒，各取120μl上清液予以3000xg离心15min，去除细胞及其碎片，取100μl上清液加入24μl exoquick
‑
tc试剂倒转混匀，在4℃中冷藏30min，给予1500xg离心30min，可见外泌体呈黄色沉淀附着于ep管底部，小心吸去上清，ep管内即为细胞上清的外泌体。
12.优选的，在步骤1中，外泌体的鉴定过程为：
13.将血清中的外泌体用1
×
pbs重悬后在电镜下观察其形态，western blot检测其表面蛋白alix,cd9,cd63的表达，运用dio(dioc18(3))染色外泌体后与hepg2细胞共培养24小时，荧光显微镜观察细胞形态。
14.优选的，在步骤2中，外泌体内hbv
‑
dna的提取过程为：
15.向外泌体中加入hbv病毒核心颗粒dna提取液400μl，吹打混匀后予以37℃孵育15分钟，15000xg离心3min，将上清液转入新的ep管中，加入4μl mgcl2、rnase，5μldna酶ⅰ，37℃孵化3～4h，加入peg8000200ⅰ震荡混匀，置冰上静置40min，4℃温度下12000xg离心7min，可见白色沉淀，去上清加400μl消化液，吹打混匀后加入15μl蛋白酶k，再次混匀，45℃消化过夜；次日向ep管内加入400μl苯酚氯仿异戊醇混合液，吹打混匀，14000xg离心3min，将上清液转入新的ep管中后加入等体积异丙醇充分混匀，4℃温度下16500xg离心11min，倒去上清加入200μl70％无水乙醇颠倒混匀，4℃温度下16500xg离心5min，弃上清，吸水纸去余液，开放ep管置65℃恒温孵育器上，干燥20
‑
30min，向ep管内加入20μl ddh2o。
16.优选的，在步骤3中，将六组血清中的20μl hbv
‑
dna，每组取1μl hbv
‑
dna加入至99μl ddh2o中，予以sybr试剂盒进行荧光定量，采用绝对定量法进行外泌体定量。
17.优选的，使用games
‑
howell法进行六组数据的两两比较，同时将各组血清中外泌体内hbv
‑
dna的表达与检验科测得的对应的hbv
‑
dna的值进行对比，采用独立样本的t检验；将各组血浆中外泌体内hbv
‑
dna的表达与对应组其他临床指标进行相关性分析。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过实验研究证实了外泌体内部包裹的hbv
‑
dna水平是临床诊断和治疗慢性乙肝中不可或缺的重要参考指标。当患者血清hbv
‑
dna(
‑
)，外泌体内hbv
‑
dna能够更准确反映体内hbv复制水平，同时与肝脏损伤指标tbil、dbil、ibil呈现出高度的正相关性。而患者血清内hbv
‑
dna处于中
‑
高度复制( )或高度复制( )，同时肝脏损伤指标alt异常时，由于体量限制，血清hbv
‑
dna为更加准确的指标，但外泌体内hbv
‑
dna水平与血清指标具有高度的相关性。对于肝脏代偿期alt正常但hbv
‑
dna高度复制的患者，由于机体反应弱，导致外泌体分泌较少，其虽与血清hbv
‑
dna水平趋势相似，但却并不呈现相关关系。建议当外泌体内hbv
‑
dna>3.13e 05iu/ml时就应该立即开始抗病毒治疗。
附图说明
19.图1为血清外泌体鉴定结果；a：电镜下血清外泌体呈大小约150nm的囊泡状茶托样结构；b：血清内外泌体转染至hepg2细胞24n后，细胞膜可见颗粒状荧光；c：wb检测外泌体表面蛋白的表达；
20.图2为六组血清中外泌体内hbv
‑
dna的表达；
21.图3为hbeag( )慢性hbv感染组外泌体内hbv
‑
dna与血清hbv
‑
dna的拷贝数(iu/ml)；a：表示每个病人血清中hbv
‑
dna及外泌体内hbv
‑
dna水平和趋势；b：横坐标为血清中hbv
‑
dna水平，纵坐标为外泌体中hbv
‑
dna水平的相对水平和趋势；c：为该组病例血清中hbv
‑
dna及外泌体中hbv
‑
dna水平的散点分布图和平均水平比较；
22.图4为hbeag( )慢性肝炎组外泌体内hbv
‑
dna与血清hbv
‑
dna的拷贝数(iu/ml)；a：表示每个病人血清中hbv
‑
dna及外泌体内hbv
‑
dna水平和趋势；b：横坐标为血清中hbv
‑
dna水平，纵坐标为外泌体中hbv
‑
dna水平的相对水平和趋势；c：为该组病例血清中hbv
‑
dna及外泌体中hbv
‑
dna水平的散点分布图和平均水平比较；
23.图5为hbeag( )慢性肝炎组外泌体内hbv
‑
dna与血清hbv
‑
dna的相关性；
24.图6为hbeag(
‑
)慢性hbv感染组外泌体内hbv
‑
dna与血清hbv
‑
dna的拷贝数(iu/
ml)；a：表示每个病人血清中hbv
‑
dna及外泌体内hbv
‑
dna水平和趋势；b：横坐标为血清中hbv
‑
dna水平，纵坐标为外泌体中hbv
‑
dna水平的相对水平和趋势；c：为该组病例血清中hbv
‑
dna及外泌体中hbv
‑
dna水平的散点分布图和平均水平比较；
25.图7为hbeag(
‑
)慢性肝炎组外泌体内hbv
‑
dna与血清hbv
‑
dna的拷贝数(iu/ml)；a：表示每个病人血清中hbv
‑
dna及外泌体内hbv
‑
dna水平和趋势；b：横坐标为血清中hbv
‑
dna水平，纵坐标为外泌体中hbv
‑
dna水平的相对水平和趋势；c：为该组病例血清中hbv
‑
dna及外泌体中hbv
‑
dna水平的散点分布图和平均水平比较；
26.图8为hbeag(
‑
)慢性肝炎组外泌体内hbv
‑
dna与血清hbv
‑
dna的相关性；
27.图9为hbsag(
‑
)组外泌体内hbv
‑
dna与血清hbv
‑
dna的拷贝数(iu/ml)；a：表示每个病人血清中hbv
‑
dna及外泌体内hbv
‑
dna水平和趋势；b：横坐标为血清中hbv
‑
dna水平，纵坐标为外泌体中hbv
‑
dna水平的相对水平和趋势；c：为该组病例血清中hbv
‑
dna及外泌体中hbv
‑
dna水平的散点分布图和平均水平比较；
28.图10为hbsag(
‑
)组外泌体内hbv
‑
dna与血清胆红素之间的相关性；a：表示每个病人血清中tbil及外泌体内hbv
‑
dna水平和趋势；b：横坐标为外泌体中hbv
‑
dna水平，纵坐标为血清中tbil水平的相对水平和趋势；c：为该组病例血清中tbil及外泌体中hbv
‑
dna水平的散点分布图和平均水平比较；
具体实施方式
29.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
30.1.资料与方法
31.1.1材料
32.western blot试剂盒购自碧云天生物；一抗、二抗购自abclonal生物；hbv引物由生工生物设计合成；sybr试剂盒购自cwbio生物；dio(dioc
18
(3))细胞膜绿色荧光探针购自yeasen生物；exoquick
‑
tc外泌体提取试剂盒均购自美国sbi公司。
33.1.2分组并测定血清hbv
‑
dna、免疫指标及肝脏生化指标，血清标本采集自川北医学院附属医院，总计39例(伦理委员会认证编号：)，其中男性19例，女性20例，年龄段3
‑
65岁。根据2018最新版欧洲肝病协会临床实践指南，分组包括(表1
‑
表6)：
34.group1:hbeag( )慢性hbv感染组6例：hbv
‑
dna( )、hbeag( )、alt正常；
35.group2:hbeag( )慢性肝炎组8例：hbv
‑
dna( )、hbeag( )、alt升高(其中升高两倍以内5例，两倍以上3例)；
36.group3:hbeag(
‑
)慢性hbv感染组5例：hbv
‑
dna(
‑
)、hbeag(
‑
)、hbeab( )、alt正常；
37.group4:hbeag(
‑
)慢性肝炎组6例：hbv
‑
dna( )、hbeag(
‑
)、hbeab( )、alt升高(其中升高两倍以内2例，两倍以上4例)；
38.group5:hbsag(
‑
)组7例：hbv
‑
dna(
‑
)、hbeag(
‑
)、hbsag(
‑
)、hbcab( )；
39.group6:健康组7例：hbv
‑
dna(
‑
)、hbeag(
‑
)、hbbab(
‑
)hbsag(
‑
)、hbcab(
‑
)、alt正常。
40.检测血清中hbsag,hbsab,hbeag,hbeab,hbcab(乙肝表面抗原测定量检测试剂盒，
上海科华)；hbv
‑
dna水平(乙型肝炎病毒dna核酸检测试剂盒，罗氏)，肝脏生化指标。
41.表1 hbeag( )慢性hbv感染组
[0042][0043]
表2 hbeag( )慢性肝炎组
[0044][0045]
表3 hbeag(
‑
)慢性hbv感染组
[0046][0047]
表4 hbeag(
‑
)慢性肝炎组
[0048][0049]
表5 hbsag(
‑
)组
[0050][0051]
表6 健康组
[0052][0053]
实验方法
[0054]
步骤1：血清中外泌体的提取与鉴定
[0055]
收集六组血清，运用exoquick
‑
tc外泌体提取试剂盒，各取120μl上清液予以3000xg离心15min，去除细胞及其碎片，取100μl上清液加入24μl exoquick
‑
tc试剂倒转混匀，在4℃中冷藏30min，给予1500xg离心30min，可见外泌体呈黄色沉淀附着于ep管底部，小心吸去上清，ep管内即为细胞上清的外泌体。
[0056]
外泌体的鉴定将血清中的外泌体用1
×
pbs重悬后在电镜下观察其形态，westernblot检测其表面蛋白alix,cd9,cd63的表达，运用dio(dioc18(3))染色外泌体后与hepg2细胞共培养24小时，荧光显微镜观察细胞形态。
[0057]
步骤2：外泌体内hbv
‑
dna的提取
[0058]
向外泌体中加入hbv病毒核心颗粒dna提取液400μl，吹打混匀后予以37℃孵育15分钟，15000xg离心3min，将上清液转入新的ep管中，加入4μl mgcl2、rnase，5μldna酶ⅰ，37℃孵化3～4h，加入peg8000200ⅰ震荡混匀，置冰上静置40min，4℃温度下12000xg离心7min，可见白色沉淀，去上清加400μl消化液，吹打混匀后加入15μl蛋白酶k，再次混匀，45℃消化过夜；次日向ep管内加入400μl苯酚氯仿异戊醇混合液，吹打混匀，14000xg离心3min，将上清液转入新的ep管中后加入等体积异丙醇充分混匀，4℃温度下16500xg离心11min，倒去上清加入200μl70％无水乙醇颠倒混匀，4℃温度下16500xg离心5min，弃上清，吸水纸去余液，开放ep管置65℃恒温孵育器上，干燥20
‑
30min，向ep管内加入20μl ddh2o。
[0059]
步骤3：qrt
‑
pcr定量检测外泌体中hbv
‑
dna
[0060]
将六组血清中的20μl hbv
‑
dna，每组取1μl hbv
‑
dna加入至99μl ddh2o中，予以sybr试剂盒进行荧光定量，采用绝对定量法进行外泌体定量。
[0061]
hbv
‑
dna引物序列(5'
‑
3')为：f：accgaccttgaggcatactt；r：gcctacagcctcctagtaca。
[0062]
反应体系：2xultrasybrmixture 12.5μl，hbv
‑
dnaforward primer 10μm 1μl，hbv
‑
dnarorward primer 10μm 1μl，ddh2o 8.5μl，template dna2μl(稀释100倍)。
[0063]
予以95℃10min预变性，95℃15s、60℃1min循环39次，设置融解曲线，根据ct值算出hbv
‑
dna绝对定量
[0064]
步骤4：统计学分析处理
[0065]
使用games
‑
howell法进行六组数据的两两比较，同时将各组血清中外泌体内hbv
‑
dna的表达与检验科测得的对应的hbv
‑
dna的值进行对比，采用独立样本的t检验；将各组血浆中外泌体内hbv
‑
dna的表达与对应组其他临床指标进行相关性分析。
[0066]
2.结果
[0067]
2.1外泌体的鉴定
[0068]
血清内外泌体电镜下呈明显的茶托样结构；运用24μl exoquick
‑
tc外泌体提取试剂提取100μl血浆中的外泌体，经4％多聚甲醛固定后，予以dio(dioc
18
(3))染色，与hepg2细胞共培养24小时，于荧光显微镜下观察细胞形态，如图1所示，可见细胞膜周围呈现绿色荧光的外泌体；wb检测到外泌体表面蛋白alix、cd9、cd63的表达。
[0069]
2.2六组血清中外泌体hbv
‑
dna的表达
[0070]
通过荧光定量pcr法对六组血清外泌体内hbv
‑
dna进行绝对定量，组间差异见图2：group1
‑
group6组中hbv
‑
dna拷贝数分别为：4.11e 06
±
1.17e 06iu/ml、3.13e 06
±
9.98e 05iu/ml、1.02e 05
±
1.49e 04iu/ml、5.08e 05
±
2.65e 05iu/ml、3.10e 03
±
4.78e 02iu/ml、0iu/ml。除了group1与group2、group3与group4表达无统计学差异，其他各组两两比较p<0.05，均有统计学意义。
[0071]
2.3血清中外泌体内hbv
‑
dna与对应组血清hbv
‑
dna的表达和临床指标的相关性分析
[0072]
group1、group2、group4外泌体内hbv
‑
dna的表达低于对应组血清hbv
‑
dna拷贝数，p<0.05，差异有统计学意义。group3、group5中外泌体内hbv
‑
dna的表达高于对应组hbv
‑
dna拷贝数，p<0.05，差异有统计学意义。group6外泌体内hbv
‑
dna拷贝数是0，对应血清中hbv
‑
dna<500iu/ml，无法行t检验，也无法与临床指标进行相关性分析。group2、group4中外泌体内hbv
‑
dna的表达水平与血浆中hbv
‑
dna存在正相关(p<0.05)；group5中外泌体内hbv
‑
dna的表达水平与tbil、dbil、ibil存在正相关(p<0.05)。
[0073]
如图3所示，qrt
‑
pcr检测外泌体内hbv
‑
dna与血清内hbv
‑
dna的表达，后者表达高于前者，约为4.35
‑
27.45倍。
[0074]
如图4所示，qrt
‑
pcr检测外泌体内hbv
‑
dna与血清内hbv
‑
dna的表达，后者表达高于前者，约为1.84
‑
41.17倍。
[0075]
如图5所示，外泌体内hbv
‑
dna与血清内hbv
‑
dna呈现高度的正相关性，r值为0.857,p值为0.014。
[0076]
如图6所示，qrt
‑
pcr检测外泌体内hbv
‑
dna与血清内hbv
‑
dna的表达，前者显著高于后者。
[0077]
如图7所示，qrt
‑
pcr检测外泌体内hbv
‑
dna与血清内hbv
‑
dna的表达，后者高于前
者，约为1.73
‑
40.8倍。
[0078]
如图8所示，外泌体内hbv
‑
dna与血清内hbv
‑
dna呈现高度的正相关性，r值为0.943；p值为0.005。
[0079]
如图9所示，qrt
‑
pcr检测外泌体内hbv
‑
dna与血清内hbv
‑
dna的表达，前者显著高于后者。
[0080]
如图10所示，外泌体内hbv
‑
dna与血清总胆红素、直接胆红素、间接胆红素均呈现高度的正相关性，r值分别为0.929、0.893、0.857；p值分别为0.003、0.007、0.014。
[0081]
3讨论
[0082]
外泌体作为细胞间重要的信息沟通结构，极有可能成为早期诊治的目标成分。研究显示：血清hbv
‑
dna(
‑
)(group3
‑
图6及group5
‑
图9)组患者，外泌体内hbv
‑
dna表达数分别为：1.02e 05iu/ml、3.10e 03iu/ml，远高于血清hbv
‑
dna检测限(拷贝数为5e 02iu/ml)，说明外泌体内hbv
‑
dna敏感于血清，其可能在病毒复制早期甚至起始阶段就作为重要的感染媒介发挥作用，造成其内含病毒数量远高于血清。因此，外泌体作为hbv
‑
dna复制与感染的诊断指标更加敏感且具有一定的预见性。有趣的是，对于血清hbv
‑
dna处于中高复制水平(>2e 03iu/ml)(group4
‑
图7)的患者，其外泌体内hbv
‑
dna拷贝数与我们检测的hbv
‑
dna(
‑
)患者外泌体内hbv
‑
dna水平相当，差别甚至于在一个数量级范围之内。同时，血清hbv
‑
dna(
‑
)与hbv
‑
dna( )组间外泌体内hbv
‑
dna拷贝数分别为：1.02e 05iu/ml，5.08e 05iu/ml，差别4.98倍(p>0.05)，无统计学差异，说明血清并不能真实反映乙型肝炎病毒复制在疾病进展中的真实情况。
[0083]
1)当血清内hbv
‑
dna高度复制时，如group1(图3)和group2(图4)组患者，hbv
‑
dna>2e 05iu/ml，由于相较于外泌体，血清有更大的体量容纳hbv
‑
dna，因此，血清中检测到的hbv
‑
dna自然就多，外泌体作为纳米级囊泡状颗粒，由于其体积的限制，包裹其中的hbv
‑
dna数量也就少，差别在1.84
‑
41.17倍之间(p<0.05)。
[0084]
2)当血清内hbv
‑
dna处于中
‑
高度复制时，如group4(图7)组患者，hbv
‑
dna>2e 03iu/ml，血清hbv
‑
dna仍高于外泌体水平，其效果与hbv
‑
dna高度复制时类似，差别在1.73
‑
40.8倍之间(p<0.05)。
[0085]
3)当血清内hbv
‑
dna阴性时，如group3(图6)和group5(图9)组患者，hbv
‑
dna<5e 02iu/ml检测限，此时，体内仍有病毒复制，但血清并不能检出，外泌体hbv
‑
dna水平与血清中高复制group4(图7)组患者外泌体内水平相当(p>0.05)，但低于血清hbv
‑
dna阳性组患者外泌体内hbv
‑
dna水平。
[0086]
可见，外泌体中hbv
‑
dna更加稳定的检测指标，其不受环境体量影响，无论hbv
‑
dna阴性还是阳性均呈现出hbv
‑
dna一定的表达水平，并随血清hbv
‑
dna水平变化趋势而变化，其中中高水平复制(group4
‑
图8)及高水平复制(group2
‑
图5)组血清与外泌体hbv
‑
dna呈现正相关关系(p<0.05)。因此，对临床诊疗意义重大。
[0087]
从而解释了当血清hbv
‑
dna高度复制时，外泌体内hbv
‑
dna与肝功能相关指标并不呈现相关关系，而当血清hbv
‑
dna低水平复制(<5e 02iu/ml)时，外泌体内hbv
‑
dna与肝功能相关指标呈现一定的相关关系，如hbv
‑
dna(
‑
)组(group5
‑
图10)，我们的研究发现外泌体内hbv
‑
dna与tbil、dbil、ibil呈现出高度的正相关性，说明外泌体内hbv
‑
dna水平能够一定程度的反映肝脏损伤情况。
[0088]
结合临床诊疗标准，当hbv
‑
dna>2e 05iu/ml时，而alt正常，存在抗病毒治疗争议，需要结合年龄，肝脏组织学检查及代偿情况等综合判定，缺乏准确反映治疗时机的简单指标。经过对6例该类患者(group1
‑
图3)分析，其hbv
‑
dna处于高水平复制，其alt正常，依据临床治疗指南，可不予治疗，但研究发现，其外泌体中hbv
‑
dna平均拷贝数为4.11e 06iu/ml，hbv
‑
dna复制水平甚至高于指南规定必须抗病毒治疗标准(hbv
‑
dna>2e 03iu/ml、alt>uln，如group2，外泌体中hbv
‑
dna平均拷贝数为3.13e 06iu/ml)1.3倍以上(p<0.05)；另外，7例血清hbv
‑
dna>2e 04iu/ml，alt>2uln，绝对符合抗病毒治疗标准，其外泌体内hbv
‑
dna平均拷贝数仅为1.10e 06iu/ml，亦远低于争议情况中外泌体内hbv
‑
dna水平。据此推断，外泌体内hbv
‑
dna至少>3.13e 05iu/ml时就应该立即开始抗病毒治疗。同时，血清hbv
‑
dna(
‑
),alt正常患者(group3
‑
图6、group5
‑
图9)，不符合临床抗病毒治疗指征，实际测到的外泌体中hbv
‑
dna平均拷贝数分别为1.02e 05iu/ml、3.10e 03iu/ml，是血清内hbv
‑
dna的6
‑
200倍，据此推定，外泌体作为抗病毒治疗时机的标准下限为hbv
‑
dna>1.56e 5iu/ml，大于此拷贝数，则应该考虑予以抗病毒治疗。因此，外泌体可作为一个简便易行、无创的检测指标对于临床诊断及治疗有较强的指示作用。
[0089]
4结论
[0090]
综上所述，外泌体内部包裹的hbv
‑
dna水平是临床诊断和治疗慢性乙肝中不可或缺的重要参考指标。研究证实，当患者血清hbv
‑
dna(
‑
)，外泌体内hbv
‑
dna能够更准确反映体内hbv复制水平，同时与肝脏损伤指标tbil、dbil、ibil呈现出高度的正相关性。而患者血清内hbv
‑
dna处于中
‑
高度复制( )或高度复制( )，同时肝脏损伤指标alt异常时，由于体量限制，血清hbv
‑
dna为更加准确的指标，但外泌体内hbv
‑
dna水平与血清指标具有高度的相关性。对于肝脏代偿期alt正常但hbv
‑
dna高度复制的患者，由于机体反应弱，导致外泌体分泌较少，其虽与血清hbv
‑
dna水平趋势相似，但却并不呈现相关关系。建议当外泌体内hbv
‑
dna>3.13e 05iu/ml时就应该立即开始抗病毒治疗。
[0091]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。