一种植物细胞分裂素狭霉素的生物合成基因簇及其生物材料以及在合成狭霉素中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种植物细胞分裂素狭霉素的生物合成基因簇及其生物材料以及在合成狭霉素中的应用。


背景技术：

2.狭霉素最早是在1954年由日本东京大学yuntsen实验室从土壤中分离吸水链霉菌变种 (streptomyces hygroscopicus var.angustmyceticus)得到的，其中包括三个组分，分别被命名为狭霉素a、b和c(agm
‑
a、agm
‑
b、agm
‑
c)。狭霉素a具有特异性抑制分枝杆菌的活性和植物细胞分裂素的生物活性，还可作为一种有效的gmp抑制剂广泛使用。
3.在化学结构上，狭霉素c和狭霉素a为腺苷类似物，但与常见的呋喃核糖不同，具有特殊的六碳酮糖结构，与腺嘌呤的n
‑
糖苷键是通过一种罕见的β
‑2‑
n
‑
酮糖苷键实现的，这种键在自然界中十分少见。狭霉素a与狭霉素c的不同之处在于它的六碳酮糖结构单元有一个外型5,6位的烯键，类似于衣霉素生物合成过程中发现的外糖烯中间体。1966年chassy 等推断出狭霉素结构中糖的结构，完成了糖的生物合成过程的研究，指出糖的合成直接来源于d
‑
葡萄糖或d
‑
果糖。同时通过
14
c同位素标记狭霉素c中的腺嘌呤和d
‑
阿洛酮糖的 c
‑
6证实在发酵过程中狭霉素c和狭霉素a两种组分可以进行不裂解糖苷键的相互转化。尽管目前已经可以通过生物发酵与化学合成的手段获得狭霉素，但关于狭霉素的生物合成机制的研究仍然甚少。现有的化学合成步骤较繁琐，狭霉素产量较低。
4.因此，如何开发一种生物合成方法制备狭霉素，成为亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种植物细胞分裂素狭霉素的生物合成基因簇及其生物材料以及在合成狭霉素中的应用，筛选出的植物细胞分裂素狭霉素的生物合成基因簇能将6
‑
磷酸果糖转化为6
‑
磷酸阿洛酮糖，通过一系列酶催化反应后合成了狭霉素a，为狭霉素的合成提供了一条新的途径。
6.在本发明的第一方面，提供了一种植物细胞分裂素狭霉素的生物合成基因簇，所述植物细胞分裂素狭霉素的生物合成基因簇的核苷酸序列如seq id no：1中第255～8993位核苷酸序列，和seq id no：2中第91～8961位核苷酸序列所示；所述植物细胞分裂素狭霉素的生物合成基因簇共13个基因，负责狭霉素生物合成，包括：
7.agmt1，位于seq id no:1中第255～1562碱基和seq id no:2中第91～1401碱基处，编码mfs转运蛋白，氨基酸序列如seq id no:3和seq id no:12所示；
8.agmt2，位于seq id no:1中第1596～2795碱基和seq id no:2中第1498～2697碱基处，编码mfs转运蛋白，氨基酸序列如seq id no:4和seq id no:13所示；
9.agmr，位于seq id no:1中第2856～3728碱基和seq id no:2中第2786～3754碱基处，编码转录调节因子，氨基酸序列如seq id no:5和seq id no:14所示；
10.agma，位于seq id no:1中第4029～4610碱基和seq id no:2中第3961～4542碱基处，编码磷酸核糖水解酶，氨基酸序列如seq id no:6和seq id no:15所示；
11.agmb，位于seq id no:1中第4607～5281碱基和seq id no:2中第4539～5213碱基处，编码had家族水解酶，氨基酸序列如seq id no:7和seq id no:16所示；
12.agmc，位于seq id no:1中第5278～6357碱基和seq id no:2中第5210～6286碱基处，编码磷酸阿洛酮糖焦磷酸激酶，氨基酸序列如seq id no:8和seq id no:17所示；
13.agmd，位于seq id no:1中第6341～7060碱基和seq id no:2中第6270～6989碱基处，编码磷酸阿洛酮糖异构酶，氨基酸序列如seq id no:9和seq id no:18所示；
14.agme，位于seq id no:1中第7112～7648碱基和seq id no:2中第7061～7597碱基处，编码磷酸阿洛酮糖转移酶，氨基酸序列如seq id no:10和seq id no:19所示；
15.agmf，位于seq id no:1中第7722～8993碱基和seq id no:2中第7690～8961碱基处，编码狭霉素c脱水酶，氨基酸序列如seq id no:11和seq id no:20所示。
16.在本发明的第二方面，提供了一种植物细胞分裂素狭霉素c的生物合成基因簇，包括：
17.基因簇a、agma、agmb、agmc、agmd和agme基因。
18.在本发明的第三方面，提供了一种植物细胞分裂素狭霉素a的生物合成基因簇，包括基因簇b：agma、agmb、agmc、agmd、agme和agmf基因；
19.或者agmf基因。
20.在本发明的第四方面，提供了一种agmf基因，所述基因编码狭霉素c脱水酶agmf，其氨基酸序列为seq id no:11和seq id no:20所示，所述狭霉素c脱水酶agmf，以狭霉素c为底物，催化狭霉素c的体外生化反应获得狭霉素a。
21.在本发明的第五方面，提供了一种agma基因，所述agma基因编码的磷酸核糖水解酶 agma催化amp水解生成腺嘌呤，为狭霉素的生物合成提供腺嘌呤前体。
22.在本发明的第六方面，提供了一种含有所述的狭霉素的生物合成基因簇或所述的狭霉素c的生物合成基因簇或所述的狭霉素a的生物合成基因簇或所述的agmf基因或所述的agma基因的表达盒。
23.在本发明的第七方面，提供了一种生物材料，包括：
24.含有所述的表达盒的重组表达载体；
25.或/和含有所述重组表达载体的重组菌或转基因细胞系；
26.或/和所述重组菌或转基因细胞系所表达的蛋白。
27.在本发明的第八方面，提供了一种所述的狭霉素的生物合成基因簇或所述的agmf基因或所述的agma基因或所述的表达盒或所述的生物材料在在合成狭霉素中的应用。
28.在本发明的第九方面，提供了一种狭霉素c的生物合成方法，所述方法包括：
29.在缓冲体系下，以mg
2
,nadp

,amp和damp和6
‑
磷酸果糖为底物，在所述基因簇a 所表达的agma、agmb、agmc、agmd和agme的5个蛋白的共同作用下催化反应获得狭霉素c。
30.在本发明的第十方面，提供了一种狭霉素a的生物合成方法，所述方法包括：
31.在缓冲体系下，以mg
2
、nadp

、atp和6
‑
磷酸果糖为底物，在所述基因簇b所表达的agma、agmb、agmc、agmd、agme和agmf的6个蛋白的共同作用下催化反应获得狭霉素a；
32.或者以狭霉素c为底物，加入agmf蛋白催化狭霉素c的体外生化反应获得狭霉素a。
33.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
34.本发明提供的一种植物细胞分裂素狭霉素的生物合成基因簇及其生物材料以及在合成狭霉素中的应用，本发明提供了狭霉素生物合成基因簇及相关蛋白信息，嘌呤核苷类抗生素狭霉素的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和方法。本发明所提供的基因及其编码的蛋白被证实可以用来体外合成狭霉素，也为寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物及其合成途径提供了一种新方法。
附图说明
35.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
36.图1为狭霉素三个组分的化学结构；
37.图2为狭霉素生物合成基因簇的基因结构图；
38.图3为狭霉素产生菌s.angustmyceticus jcm 4053和s.decoyicus nrrl 2666发酵产物的高效液相色谱(hplc)分析；
39.图4为狭霉素生物合成基因簇发酵产物的hplc分析；
40.图5为agmf蛋白sds
‑
page分析；
41.图6为agmf蛋白生化反应的hplc分析；std：狭霉素c和狭霉素a标准品；agmf (agm
‑
c)：以狭霉素c为底物的agmf蛋白生化反应；
‑
agmf(agm
‑
c)：缺失蛋白负对照； agmf(agm
‑
a)：以狭霉素a为底物的agmf蛋白生化反应；
‑
agmf(agm
‑
a)：缺失蛋白负对照；
‑
(agm
‑
c/agm
‑
a)：缺失底物负对照；
42.图7为agma蛋白sds
‑
page分析；
43.图8为agma蛋白生化反应的hplc分析；std：amp、damp和adenine标准品；agma (amp)：以amp为底物的agma蛋白生化反应；
‑
agma(amp)：缺失蛋白负对照；agma (damp)：以damp为底物的agma蛋白生化反应；
‑
agma(damp)：缺失蛋白负对照；
ꢀ‑
(amp/damp)：缺失底物负对照；
44.图9为狭霉素生物合成途径；
45.图10为狭霉素生物合成途径模式图。
具体实施方式
46.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
47.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
48.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
49.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
50.本技术发明人从克隆生物合成基因簇出发，对生物合成基因簇进行克隆，通过序列分析、功能验证、体外生化实验，揭示了其生物合成路径，解析了狭霉素生物合成中的关键酶的酶学催化功能，对狭霉素完整的生物合成机制进行探究，丰富了嘌呤核苷类抗生素家族，对发现新的天然植物细胞分裂素具有重要意义。本发明提供了狭霉素生物合成基因簇及相关蛋白信息，帮助人们理解核苷类抗生素狭霉素的生物合成机制，为进一步遗传改造提供了材料和方法。本发明所提供的基因及其编码的蛋白也可以用来体外合成狭霉素，也为寻找和发现可用于医药、工业或农业的嘌呤核苷天然产物及其生物合成途径提供重要思路。
51.具体地：
52.所述基因簇的核苷酸序列为seq id no:1中所示第255～8993位序列，以及seq id no: 2中所示第91～8961位序列，共包含9个基因，其中agma,agmb,agmc,agmd,agme和agmf 是狭霉素a生物合成过程中的必须基因，agmt1和agmt2是编码转运蛋白的基因，agmr 为调控基因。
53.其中agmf，其可以催化狭霉素c糖基5,6位脱水，获得最终产物活性组分狭霉素a；且本技术实施例中在体外以狭霉素c为底物，在nad

的条件下，agmf催化狭霉素c的体外生化反应，经过液相及质谱检测后，分析形成了狭霉素a。在其他实施方式中可以通过对agmf蛋白结构研究和改造等方法，扩充酶催化的底物库，发掘新的核苷类天然产物的生产能力。
54.其中agma，可以催化amp(单磷酸腺苷)和damp(单磷酸脱氧腺苷)水解生成adenine (腺嘌呤)，为狭霉素的生成提供腺嘌呤前体物质，可作为靶标蛋白发现活性细胞分裂素的生物合成基因簇。
55.接着，本技术对狭霉素生物合成基因簇进行应用，所述应用包括(但不限于)：
56.(1)包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化，或通过紫外线或化学试剂诱变等。
57.(2)包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通过合适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其他更高的生物活性或产量。这些外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等。
58.(3)本发明所提供的氨基酸序列可以用来分离所需要的蛋白并可用于抗体的制备。
59.(4)包含本发明所提供的氨基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或者提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。
60.(5)包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达并通过dna芯片技术了解它们在宿主代谢链中的功能。
61.(6)包含本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传重组来构建重组质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新型生物合成途径。
62.(7)包含本发明所提供的核苷酸序列编码狭霉素c脱水酶的agmf，其可以催化狭霉素c糖基5,6位脱水，获得最终产物活性组分狭霉素a，可以通过对agmf蛋白结构研究和改造等方法，扩充酶催化的底物库，发掘新的核苷类天然产物的生产能力。
63.(8)包含本发明所提供的核苷酸序列编码磷酸核糖水解酶的agma，其可以催化amp (单磷酸腺苷)和damp(单磷酸脱氧腺苷)水解生成adenine(腺嘌呤)，为狭霉素的生成提供腺嘌呤前体物质，可作为靶标蛋白发现活性细胞分裂素的生物合成基因簇。
64.(9)包含本发明涉及的狭霉素c和狭霉素a的完整生物合成途径。
65.下面将结合实施例及实验数据对本技术的一种植物细胞分裂素狭霉素的生物合成基因簇及其生物材料以及在合成狭霉素中的应用进行详细说明。
66.实施例1克隆、分析狭霉素的生物合成基因簇
67.(1)首先提取链霉菌s.angustmyceticus jcm 4053和s.decoyicus nrrl 2666的总dna：取30μl的孢子至50ml的isp2培养基中，30℃，200rpm，培养24～36h，至培养基呈现浑浊状态。取50ml的s.angustmyceticus jcm 4053和s.decoyicus nrrl 2666的菌液，4000rpm， 4℃，10min离心去上清，收集菌体。将菌体溶于25ml的10.3％蔗糖溶液中，震荡混匀洗涤菌体，4000rpm，4℃，10min离心去上清；再将菌体溶于15ml的set buffer中振荡混匀，4000 rpm，4℃，10min离心去上清，重复两次；将菌体溶于10ml的set buffer中震荡混匀后，加入50μl的溶菌酶溶液(100mg/ml)置于37℃水浴锅中温浴30min；随后加入280μl蛋白酶 k溶液(50mg/ml)，混匀后加入600μl 10％sds，颠倒混匀后置于55℃温浴4h，此期间每隔15min颠倒混匀，每隔30min添加蛋白酶k溶液100μl，直至菌丝体裂解变透明；之后加入4ml 5m的nacl，颠倒混匀，室温下放置菌液至37℃左右；加入10ml的氯仿颠倒混匀至乳白色，4000rpm，4℃，10min，取出上清液后加入0.6倍体积的异丙醇混匀；混匀后，有絮状dna析出，将析出的dna小心挑出并用75％的乙醇洗涤两次，置于通风处吹干，溶于适量的超纯水中。核酸电泳(40v，12h)检测dna的大小，并用nanodrop 2000测定其浓度及od值确定提出总dna的纯度。
68.(2)利用测序技术对其总dna进行全基因组扫描测序。由于狭霉素a具有细胞分裂素的活性，在其生物合成过程中可能存在与玉米素生物合成过程相类似的糖苷键水解步骤来提供腺嘌呤前体。我们采用细胞分裂素激活酶log为探针与s.angustmyceticus jcm 4053和 s.decoyicus nrrl 2666总dna的测序结果进行序列分析比对，找到与其同源的编码蛋白 agma，从而确定了狭霉素生物合成基因簇在基因组上的大概位置。
69.本发明采用两步pcr策略直接克隆出狭霉素的基因簇，将其通过吉布森拼接的方式连接在pset152载体上。dna测序分析了约9.2kb的染色体区域，生物信息分析包含了9个开放读码框。详细的分析结果列于表1。
70.表1狭霉素生物合成基因簇中各基因及编码蛋白的功能分析
[0071][0072]
a
括号中提供ncbi登记号
[0073]
实施例2狭霉素生物合成相关基因的体内功能确定
[0074]
1、体外构建含有狭霉素生物合成基因簇的重组质粒：
[0075]
(1)我们推测负责狭霉素生物合成的基因簇大约为9.2kb，本发明运用吉布森拼接的方法，将基因簇分为两部分(大小分别为4603bp，4636bp)进行pcr扩增，同时在引物两端设计同源区域序列，在大小为4603bp的片段在5’端添加ecori的酶切位点，大小为4636bp的片段在3’端添加xbai的酶切位点。
[0076]
以s.angustmyceticus jcm 4053总dna为模板分别扩增出两个片段，扩增所述2个片段的引物对f1、r1、f2、r2分别如表2所示；
[0077]
将所述扩增获得的2个基因片段使用重组克隆试剂盒均克隆到pset152载体的ecori、 xbai位点，获得含有完整基因簇的重组质粒pchw501。
[0078]
(2)构建敲除基因agmf的重组质粒
[0079]
采用吉布森拼接的方法进行敲除，敲除agmf基因簇分为两部分(大小分别为4603bp，3148bp)进行pcr扩增，同时在引物两端设计同源区域序列，在大小为4603bp的片段在5’端添加ecori的酶切位点，大小为3148bp的片段在3’端添加xbai的酶切位点。以s. angustmyceticus jcm 4053总dna为模板分别扩增出两个片段，扩增所述2个片段的引物对 f3、r3、f4、r4分别如表2所示；将处理后的片段使用重组克隆试剂盒克隆到pset152载体的ecori、xbai位点获得重组质粒pchw501
‑△
agmf。
[0080]
(3)构建敲除基因agmr的重组质粒
[0081]
敲除agmr基因簇分为两部分(大小分别为3042bp，417bp)进行pcr扩增，同时在引物两端设计同源区域序列，在大小为3042bp的片段在5’端添加ecori的酶切位点，大小为417bp 的片段在3’端添加bglii的酶切位点。以s.angustmyceticus jcm 4053总dna为模板分别扩增出两个片段，扩增所述2个片段的引物对f5、r5、f6、r6分别如表2所示；将处理后的
片段使用重组克隆试剂盒克隆到含有完整基因簇的重组载体ecori和bglii酶切处理后的载体上，获得重组质粒pchw501
‑△
agmr。
[0082]
表2
[0083]
引物名称5
’‑3’
f1aacagctatgacatgattacgaattcccgaacgggtgctgggtt(seq id no:21)r1cggacggcgtgctgtggt(seq id no:22)f2cctcttcgaggaggtggc(seq id no:23)r2agcttgggctgcaggtcgactctagatcaggcgctgccctggtc(seq id no:24)f3aacagctatgacatgattacgaattcccgaacgggtgctgggtt(同f1)r3cggacggcgtgctgtggt(同r1)f4cctcttcgaggaggtggc(同f2)r4agcttgggctgcaggtcgactctagagggtgtcatcgggcaactc(seq id no:25)f5aacagctatgacatgattacgaattcgcgaactcctggggctct(seq id no:26)r5catcggattcgacgacct(seq id no:27)f6gaggggcaggtcgtcgaatccgatgcctaatcgcagacttcgtg(seq id no:28)r6tactgcggagcctcactcg(seq id no:29)
[0084]
2、异源表达
[0085]
实验组：将所述构建的含有完整基因簇的重组质粒接合转移到宿主菌m1154中进行异源表达。
[0086]
对照1：将敲除基因agmf的重组质粒pchw501
‑△
agmf接合转移到宿主菌m1154中进行异源表达。
[0087]
对照2：将敲除基因agmr的重组质粒pchw501
‑△
agmr接合转移到宿主菌m1154中进行异源表达。
[0088]
对照3：将pset152载体接合转移到宿主菌m1154中进行异源表达。
[0089]
其中，宿主菌m1154为天蓝色链霉菌，本身不产生狭霉素。
[0090]
所述重组质粒接合转移到宿主菌m1154的操作过程为：
[0091]
①
将要接合转移的目标质粒先转化到大肠杆菌e.coli et12567/puz8002感受态中，待长出转化子后验证，将阳性单克隆接种于5ml的lb培养液中，37℃过夜培养，将菌液按10％接种于5ml lb培养液中37℃培养3～5h；
[0092]
②
取宿主菌m1154链霉菌孢子5000rpm离心3min，去上清后超纯水洗涤两次，5000rpm 离心3min去上清，加入700μl的tes，混匀后根据受体链霉菌的不同以不同的温度(45℃或50℃)热击激5min或者10min，再加入700μl 2x孢子预萌发液，30℃培养3～5h。
[0093]
③
将培养好的大肠杆菌于4℃，4,000rpm离心3min，去上清加入20ml lb洗涤两次后离心去上清，加入1ml lb培养基混匀大肠杆菌细胞；将培养好的链霉菌的受体孢子5,000 rpm离心3min，去上清后用20ml lb洗涤两次，将上述处理好的大肠杆菌与处理好的孢子混匀，涂布于ms培养皿上，24h后加入1ml含适量用于筛选的抗生素的超纯水来覆盖，置于30℃培养数天至接合子长出。
[0094]
3、将所述正负对照菌株与突变株的发酵液利用高效液相色谱(hplc)进行检测分析。结果如图4所示，从图4可知：确定agmt1,agmt2,agma,agmb,agmc,agmd,agme和agmf是狭
霉素a合成的必须基因，agmf与狭霉素c到狭霉素a的转化过程密切相关，agmr为调控基因。
[0095]
实施例3狭霉素a生物合成相关基因agmf编码的脱水酶agmf的体外功能验证
[0096]
1、agmf表达载体的构建
[0097]
将agmf基因利用pcr扩增后克隆至表达载体，具体步骤为：
[0098]
设计agmf蛋白的表达引物agmf
‑
exf(gtccatatgacacccaccatccat，如seq idno:30所示)和agmf
‑
exr(ggaattctcaggcgctgccctggtc，如seq id no:31所示)，使用kod plus高保真pcr酶进行扩增后使用ndei和ecori限制性内切酶进行处理后，克隆到ndei和ecori酶切后的载体pet28a上，得到agmf基因的表达载体。
[0099]
2、蛋白的表达：
[0100]
将所述表达载体转化到大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，在大肠杆菌中异源过量表达、纯化，通过sds
‑
page分析后得到较纯的蛋白agmf，具体步骤为：
[0101]
①
挑取阳性单克隆于5ml lb培养基中37℃过夜培养，按1％转接于500ml lb中，37℃培养到菌体od
600
至0.5～0.8，加入iptg(终浓度0.1～0.2mm)诱导，18℃培养20h，6000 rmp离心15min收集菌体；
[0102]
②
向上述收集到的菌体中加入适量(20ml～30ml)的裂解buffer，震荡混菌后用超声破碎仪超声破碎大肠杆菌细胞，4℃12000rpm离心20min取上清，在4℃条件下，将上清液装入有镍填料的重力柱中，用含有不同浓度(20mm～200mm)咪唑的tris buffer洗脱，对不同浓度下洗脱的样品进行sds
‑
page分析，收集较纯的蛋白样品。
[0103]
3、对所述蛋白样品进行分析
[0104]
图5为agmf蛋白sds
‑
page分析；通过生物信息学分析，发现agmf为sah水解酶家族蛋白，且可能含有nad

辅因子。
[0105]
4、体外生物转化反应
[0106]
一种狭霉素a的生物合成方法，所述方法包括：以狭霉素c为底物，在nad

的条件下，agmf催化狭霉素c的体外生化反应，经过液相及质谱检测，结果如图6所示，表明形成了狭霉素a。由此，可知agmf可催化狭霉素c的反应，并且作为狭霉素a生物合成路径的最后一步完成反应。
[0107]
随后，通过对agmf蛋白加热失活后的上清检测和对agmf蛋白进行同源建模发现 agmf蛋白自身结合nad

辅因子，反应在不额外添加辅因子的情况下也可以进行；同时发现agmf催化的是一个可逆反应，以狭霉素a为底物可以检测到狭霉素c的生成。
[0108]
实施例4狭霉素a生物合成相关基因agma编码的磷酸核糖水解酶agma的体外功能验证
[0109]
1、agma表达载体的构建
[0110]
将agma基因利用pcr扩增后克隆至表达载体，具体步骤为：
[0111]
设计agma蛋白的表达引物agma
‑
exf(gtccatatgaaatcggccgtcacc，如seqid no:32所示)和agma
‑
exr(ggaattctcatgcctccgccacctc，如seq id no:33 所示)，使用kod plus高保真pcr酶进行扩增后使用ndei和ecori限制性内切酶进行处理后，克隆到ndei和ecori酶切后的载体pet28a上，得到agma基因的表达载体。
[0112]
2、蛋白的表达：
[0113]
将所述表达载体转化到大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，在大肠杆菌中异源过量表
达、纯化，通过sds
‑
page分析后得到较纯的蛋白agma，具体操作为：
[0114]
①
挑取阳性单克隆于5ml lb培养基中37℃过夜培养，按1％转接于500ml lb中， 37℃培养到菌体od
600
至0.5～0.8，加入iptg(终浓度0.1～0.2mm)诱导，18℃培养20h，6000 rmp离心15min收集菌体；
[0115]
②
向上述收集到的菌体中加入适量(20ml～30ml)的裂解buffer，震荡混菌后用超声破碎仪超声破碎大肠杆菌细胞，4℃12000rpm离心20min取上清，在4℃条件下，将上清液装入有镍填料的重力柱中，用含有不同浓度(20mm～300mm)咪唑的tris buffer洗脱，对不同浓度下洗脱的样品进行sds
‑
page分析，收集较纯的蛋白样品。
[0116]
3、对所述蛋白样品进行分析
[0117]
图7为agma蛋白sds
‑
page分析，通过生物信息学分析，发现agma是磷酸核糖水解酶。
[0118]
4、体外生物转化反应
[0119]
以amp和damp为底物，在tris
‑
hcl的缓冲条件下，agma催化amp和damp糖苷键的水解生成腺嘌呤，如图8所示。由此可知agma可催化磷酸核糖的水解反应，为狭霉素的生物合成提供腺嘌呤前体。
[0120]
实施例5狭霉素体外生物合成的全过程
[0121]
1、agma、b、c、d、e、f基因表达载体的构建
[0122]
将agma、b、c、d、e、f基因利用pcr扩增后克隆至表达载体，
[0123]
具体步骤为：
[0124]
agma和agmf基因的表达载体如实施例3和实施例4中所述；
[0125]
agmb、d、e基因的表达载体构建步骤：
[0126]
设计agmb蛋白的表达引物agmb
‑
exf(gtccatatgaccaccgcaccccgc，如seqid no:34所示)和agmb
‑
exr(ggaattctcatgaggtgaactccgc，如seq id no:35 所示)，使用kod plus高保真pcr酶进行扩增后使用ndei和ecori限制性内切酶进行处理后，克隆到ndei和ecori酶切后的载体pet28a上，得到agmb基因的表达载体。
[0127]
设计agmd蛋白的表达引物agmd
‑
exf(gtccatatgccggctcccactgag，如seqid no:36所示)和agmd
‑
exr(ggaattctcaggcgggggagagggc，如seq id no:37 所示)，使用kod plus高保真pcr酶进行扩增后使用ndei和ecori限制性内切酶进行处理后，克隆到ndei和ecori酶切后的载体pet28a上，得到agmd基因的表达载体。
[0128]
设计agme蛋白的表达引物agme
‑
exf(gtccatatgacgcccacccatccc，如seqid no:38所示)和agme
‑
exr(ggaattcctagcccgggaagacggg，如seq id no:39 所示)，使用kod plus高保真pcr酶进行扩增后使用ndei和ecori限制性内切酶进行处理后，克隆到ndei和ecori酶切后的载体pet28a上，得到agme基因的表达载体。
[0129]
agmc基因的表达载体构建步骤：
[0130]
设计agmc蛋白的表达引物agmc
‑
exf(ggaattcatgagtgcccggcacccc，如seqid no:40所示)和agmc
‑
exr(cccaagctttcagtgggagccggcatg，如seq id no: 41所示)，使用kod plus高保真pcr酶进行扩增后使用ecori和hindiii限制性内切酶进行处理后，克隆到ecori和hindiii酶切后的含有麦芽糖结合蛋白标签的载体psj8上，得到agmc基因的表达载体。
[0131]
2、蛋白的表达
[0132]
将所述表达载体转化到大肠杆菌e.coli bl21(de3)中，在大肠杆菌中异源过量表达、纯化，通过sds
‑
page分析后得到较纯的蛋白agma、b、c、d、e、f，具体操作与实例例 4中类似，收集到较纯的蛋白样品。
[0133]
3、狭霉素a体外生物转化反应
[0134]
一种狭霉素a的生物合成方法，所述方法包括：
[0135]
在ph为8.0的tris
‑
hcl的缓冲体系下，同时添加mg
2
,nadp

,atp和6
‑
磷酸果糖，六个蛋白的共同作用下可以催化最终产物狭霉素a的生成。
[0136]
狭霉素在体外合成的路径被证实如图9所示：以6
‑
磷酸果糖为起始底物，磷酸阿洛酮糖异构酶agmd和磷酸阿洛酮糖焦磷酸激酶agmc的作用下催化6
‑
磷酸果糖形成化合物3；同时磷酸核糖水解酶agma水解amp(由atp转化生成)生成腺嘌呤，再以化合物3和腺嘌呤为底物，在磷酸阿洛酮糖转移酶agme的催化下，进行碳氮键的连接形成化合物4；化合物4在去磷酸化酶agmb蛋白的催化下，形成狭霉素c；最后在agmf蛋白的作用下狭霉素c脱水形成活性组分狭霉素a。
[0137]
在其他实施方式中，agma、b、c、d、e、f基因也可以构建到同一个表达载体中；
[0138]
在其他实施方式中，也可以分别构建agma基因的表达载体(如实施例4)、agmb基因的表达载体、agmc基因的表达载体、agmd基因的表达载体、agme基因的表达载体、agmf 基因的表达载体(如实施例3)，共转或者分别转染进大肠杆菌表达获得各自的蛋白。
[0139]
在其他实施方式中，进行生物转化时，也可以将含有所述重组表达载体的重组菌或转基因细胞系在培养条件下，直接加入底物，合成狭霉素a。
[0140]
4、狭霉素c外生物转化反应
[0141]
在缓冲体系下，以mg
2
,nadp

,amp和damp和6
‑
磷酸果糖为底物，在所述基因簇a 所表达的agma、agmb、agmc、agmd和agme的5个蛋白的共同作用下催化反应获得狭霉素c。
[0142]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0143]
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0144]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0145]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。