一种电活性固氮菌剂及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种电活性固氮菌剂及其制备方法与应用。


背景技术：

2.固氮微生物肥料是一种通过固氮微生物将空气中的氮气转化为植物作物可直接利用nh
4
的新型肥料。固氮微生物肥料可以通过微生物的固氮作用增加土壤的氮含量，并促进粮食增产，相对于传统氮肥具有污染小，效率高等优势，符合可持续发展生态农业的要求。
3.相关技术中，存在部分可实际使用的固氮微生物肥料，如利用根瘤固氮微生物制作固氮菌剂，可提高豆科作物的产量，但该固氮菌剂对于不能产生根瘤的作物并不能起到有效固氮的作用；利用芽孢杆菌制作固氮菌剂，可提高作物产量，但该固氮菌剂需要在严格的微氧环境中(氧含量为0.5％)实现固氮，但在实际应用中，该固氮微生物由于土壤中可用电子受体不足或受限，并不能发挥其固氮效果，从而使其固氮效果过低。因此，目前尚未有一种稳定高效的微生物土壤固氮菌剂可以适用于各种类型的稻田土壤，有效提高土壤的肥力。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种电活性固氮菌剂，该菌剂中含有电活性固氮菌geobacter sulfurreducens nif
‑
1，该菌于2021年1月13日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no:61427。本发明中的电活性固氮菌剂可以高效固氮，从而代替化肥提高土壤肥力，而且不会因呼吸链终端电子受体受限而引起固氮效率降低，具有极高的应用前景。
5.本发明的第一个方面，提供一种电活性固氮菌，该电活性固氮菌为geobacter sulfurreducens nif
‑
1，于2021年1月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no:61427。
6.地杆菌(geobacter)广泛分布于土壤、淡水沉积物、有机物及重金属污染的地下水沉积层等厌氧环境，具有丰富的胞外细胞色素，能够利用多种电子受体(如fe(iii)、腐殖质、电极、各种重金属等)进行胞外呼吸，具有较强的固氮能力。
7.geobacter sulfurreducens nif
‑
1的特征为：杆状，革兰氏阴性菌，最适宜生长温度为30℃，厌氧、专性化能异养菌，适宜ph约为7，其特点是可进行胞外呼吸并固氮。
8.发明人发现，通过乙炔还原法对geobacter sulfurreducens nif
‑
1进行固氮酶活性进行测定，发现geobacter sulfurreducens nif
‑
1的固氮酶活性为500
‑
600nmol/(mg
·
蛋白
·
h)，说明电活性固氮菌geobacter sulfurreducens nif
‑
1具有较强的固氮能力。
9.本发明的第二个方面，提供一种电活性固氮菌剂，该电活性固氮菌剂中含有geobacter sulfurreducens nif
‑
1。
10.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述电活性固氮菌剂中
还含有辅料。
11.在本发明的一些优选实施方式中，所述辅料包括吸附性矿石、草糠、生物碳、麸皮、铁元素。
12.当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，在不显著影响效果的情况下，合理替换或删减部分辅料。
13.在本发明的一些优选实施方式中，所述吸附性矿石包括膨胀蛭石、沸石、硅藻土、凹凸棒土、轻质碳酸钙、磷矿粉或钾矿粉。
14.在本发明的一些优选实施方式中，所述草糠包括菌菇糠、谷糠。
15.在本发明的一些优选实施方式中，所述生物碳包括草炭、水稻秸秆生物炭、玉米秸秆生物炭、花生壳生物炭。
16.在本发明的一些优选实施方式中，所述铁元素包括铁粉、含铁矿石粉、铁盐粉末。
17.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述电活性固氮菌剂中，geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌液与辅料的质量比为1：(15～20)。
18.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，按质量份计，所述辅料包括：15～20份吸附性矿石、35～40份草糠、5～10份生物碳、15～20份麸皮、5～10份铁元素。
19.在本发明中，电活性固氮菌剂中的铁元素和生物碳作为导电物质，可大大提高电活性固氮菌与土壤环境中其他微生物的协作，维持土壤环境的微生物群落多样性和稳定性。此外，铁元素会随稻田干湿交替过程，使土壤呈现厌氧及好氧过程的不断交替，实现fe(ii)与fe(iii)的变换，从而使其可作为电活性固氮菌胞外呼吸的电子受体循环被利用，实现高效固氮。
20.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述电活性固氮菌剂的制备方法包括如下步骤：
21.(1)将geobacter sulfurreducens nif
‑
1接种至nbaf无氮培养基进行活化，得到发酵种子液，然后将发酵种子液按1
‑
3％(v/v)的接种量重新接种至nbaf无氮培养基中，30℃厌氧发酵5～7天，得到geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌液，将菌液在真空低温干燥，得到菌粉。
22.(2)将干燥后的菌粉与辅料均匀混合，得到电活性固氮菌剂。
23.本发明的第三个方面，提供本发明第二个方面所述的电活性固氮菌剂在堆肥中的应用。
24.本发明中的电活性固氮菌剂能够有效促进堆肥过程中氮含量的提高，从而获得更加优质的生物发酵氮肥。
25.本发明的第四个方面，提供本发明第二个方面所述的电活性固氮菌剂在土壤治理中的应用。
26.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述电活性固氮菌剂在土壤中的混合体积比为3～10％。
27.在本发明的一些优选实施方式中，所述电活性固氮菌剂在土壤中的混合体积比为5～7％。
28.在本发明的一些优选实施方式中，所述土壤包括但不限于各类稻田土壤。
29.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述土壤治理包括提高
土壤固氮酶活，增加土壤固氮总量。
30.本发明的有益效果是：
31.1.本发明中的电活性固氮菌geobacter sulfurreducens nif
‑
1，其兼具完整的固氮基因簇和较强的固氮能力，能够广泛用于生物堆肥、土壤治理等方面。
32.2.本发明中的电活性固氮菌剂能够显著提高土壤固氮酶活及土壤中的总氮含量，从而有效提高土壤的肥力，促进农作物生长。
33.3.本发明中的电活性固氮菌剂不会受制于呼吸链终端电子受体以及使用环境，制备方法简单，可以适用于各种类型的稻田土壤，具有广泛的农业适用性。
附图说明
34.图1为本发明实施例中的geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌液。
具体实施方式
35.为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
36.所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
37.实验材料
38.本发明实施例中的电活性固氮菌株，命名为nif
‑
1，分类号：硫还原地杆菌属geobacter sulfurreducens，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏号：gdmcc no.61427。该细菌特征为：杆状，革兰氏阴性菌，最适宜生长温度为30℃，厌氧、专性化能异养菌，适宜ph约为7，其特点是可进行胞外呼吸并固氮。
39.本发明实施例中的电活性固氮菌株的培养基为nbaf无氮培养基，具体配方如表1所示。
40.表1 nbaf无氮培养基配方
41.成分含量富马酸4.64g100
×
nb盐10mlnb矿物质**10mldl维生素***15mlcacl2·
2h2o0.04gmgso4·
7h2o0.1gnahco38gna2co3·
h2o0.5g1mm na2seo41.0ml乙酸钠
·
3h2o2.04g0.1％刃天青0.5mlh2o定容至1000ml
42.其中，nbaf无氮培养基ph调整至6.5
‑
7.0。
43.每升100
×
nb盐溶液中含有42g kh2po4，22g k2hpo4，38g kcl，36g nacl。
44.每升nb矿物质溶液中含有2.14g次氮基三乙酸(nta)；0.1g mncl2·
4h2o；0.3g feso4·
7h2o；0.17g cocl2·
6h2o；0.2g znso4·
7h2o；0.03g cucl2·
2h2o；0.005g alk(so4)2·
2h2o；0.005g h3bo3；0.09g na2mno4·
2h2o；0.11g niso4·
6h2o；0.02g na2wo4·
2h2o。
45.每升dl维生素溶液中含有0.005g维生素b5；0.0001g维生素b12；0.005g对氨基苯甲酸；0.005gα
‑
硫辛酸；0.005g烟酸；0.005g维生素b1；0.005g核黄素；0.01g维生素b6；0.002g叶酸。
46.实施例1一种电活性固氮菌剂
47.按质量比计，本实施例中的电活性固氮菌剂由1份geobacter sulfurreducens nif
‑
1微生物菌剂和19份辅料组成。
48.按质量比计，本实施例中的辅料为：膨胀蛭石20份、菌菇糠40份、水稻秸秆生物碳10份、麸皮20份、铁粉10份。
49.具体制备方法包括如下步骤：
50.(1)geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌液的制备：
51.a)将geobacter sulfurreducens nif
‑
1接种至上述实施例中的nbaf无氮培养基进行活化，得到发酵种子液，然后将发酵种子液按1％(v/v)的接种量接种至50l的nbaf无氮培养基中，并于厌氧发酵罐30℃发酵6天，得到geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌液，真空低温干燥，得到菌粉。
52.b)将步骤a)获得的geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌粉与辅料按照质量比为1:19的比例进行混合，得到电活性固氮菌剂。
53.对本实施例中制得的电活性固氮菌剂进行活菌数检测，检测方法采用本领域常规手段。
54.结果发现，本实施例中制得的电活性固氮菌剂中的geobacter sulfurreducens nif
‑
1的活菌数为2.3
×
108个/g，其结果符合国家标准《微生物菌剂》gb20287
‑
2006要求的2
×
108个/g，可以用作实际使用。
55.制备得到的geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌液如图1所示。
56.实施例2一种电活性固氮菌剂
57.按质量比计，本实施例中的电活性固氮菌剂由1份geobacter sulfurreducens nif
‑
1微生物菌剂和19份辅料组成。
58.按质量比计，本实施例中的辅料为：膨胀蛭石20份、菌菇糠40份、水稻秸秆生物碳10份、麸皮20份、铁粉10份。
59.具体制备方法包括如下步骤：
60.(1)geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌液的制备：
61.a)将geobacter sulfurreducens nif
‑
1接种至上述实施例中的nbaf无氮培养基进行活化，得到发酵种子液，然后将发酵种子液按3％(v/v)的接种量接种至50l的nbaf无氮培养基中，并于厌氧发酵罐30℃发酵5～7天，得到geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌液，真空低温干燥，得到菌粉。
62.b)将步骤a)获得的geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌粉与辅料按照质量比为1:19的比例进行混合，得到电活性固氮菌剂。
63.对本实施例中制得的电活性固氮菌剂进行活菌数检测，检测方法采用本领域常规手段。
64.结果发现，本实施例中制得的电活性固氮菌剂中的geobacter sulfurreducens nif
‑
1的活菌数为3.1
×
108个/g，其结果符合国家标准《微生物菌剂》gb20287
‑
2006要求的2
×
108个/g，可以用作实际使用。
65.实施例3一种电活性固氮菌剂
66.按质量比计，本实施例中的电活性固氮菌剂由1份geobacter sulfurreducens nif
‑
1微生物菌剂和19份辅料组成。
67.按质量比计，本实施例中的辅料为：膨胀蛭石20份、菌菇糠40份、水稻秸秆生物碳10份、麸皮20份、铁粉10份。
68.具体制备方法包括如下步骤：
69.(1)geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌液的制备：
70.a)将geobacter sulfurreducens nif
‑
1接种至上述实施例中的nbaf无氮培养基进行活化，得到发酵种子液，然后将发酵种子液按3％(v/v)的接种量接种至40l的nbaf无氮培养基中，并于厌氧发酵罐30℃发酵7天，得到geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌液，真空低温干燥，得到菌粉。
71.b)将步骤a)获得的geobacter sulfurreducens nif
‑
1菌粉与辅料按照质量比为1:19的比例进行混合，得到电活性固氮菌剂。
72.对本实施例中制得的电活性固氮菌剂进行活菌数检测，检测方法采用本领域常规手段。
73.结果发现，本实施例中制得的电活性固氮菌剂中的geobacter sulfurreducens nif
‑
1的活菌数为3.3
×
108个/g，其结果符合国家标准《微生物菌剂》gb20287
‑
2006要求的2
×
108个/g，可以用作实际使用。
74.电活性固氮菌剂的实际使用效果
75.(1)实施例1中的电活性固氮菌剂的实际使用效果：
76.在本实施例中，土壤样品取自福建省福州市某水稻田。
77.具体实验步骤如下：
78.取实施例1中的电活性固氮菌剂，按5％(重量比)的添加量与土壤样品混合，进行微宇宙实验(模式生态系统，实验方法参照本领域相关实验手册)，以不加电活性固氮菌剂的土壤样品作为对照，实验进行7天后，进行固氮酶活性(固氮酶活)及总氮测定。固氮酶活采用乙炔还原法测定，利用气相色谱(岛津gc 2014)进行测定。土壤总氮采用半微量凯氏定氮法测定。
79.实验结果如表1所示。
80.利用乙炔还原法对添加电活性固氮菌剂及对照组进行固氮酶活测定，结果发现，添加电活性固氮菌剂的土壤固氮酶活为2.3nmol/(g
·
soil
·
h)，而对照组的固氮酶活仅为1.5nmol/(g
·
soil
·
h)。此外，通过对土壤总氮进行分析，结果表明，添加电活性固氮菌剂的土壤固氮总量为5.75kg n/公顷/年，而未添加电活性固氮菌剂的对照组中的固氮总量为
oneidensis固氮菌剂的固氮总量为3.32kg n/公顷/年，添加bradyrhizobium japonicum固氮菌剂的固氮总量为3.75n/公顷/年。相对于shewanella oneidensis固氮菌剂和bradyrhizobium japonicum固氮菌剂，实施例3中的电活性固氮菌剂使土壤的固氮总量分别提高了28％与12％。
99.表3添加电活性固氮菌剂与其他固氮菌剂土壤固氮酶活固氮总量。
[0100][0101]
可以发现，相对于不具有电活性的固氮菌bradyrhizobium japonicum和不具固氮能力的电活性菌株shewanella oneidensis，本发明实施例中的geobacter sulfurreducens nif
‑
1显然具有更好的固氮效果。
[0102]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。