一种SARS-CoV-2的可视化LAMP同步检测试剂盒及检测方法与流程

一种sars
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cov
‑
2的可视化lamp同步检测试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种sars
‑
cov
‑
2的可视化lamp同步检测试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.新冠病毒，又称为新型冠状病毒，国际病毒分类委员会已将其命名为“sars
‑
cov
‑
2”。新型冠状病毒肺炎临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现，鼻塞、流涕等上呼吸道症状少见。约半数患者多在一周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒征休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍。
3.按照最新指南规定，利用荧光rt
‑
pcr检测新型冠状病毒核酸阳性仍然是确诊的金标准。但需要较昂贵的仪器和专业的技术人员，检测时间长，试验成本也偏高。
4.环介导等温扩增(lamp)检测技术的特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在bst dna聚合酶的作用下，恒温条件下进行核酸扩增，具有操作简单、特异性强特点。另外通过环引物的添加，大大加快了反应的速度。lamp检测技术最大的优势在于不依赖于昂贵的专业检测设备，该方法简便易操作，实验流程简单快速，不具备专业技能的一般人员就能在疾病现场进行快速诊断。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种sars
‑
cov
‑
2的可视化lamp同步检测试剂盒及检测方法。该试剂盒定性准确、重复性好、灵敏度高、快速、简单，具有较低的应用成本。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种sars
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cov
‑
2的可视化lamp同步检测试剂盒，包括：sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
f3引物、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
b3引物、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
fip引物、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
bip引物、1
×
lamp pcr master mix、bst 3.0dna聚合酶、钙黄绿素
‑
mn
2
染料和ddh2o；
7.所述检测新冠病毒sars
‑
cov
‑
2的n基因的rt
‑
lamp引物组包括2条外引物sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
f3/sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
b3和2条内引物sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
fip/sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
bip；所述sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
f3的核苷酸序列为seq id no.1，sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
b3的核苷酸序列为seq id no.2，sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
fip的核苷酸序列为seq id no.3，sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
bip的核苷酸序列为seq id no.4。
8.优选的，在检测新冠病毒sars
‑
cov
‑
2的n基因的rt
‑
lamp引物组中，sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
f3、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
b3、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
fip、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
bip的摩尔比为1:1:4:4。
9.优选的，还包括2
×
lamp pcr master mix和钙黄绿素
‑
mn
2
染料试剂。
10.本发明提供的基于rt
‑
lamp技术检测新冠病毒用引物组，包括检测新冠病毒sars
‑
cov
‑
2的n基因的rt lamp引物组。本发明以n基因作为检测新冠病毒的靶标片段来设计rt
‑
lamp检测引物，经过优化筛选，得到的最优引物组在检测新冠病毒时具有特异性强的特点；
另外，与现有行业检测金标准
‑
荧光定量pcr检测方法相比，能够达到相似的检测灵敏度，检测灵敏度达到40拷贝/20μl，而检测时间缩短至40min，比荧光定量pcr检测方法(耗时90min)缩短了50min，实现快速高效准确检测。
附图说明
11.图1是本发明实施例1的sars
‑
cov
‑
2的rt
‑
lamp反应检测体系扩增结果。
12.图2是本发明实施例2的一种sars
‑
cov
‑
2的可视化lamp同步检测体系的实验结果。
具体实施方式
13.本实施例的一种sars
‑
cov
‑
2的可视化lamp同步检测试剂盒，包括：sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
f3引物、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
b3引物、sars
‑
cov
‑2‑
n
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fip引物、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
bip引物、1
×
lamp pcr master mix、bst 3.0dna聚合酶、钙黄绿素
‑
mn
2
染料和ddh2o；
14.所述检测新冠病毒sars
‑
cov
‑
2的n基因的rt
‑
lamp引物组包括2条外引物sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
f3/sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
b3和2条内引物sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
fip/sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
bip；所述sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
f3的核苷酸序列为seq id no.1，sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
b3的核苷酸序列为seq id no.2，sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
fip的核苷酸序列为seq id no.3，sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
bip的核苷酸序列为seq id no.4。
15.优选的，在检测新冠病毒sars
‑
cov
‑
2的n基因的rt
‑
lamp引物组中，sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
f3、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
b3、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
fip、sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
bip的摩尔比为1:1:4:4。
16.实施例1
17.在本发明中，所述试剂盒的使用方法，优选包括以下步骤：待检测基因组dna 1μl、浓度为100μm的sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
f3引物0.5μl、浓度为100μm的sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
b3引物0.5μl、浓度为100μm的sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
fip引物2μl、浓度为100μm的sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
bip引物2μl、1
×
lamp pcr master mix 12.5μl、0.16u/μl的bst 3.0dna聚合酶0.5μl、ddh2o补足至25μl。
18.扩增结果如图1所示，图中1依次为本实施例的sars
‑
cov
‑
2的lamp同步检测结果，m为dna marker，1：sars
‑
cov
‑
2基因逆转录质粒；2：双蒸水(阴性对照)由图可见，阳性组出现典型的梯形条带。
19.实施例2
20.在本发明中，所述试剂盒的使用方法，优选包括以下步骤：待检测基因组dna 1μl、浓度为100μm的sars
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cov
‑2‑
n
‑
f3引物0.5μl、浓度为100μm的sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
b3引物0.5μl、浓度为100μm的sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
fip引物2μl、浓度为100μm的sars
‑
cov
‑2‑
n
‑
bip引物2μl、1
×
lamp pcr master mix 12.5μl、0.16u/μl的bst 3.0dna聚合酶0.5μl、浓度为625μm的钙黄绿素、浓度为12.5mm的mn
2
，ddh2o补足至25μl。
21.实验结果如图2所示，图中2依次为本实施例的sars
‑
cov
‑
2的lamp同步检测可视化结果sars
‑
cov
‑
2基因逆转录质粒和双蒸水(阴性对照)，由图可见，阳性组的反应体系颜色由棕黄色变为绿色，阴性组反应体系仍为棕黄色。
22.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单地修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。