与切断型的突变型Calreticulin结合的抗体以及骨髄增殖性肿瘤的诊断、预防或治疗药的制作方法

与切断型的突变型calreticulin结合的抗体以及骨髄增殖性肿瘤的诊断、预防或治疗药
技术领域
1.本发明涉及一种骨髄增殖性肿瘤的诊断、预防和治疗药。


背景技术：

2.在费城染色体阴性骨髄增殖性肿瘤(philadelphia
‑
negative myeloproliferative neoplasms；mpns)患者的一部分中，在calreticulin(calr)基因的第9外显子上发现碱基缺失或插入(非专利文献1、2)。已经查明：由calr突变基因产生的突变型calr蛋白质通过将促血小板生成素受体常时活化，具有单独引起骨髄增殖性肿瘤(mpn)的致肿瘤性(非专利文献3～6)。
3.在mpn患者所发现的calr基因突变是一定在最终外显子所局限的部位的移码突变，由移码突变导致的氨基酸的读取框的错位一定是 1。由此，在突变型calr蛋白质的羧基末端存在野生型中不存在的序列，特别是其羧基末端的44个氨基酸在几乎全部的突变型calr蛋白质是共通的。作为其实例，图1中示出将在mpn患者所发现的calr基因突变中频率最高的52碱基缺失型(del 52)、频率第二高的5碱基插入型(ins 5)的羧基末端的序列与野生型calr蛋白质的该区域比较的情况。
4.由于作为引起mpn的原因的突变型calr蛋白质在肿瘤细胞中表达，因此，暗示将移码突变而产生的突变型calr蛋白质所特异的序列作为新抗原而成为诊断时的标记物、或治疗靶标的可能性(专利文献1～2)。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：日本特表2016
‑
537012号公报
8.专利文献2：国际公开第2016/087514号
9.非专利文献
10.非专利文献1：klampfl t,gisslinger h,harutyunyan as,et al.somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.the new england journal of medicine.2013；369：2379
‑
90.
11.非专利文献2：nangalia j,massie ce,baxter ej,et al.somatic calr mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated jak2.the new england journal of medicine.2013；369：2391
‑
405.
12.非专利文献3：araki m,yang y,masubuchi n,et al.activation of the thrombopoietin receptor by mutant calreticulin in calr
‑
mutant myeloproliferative neoplasms.blood.2016；127：1307
‑
16.
13.非专利文献4：elf s,abdelfattah ns,chen e,et al.mutant calreticulin requires both its mutant c
‑
terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation.cancer discov.2016；6：368
‑
81.
14.非专利文献5：marty c,pecquet c,nivarthi h,et al.calreticulin mutants in mice induce an mpl
‑
dependent thrombocytosis with frequent progression to myelofibrosis.blood.2016；127：1317
‑
24.
15.非专利文献6：vainchenker w,kralovics r.genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms.blood.2017；129：667
‑
79.


技术实现要素：

16.发明所要解决的课题
17.但是，已判明：在识别由于上述的移码突变而出现的突变型calr蛋白质的特异的序列(新抗原)的抗体不能准确地检测细胞提取液或细胞表面的突变型calr蛋白质。
18.因此，本发明的课题在于提供一种能够准确地检测mpn的突变型calr基因和蛋白质的检测手段、mpn的诊断、预防或治疗药、以及mpn治疗药的筛选方法。
19.用于解决课题的方法
20.本发明人进一步重复进行了突变型calr蛋白质的功能分析，结果发现：所表达的突变型calr蛋白质大多在在突变型蛋白质的特异的序列(图1)之中被切断，认为是新抗原的序列的大部分被丢失的突变型calr蛋白质大量表达。因此，制作特异性地识别位于新抗原中的比切断部位更靠氨基末端侧的非常短的氨基酸序列的抗体，结果，在不仅培养细胞、而且在患者末梢血细胞、患者血小板中，确认到被切断的突变型calr蛋白质的表达。进而解明了：使用该抗体时，细胞表面的突变型calr蛋白质的检测灵敏度飞跃性提高，进而可以得到优异的mpn治疗效果。由此解明了：在具有calr基因突变的mpn患者的诊断或治疗中，通过不仅检测包含全长型(未切断型)设为靶标，而且检测包含切断型的突变型calr蛋白质或设为靶标，能够开发更高性能的医药品。另外，强烈暗示通过抑制突变型calr蛋白质的切断，能够使以由于切断而丢失的序列为靶标的医药品的效果增强，完成了本发明。
21.即，本发明提供以下的[1]～[14]。
[0022]
[1]一种与切断后的突变型calr蛋白质结合的抗体或其功能性片段，其具有对于(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽链、或(b)由序列号1中缺失、取代或添加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽链的抗原识别部位。
[0023]
[2]如[1]所述的与切断后的突变型calr蛋白质结合的抗体或其功能性片段，其选自以下的(c)、(d)和(e)。
[0024]
(c)免疫球蛋白vh链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号17、18和19所示的氨基酸序列、或序列号17、18和19所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽、且免疫球蛋白vl链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号26、27和28所示的氨基酸序列、或序列号26、27和28所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的抗体；
[0025]
(d)免疫球蛋白vh链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号20、21和22所示的氨基酸序列、或序列号20、21和22所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽、且免疫球蛋白vl链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号29、30和31所示的氨基酸序列、或序列号29、30和31所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个
氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的抗体；
[0026]
(e)免疫球蛋白vh链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号23、24和25所示的氨基酸序列、或序列号23、24和25所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽、且免疫球蛋白vl链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号32、33和34所示的氨基酸序列、或序列号32、33和34所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的抗体。
[0027]
[3]如[1]或[2]所述的与切断后的突变型calr蛋白质结合的抗体或其功能性片段，其选自以下的(c)、(d)和(e)。
[0028]
(c)具有由序列号5所示的氨基酸序列、或序列号5所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vh链、和由序列号8所示的氨基酸序列、或序列号8所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vl链的抗体；
[0029]
(d)具有由序列号6所示的氨基酸序列、或序列号6所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vh链、和由序列号9所示的氨基酸序列、或序列号9所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vl链的抗体；
[0030]
(e)具有由序列号7所示的氨基酸序列、或序列号7所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vh链、和由序列号10所示的氨基酸序列、或序列号10所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vl链的抗体。
[0031]
[4]一种抗体或其功能性片段，其在与切断型的突变型calr蛋白质中的序列号1所示的氨基酸序列部分的结合中，与[2]或[3]的抗体竞争。
[0032]
[5]一种医药组合物，其含有[1]～[4]中任一项所述的抗体或其功能性片段。
[0033]
[6]如[5]所述的医药组合物，其为骨髄增殖性肿瘤的诊断、预防或治疗药。
[0034]
[7]一种与骨髄增殖性肿瘤关联的突变型calr蛋白质的检测方法，其特征在于，检测生物体试样中的以下的(a)或(b)的多肽。
[0035]
(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽；
[0036]
(b)由序列号1中缺失、取代或添加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽。
[0037]
[8]如[7]所述的突变型calr蛋白质的检测方法，其中，(a)或(b)的多肽的检测为使用[1]～[4]中任一项所述的抗体或其功能性片段的免疫学检测。
[0038]
[9]一种骨髄增殖性肿瘤治疗药的筛选方法，其特征在于，筛选与以下的(a)或(b)的多肽结合的药物。
[0039]
(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽；
[0040]
(b)由序列号1中缺失、取代或添加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽。
[0041]
[10]一种骨髄增殖性肿瘤的诊断方法，其特征在于，检测生物体试样中的以下的(a)或(b)的多肽。
[0042]
(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成的多肽；
[0043]
(b)由序列号1中缺失、取代或添加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽。
[0044]
[11]如[10]所述的诊断方法，其中，(a)或(b)的多肽的检测为使用[1]～[4]中任
一项所述的抗体或其功能性片段的免疫学检测。
[0045]
[12]一种骨髄增殖性肿瘤的预防或治疗方法，其特征在于，给药[1]～[4]中任一项所述的抗体或其功能性片段。
[0046]
[13]如[1]～[4]中任一项所述的抗体或其功能性片段，其用于骨髄增殖性肿瘤的诊断。
[0047]
[14][1]～[4]中任一项所述的抗体或其功能性片段在用于制造骨髄增殖性肿瘤诊断药中的用途。
[0048]
发明的效果
[0049]
如果使用具有对于上述(a)或(b)的多肽链的抗原识别部位(表位)的抗体，则能够检测由于突变型calr蛋白质的切断而产生的突变型calr蛋白质，细胞表面的突变型calr蛋白质的检测灵敏度飞跃性提高。因此，如果使用本发明的mpn诊断药，则mpn的检测灵敏度飞跃性提高。另外，如果使用该抗体，则能够特异性地预防或治疗mpn。另外，如果筛选与(a)和(b)的多肽结合的药物，则能够筛选mpn治疗药。
附图说明
[0050]
图1是表示突变型calr蛋白质的特征的图。作为骨髄增殖性肿瘤患者的发症原因的calr基因突变是 1移码突变，在其得到的突变型calr蛋白质的羧基末端出现突变型蛋白质中共通的氨基酸序列。sp：信号序列、n：n结构域、p：p结构域。箭头表示与野生型(wt)不同的氨基酸序列开始的部分。
[0051]
图2是表示识别calr蛋白质的氨基末端侧和突变型calr蛋白质的羧基末端侧的序列的抗体的图。识别calr蛋白质的氨基末端侧的序列的抗体是识别比突变型calr蛋白质的突变部位更靠氨基末端侧的氨基酸序列的市售的抗体(抗calr抗体)。另外，识别突变型calr蛋白质的羧基末端的序列的抗体是识别在calr蛋白质的羧基末端侧由碱基序列的突变而新形成的氨基酸序列的市售的抗体(抗突变型calr抗体)。
[0052]
图3是表示对由ut
‑
7/tpo细胞(komatsu n.et al.，blood，1996，87，4552
‑
4556)分泌的蛋白质使用图2的抗体进行了免疫印迹分析的结果的图。由于vec为仅导入了表达载体的细胞，因此，与ut
‑
7/tpo细胞/calr(wt)同样地检测出内源性的calr蛋白质。在del 52型和ins 5型中，仅由抗calr抗体就可以检测出分子量比利用抗突变型calr抗体检测出的全长型的突变型calr蛋白质小的突变型calr蛋白质(图中的星号)。另外，在ins 5型中，由于全长型的突变型calr蛋白质几乎被泳动至与内源性的野生型calr蛋白质相同的位置，因此，无法用抗calr抗体特异性检出。
[0053]
图4表示在突变型calr蛋白质的代表性的del 52型和ins 5型的氨基(n)末端和羧基(c)末端融合有flag标记(flag
‑
tag)的蛋白质的示意图。用黑色图示突变型特异的序列，用斜线图示flag tag。
[0054]
图5是表示通过使用了抗flag抗体的流式细胞术分析对细胞表面上的突变型calr蛋白质的量进行了测定的结果的图。与有无切断无关，表达tag残存的在n末端配置有flag tag的突变型calr蛋白质的细胞与由于在突变型calr蛋白质特异的序列内产生的切断而切掉c末端flag的细胞相比，检测到强的信号。另外，可看到del 52型的表达量低于ins 5型这样的差异。
[0055]
图6表示识别位于比突变型calr蛋白质特异的序列(黑色)内所产生的蛋白质的切断部位更靠氨基末端侧的突变型特异的序列的抗体。
[0056]
图7表示使用图6的抗体对图3中使用的细胞进行了流式细胞术分析的结果。由于flag tag的添加位置引起的检测量的不同消失。另外，可看到del 52型的表达量低于ins 5型这样的差异。
[0057]
图8是表示骨髄增殖性肿瘤患者细胞中的切断型calr蛋白质的检测的图。使用识别位于比突变型calr蛋白质特异的序列内所产生的蛋白质的切断部位更靠氨基末端侧的氨基酸序列的抗体，通过免疫印迹法对由患者细胞制备的细胞提取液进行分析。在具有calr基因突变的骨髄增殖性肿瘤患者的末梢血单核细胞或血小板中，检测出了能够被该抗体识别的切断型的突变型calr蛋白质的表达。
[0058]
图9是表示克隆b3、c6、g1抗体均识别全长型和切断型的突变型calr蛋白质的图。是表示对从ut
‑
7/tpo细胞中分泌的蛋白质使用克隆b3抗体和克隆c6、g1抗体进行了免疫印迹分析的结果的图。与抗flag抗体同样地，即使使用b3、c6、g1任一种抗体也能够检测在氨基末端的信号序列的下游添加flag tag的del 52型和ins 5型的全长型以及更低分子量的切断型这两者。
[0059]
图10是表示克隆b3、c6、g1抗体均识别细胞表面的突变型calr蛋白质的图。是表示对表达添加flag tag的del 52型或ins 5型的突变型calr蛋白质的ut
‑
7/tpo细胞、仅导入表达载体的ut
‑
7/tpo/vec细胞，使用克隆b3抗体和克隆c6、g1抗体进行流式细胞术分析，测定了细胞表面上的突变型calr蛋白质的量的结果的图。另外，del 52型与ins 5型相比表达量低，因此，可看到由于突变的类型引起的信号强度的差异。
[0060]
图11是表示克隆b3、c6、g1抗体对于突变型calr蛋白质的结合能的评价结果的图。使用克隆b3抗体和克隆c6、g1抗体、对照的大鼠igg，利用elisa法评价对于del 52型的突变型calr蛋白质的结合特异性。克隆b3、c6、g1抗体均检测出浓度依赖性的与突变型calr蛋白质的特异性结合。
[0061]
图12是表示利用表面等离激元共振分析法评价了克隆b3抗体与用于抗体的制作的抗原的结合强度的结果的图。利用表面等离激元共振分析法评价了克隆b3抗体与用于抗体的制作的抗原的结合强度。
[0062]
图13a是表示利用免疫印迹法鉴定克隆b3、c6、g1抗体的抗原识别序列的结果的图。表达在del 52型的突变型calr蛋白质中将图中所记载的氨基酸取代为丙氨酸(a)的蛋白质，对各个抗体的反应性使用免疫印迹法进行评价。原始(intact)表示没有进行氨基酸取代的del 52型的突变型calr蛋白质。被黑粗线围起来的氨基酸表示抗体的制作中使用的抗原序列。
[0063]
图13b是表示利用elisa法鉴定克隆b3、c6、g1抗体的抗原识别序列的结果的图。使用elisa法评价各个抗体对于与图13a相同的蛋白质的反应性。原始(intact)表示没有进行氨基酸取代的del 52型的突变型calr蛋白质。被黑粗线围起来的氨基酸表示抗体的制作中使用的抗原序列。
[0064]
图14是表示本发明抗体(b3、c6、g1)的重链可变区域的氨基酸序列的图。
[0065]
图15是表示本发明抗体(b3、c6、g1)的轻链可变区域的氨基酸序列的图。
[0066]
图16是表示本发明抗体(b3、c6、g1)的重链可变区域的碱基序列的图。
[0067]
图17是表示本发明抗体(b3、c6、g1)的轻链可变区域的碱基序列的图。
[0068]
图18是表示利用b3小鼠嵌合体抗体所得到的对mpn模型小鼠的治疗效果的图。对于移植表达del 52型的突变型calr蛋白质的造血干细胞而制造出的骨髄增殖性肿瘤模型小鼠(calr del 52小鼠)、移植或导入对照载体的造血干细胞而制作的对照小鼠，从移植后第9周每周给药b3嵌合体抗体、或溶剂(pbs)，评价骨髄增殖性肿瘤模型小鼠中特征性的血小板增多的抑制效果。
具体实施方式
[0069]
作为本发明的与mpn相关的突变型calr蛋白质的检测和诊断方法以及mpn的预防或治疗的靶标使用的上述(a)或(b)的多肽为在突变型calr蛋白质中在特异性的序列(与图1中的突变型calr蛋白质共通的44个氨基酸)中被切断而残存的羧基末端侧的多肽。
[0070]
野生型calr蛋白质具有图1所示的氨基酸序列(序列号2)。另外，在calr基因突变之中频率最高的52碱基缺失型(del 52)具有图1所示的氨基酸序列(序列号3)。另外，在calr基因突变中，频率第二高的5碱基插入型(ins 5)具有图1所示的氨基酸序列(序列号4)。另外，图1中的被框包围的区域为突变型calr蛋白质中共通的氨基酸序列。切断型的突变型calr蛋白质仅包含该共通区域的氨基末端侧的仅13个氨基酸。本发明人首次发现：该共通区域被切断而产生切断型的突变型calr蛋白质，共通区域的大部分从突变型calr蛋白质丢失。
[0071]
多肽(a)由序列号1所示的氨基酸序列构成。作为多肽(b)的缺失、取代或添加有1个或数个氨基酸的氨基酸序列，优选在序列号1中缺失、取代或添加有1～4个氨基酸的氨基酸序列，更优选缺失、取代或添加有1～3个氨基酸的氨基酸序列。更具体而言，更优选从序列号1的羧基末端侧缺失了3个氨基酸的氨基酸序列。另外，多肽(b)的氨基酸序列和序列号1的氨基酸序列的同一性优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上。
[0072]
在本发明的与mpn相关的突变型calr蛋白质的检测方法以及mpn诊断、预防、治疗方法中，使用与生物体试样中的上述(a)或(b)的多肽结合的抗体或其功能性片段。
[0073]
作为上述抗体，只要是具有对于(a)或(b)的多肽链的抗原识别部位(表位)的抗体即可，可以为仅与切断型的突变型calr蛋白质结合的抗体，也可以为与切断型的突变型calr蛋白质和全长型的突变型calr蛋白质的两者结合的抗体，优选为与切断型的突变型calr蛋白质和全长型的突变型calr蛋白质的两者结合的“突变型calr蛋白质”特异性的抗体。作为具体例，可以列举选自以下的(c)、(d)和(e)中的抗体。
[0074]
(c)免疫球蛋白vh链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号17、18和19所示的氨基酸序列、或序列号17、18和19所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽、且免疫球蛋白vl链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号26、27和28所示的氨基酸序列、或序列号26、27和28所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的抗体。
[0075]
(d)免疫球蛋白vh链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号20、21和22所示的氨基酸序列、或序列号20、21和22所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽、且免疫球蛋白vl链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号29、30和31所示的氨基酸序列、或序列号29、30和31所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个
氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的抗体。
[0076]
(e)免疫球蛋白vh链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号23、24和25所示的氨基酸序列、或序列号23、24和25所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽、且免疫球蛋白vl链的cdr1、cdr2和cdr3分别为由序列号32、33和34所示的氨基酸序列、或序列号32、33和34所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽的抗体。
[0077]
作为上述序列号17～34所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列，优选在序列号17～34中缺失、取代或添加有1～4个氨基酸的氨基酸序列，更优选缺失、取代或添加有1～3个氨基酸的氨基酸序列，进一步优选缺失、取代或添加有1～2个氨基酸的氨基酸序列。另外，序列号17～34所示的氨基酸序列和缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列的同一性优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上。
[0078]
作为具有对于上述的(a)或(b)的多肽链的抗原识别部位(表位)的抗体，进一步优选为选自以下的(c)、(d)和(e)的抗体。
[0079]
(c)具有由序列号5所示的氨基酸序列、或序列号5所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vh链、和由序列号8所示的氨基酸序列、或序列号8所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vl链的抗体。
[0080]
(d)具有由序列号6所示的氨基酸序列、或序列号6所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vh链、和由序列号9所示的氨基酸序列、或序列号9所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vl链的抗体。
[0081]
(e)具有由序列号7所示的氨基酸序列、或序列号7所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vh链、和由序列号10所示的氨基酸序列、或序列号10所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列构成的免疫球蛋白vl链的抗体。
[0082]
作为上述序列号5～10所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列，优选在序列号5～10中缺失、取代或添加有1～10个氨基酸的氨基酸序列，更优选缺失、取代或添加有1～8个氨基酸的氨基酸序列，进一步优选缺失、取代或添加有1～5个氨基酸的氨基酸序列。另外，序列号5～10所示的氨基酸序列和序列号5～10所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加有1个～数个氨基酸的氨基酸序列的同一性优选为80％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上。
[0083]
本发明的抗体具有上述(c)～(e)的各cdr的序列、或(c)～(e)的免疫球蛋白vh区域和vl区域的序列，这些区域以外的区域的氨基酸序列没有特别限制。因此，本发明的抗体可以为如人抗体那样的大鼠以外的哺乳动物抗体，也可以为人源化抗体。更具体而言，可以为由人以外的哺乳动物、例如大鼠抗体的重链、轻链的可变区域与人抗体的重链、轻链的恒定区域构成的嵌合抗体，这样的抗体可以通过将编码大鼠抗体的可变区域的dna与编码人抗体的恒定区域的dna连结、将其插入表达载体而导入宿主并产生来得到。人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体，为将人以外的哺乳动物、例如大鼠抗体的cdr移植于人抗体的
cdr得到的抗体，也已知有其通常的基因重组方法。作为具体例，从以在末端部具有重叠(overlap)的部分的方式制作的数个低聚核苷酸通过pcr法合成设计为将大鼠抗体的cdr和人抗体的框架区(framework region；fr)连结的dna序列。通过将所得到的dna与编码人抗体恒定区域的dna连结、接着插入表达载体中、将其导入宿主并产生来得到(参照欧州专利申请公开号ep239400、国际专利申请公开号wo96/02576)。经由cdr连结的人抗体的fr可以选择cdr形成良好的抗原结合部位的抗体。根据需要，可以以重构人抗体的cdr形成适当的抗原结合部位的方式取代抗体的可变区域的fr的氨基酸(sato，k.et al.，cancer res，1993，53，851
‑
856.)。
[0084]
另外，也已知有人抗体的获得方法。例如，能够将人淋巴细胞在体外(in vitro)用表达所期望的抗原或所期望的抗原的细胞敏化，使敏化淋巴细胞与人骨髓瘤细胞、例如u266融合，得到具有对抗原的结合活性的所期望的人抗体(参照日本特公平1
‑
59878)。另外，能够通过将具有人抗体基因的全部库(repertory)的转基因动物用所期望的抗原进行免疫而获得所期望的人抗体(参照wo93/12227、wo92/03918、wo94/02602、wo94/25585、wo96/34096、wo96/33735)。另外，还已知有使用人抗体文库并通过筛选获得人抗体的技术。例如，能够使人抗体的可变区域作为单链抗体(scfv)利用噬菌体展示法在噬菌体的表面表达，选择与抗原结合的噬菌体。如果对所选择的噬菌体的基因进行分析，则能够确定编码与抗原结合的人抗体的可变区域的dna序列。如果明确与抗原结合的scfv的dna序列，则能够对该序列制作适当的表达载体，获得人抗体。这些方法已经是公知的，能够参照wo92/01047、wo92/20791、wo93/06213、wo93/11236、wo93/19172、wo95/01438、wo95/15388。
[0085]
抗体的类别没有特别限定，也包含具有igg、igm、iga、igd或ige等任一个同型的抗体。如果考虑精制的容易性等，则优选为igg。
[0086]
作为功能性片段，可以列举抗体片段(碎片)等的低分子化抗体或抗体的修饰物。作为抗体片段的具体例，例如可以列举fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fv、scfv、diabody等。
[0087]
另外，本发明的抗体中，用于上述(a)或(b)的多肽的检测的抗体只要与这些多肽结合即可。另一方面，用于mpn的预防或治疗的抗体优选与上述(a)或(b)的多肽结合并具有细胞杀伤活性的抗体。
[0088]
作为与切断型的突变型calr蛋白质结合的抗体，只要是与具有序列号1所示的序列的多肽链结合的抗体即可，优选在与切断型的突变型calr蛋白质中的序列号1所示的氨基酸序列部分的结合中至少与上述抗体或其功能性片段的任一个竞争的抗体。
[0089]
这里，作为用于上述检测的生物体试样，例如可以列举从被验者采集的、且含有(a)或(b)的多肽的生物体试样。具体而言，可以列举全血、血浆、血清、淋巴细胞、淋巴液、血小板、单核细胞、粒细胞、唾液或尿等体液、通过骨髄生物检查而得到的组织标本(骨髄液、骨髄组织)等。
[0090]
作为(a)或(b)的多肽的检测手段，可以列举液相色谱法质量分析法、免疫学方法、使用有具有特异性结合能力的低/中分子、核酸或核酸衍生物的方法等，优选简便且测定灵敏度高的免疫学方法。
[0091]
作为免疫学方法，优选使用具有对于(a)或(b)的多肽链的抗原识别部位(表位)的抗体或其功能性片段的免疫学方法。作为(a)或(b)的多肽链中的表位，只要是存在于(a)或(b)的多肽链中的序列即可，优选具有(a)或(b)的多肽链中的连续的3个氨基酸以上的氨基
酸的肽，更优选具有(a)或(b)的多肽链中的连续的5个氨基酸以上的氨基酸的肽。
[0092]
用于免疫学方法的抗体例如只要是将具有(a)或(b)的多肽链中的连续的3个氨基酸以上的氨基酸的肽用作抗原而得到的抗体即可，可以为多克隆抗体，也可以为单克隆抗体，优选单克隆抗体。这里，单克隆抗体可以如下制造：例如使通过将具有(a)或(b)的多肽链中的连续的3个氨基酸以上的氨基酸的肽敏化而得到的抗体产生细胞与骨髄瘤细胞进行细胞融合而制作杂交瘤，选择产生靶标抗体的克隆，使该细胞进行增殖。
[0093]
作为免疫学方法，能够使用免疫层析法、酶标记免疫学测定法(eia)、放射免疫法(ria)、凝集法、比浊法、流式细胞仪法、组织免疫染色法、蛋白质印迹法等免疫印迹法等的任意种。这里免疫印迹法是将多肽转印到膜上，用抗体检测膜上的多肽的方法。抗体的检测可以使用酶标记、荧光标记等。
[0094]
如果在生物体试样中检测出(a)或(b)的多肽，则该生物体试样可以判定为源自骨髄增殖性肿瘤患者的生物体试样。
[0095]
本发明的mpn诊断药含有具有对于上述(a)或(b)的多肽链的抗原识别部(表位)的抗体。该抗体优选为上述的抗体。
[0096]
另外，在本发明的mpn诊断药中，除上述抗体之外，还可以包含缓冲液、测定实施操作说明书等。
[0097]
本发明的mpn预防或治疗药等医药组合物只要含有上述的抗体即可，能够与药学上可接受的载体一起通过混合、溶解、乳化、胶囊封入、冻结干燥等进行制剂化而制造。
[0098]
成为本发明的医药组合物的预防或治疗对象的mpn优选为检测出突变型calr的mpn。
[0099]
口服给药用的优选的制剂为使本发明抗体有效量溶解于如水、生理食盐水那样的稀释剂得到的液剂；以固体或颗粒含有有效量的胶囊剂、颗粒剂、散剂或片剂；在适当的分散介质中悬浊有效量的悬浊液剂；使溶解了有效量的溶液分散于适当的分散介质中并乳化得到的乳剂等。
[0100]
在用于非口服给药用时，可以将本发明抗体与药学上接受的溶剂、赋形剂、粘结剂、稳定剂、分散剂等一起制剂化为注射用溶液、悬浊液、乳剂、霜剂、软膏剂、吸入剂、栓剂等剂形。在注射用的配方中，可以将本发明的抗体溶解于水性溶液、优选hanks溶液、林格氏溶液、或生理盐水缓冲液等生理学适当的缓冲液中。另外，本发明的医药可以在油性或水性的介质中形成为悬浊液、溶液或乳浊液等形状。或者也可以以粉体的形态制造本发明抗体，在使用前使用灭菌水等制备水溶液或悬浊液。用于通过吸入的给药时，可以将本发明抗体粉末化，与乳糖或淀粉等适当的基剂一起制成粉末混合物。栓剂配方可以通过将本发明抗体与可可脂等惯用的栓剂基剂进行混合来制造。另外，本发明的治疗剂可以封入聚合物基质等，作为持续释放制剂进行配方。
[0101]
本发明的mpn治疗药的筛选法的特征在于，筛选识别上述(a)或(b)的多肽的抗体或蛋白质、低/中分子、核酸或核酸衍生物。具体而言，可以列举使用了识别(a)或(b)的多肽的抗体的具有抗体依赖性细胞杀伤活性或补体依赖性细胞杀伤活性的抗体医药的开发。上述本发明的抗体是通过本发明的筛选法得到的抗体医药的实例。除此之外，可以列举制造出与(a)或(b)的多肽特异性地结合的低分子或中分子化合物、核酸或核酸衍生物、蛋白质等，肿瘤细胞特异性地递送具有细胞杀伤效果的低分子或中分子化合物、核酸或核酸衍生
物、蛋白质等的抗肿瘤药的开发。
[0102]
实施例
[0103]
下面，列举实施例，对本发明进一步详细地说明，但本发明不受这些实施例任何限定。
[0104]
[试验例1]
[0105]
(1)材料和试验方法
[0106]
[1]抗calr抗体
[0107]
cell signaling technology公司制的兔单克隆抗体克隆d3e6(cat#12238)
[0108]
[2]抗突变型calr抗体
[0109]
dianova公司制的小鼠单克隆抗体克隆cal2(cat#dia
‑
cal)
[0110]
[3]识别比切断部位更靠氨基末端侧的突变型calr蛋白质的抗体
[0111]
合成在序列号1中所含的氨基酸序列(rrmmrtkmr)的羧基末端或氨基末端添加有半胱氨酸的肽，与载体蛋白质钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin；klh)结合之后，对8周龄的雌性的wky/izm大鼠进行免疫，在追加免疫后回收淋巴细胞。使淋巴细胞与小鼠骨髓瘤sp2细胞通过peg法进行细胞融合之后，在选择培养基中进行培养，取得杂交瘤。通过使用免疫了的肽或精制蛋白质的elisa法筛选培养上清液中的抗体的特异性，由此获得产生与包含切断型的突变型calr蛋白质结合的抗体的杂交瘤(克隆b3、c6和g1)。对从这些杂交瘤中产生的抗体进行精制，用于试验(b3抗体、c6抗体和g1抗体)。
[0112]
[4]试验方法
[0113]
将通过在人成巨核细胞白血病细胞株ut
‑
7/tpo中使del 52或ins5型的突变型calr蛋白质表达而肿瘤性增殖的ut
‑
7/tpo/calr del52、ut
‑
7/tpo/calrins 5细胞、以及作为对照的使野生型calr表达的ut
‑
7/tpo/calr(wt)、仅导入有基因导入中所使用的载体的ut
‑
7/tpo/vec细胞，以6.0
×
105个/ml的密度播种于optimem培养基(thermo fisher公司cat#31985070)，在5％co2存在下于37℃培养32小时。此时，ut
‑
7/tpo/calrwt和ut
‑
7/tpo/vec细胞在含有10ng/ml促血小板生成素(thrombopoietin；tpo)的培养基中进行培养。通过离心分离(15,000g
×
10分钟、4℃)除去细胞，从培养液获得培养上清液，将所得到的组分在还原剂存在下进行加热处理之后，利用sds聚丙烯酰胺电泳法在凝胶上展开，电转印到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜，与含有5％脱脂奶的tbs
‑
t溶液(0.1％tween
‑
20、150mm氯化钠、50mm tris
‑
hcl、ph7.5)在室温下反应1小时后，与含有识别野生型和突变型的两者的抗体(兔单克隆抗体d3e6，cell signaling公司cat#12238)、或识别突变型的羧基末端序列的市售的抗体(小鼠单克隆抗体cal2，dianova公司cat#dia
‑
cal
‑
250)的5％bsa/tbs
‑
t溶液在4℃下反应一夜。利用tbs
‑
t溶液进行清洗之后，在含有过氧化物酶标记的抗兔igg抗体(santa cruz公司cat#sc
‑
2030)或过氧化物酶标记的抗小鼠igg抗体(santa cruz公司cat#sc
‑
2005)的5％脱脂奶/tbs
‑
t溶液中，在室温下进行反应1小时。用tbs
‑
t溶液对pvdf膜进行清洗之后，使用fusion摄像装置(vilber
‑
lourmat公司制)检测与过氧化物酶发光试剂(thermo fisher scientific公司cat#34094)反应而得到的信号。
[0114]
使在氨基末端的信号序列的下游插入了组氨酸标记的del 52型的突变型calr蛋白质在hek293t细胞内表达，通过离心分离(15,000g
×
10分钟、4℃)制备含有所分泌的突变型calr蛋白质的培养上清液。将所得到的上清液应用于histrap柱(ge healthcare公司
cat#17531901)，用含有20mm咪唑的精制缓冲液(0.3m氯化钠、25mm tris
‑
hcl、ph7.4)对柱进行清洗后，使用含有50mm咪唑的精制缓冲液对突变型calr蛋白质进行精制。精制蛋白质通过与2
‑
硝基
‑5‑
氰硫基苯甲酸(2
‑
nitro
‑5‑
thiocyanobenzoicacid，ntcb)反应而将半胱氨酸残基氰化之后，在碱性条件下片段化，之后，使用基质辅助激激光解吸离子化飞行时间型质量分析仪鉴定蛋白质片段的质量，由del 52型的突变型calr蛋白质的肽序列信息确定切断部位。
[0115]
使在氨基末端的信号序列的下游用flag tag标记、或用flag tag标记了羧基末端的del 52型或ins 5型的突变型calr蛋白质在ut
‑
7/tpo细胞中表达，使用含有胎牛灭活血清10％的iscove
′
s modified dulbecco
′
s(imdm)培养基，在5％co2存在下于37℃进行培养。对增殖期的细胞1
×
105个用含有pbs(137mm氯化钠、27mm氯化钾的磷酸缓冲液)清洗后，在2％fbs/pbs溶液中，与识别小鼠抗dykddddk tag抗体(富士胶片和光纯药公司cat#014
‑
22383)、或比切断部位更靠氨基末端侧的大鼠抗突变型calr抗体在冰上反应30分钟。反应后，使用2％fbs/pbs溶液清洗细胞之后，作为2次抗体，分别使抗小鼠igg
‑
alexa fluor 647(thermo fisher scientific公司cat#a21235)和抗大鼠igg
‑
alexa fluor 647(thermo fisher scientific公司cat#a21247)在2％fbs/pbs溶液中在冰上反应30分钟。对反应结束后通过离心回收的细胞，使含有2％对甲醛的pbs溶液在冰上反应15分钟。最后，加入2％fbs/pbs溶液之后，进行离心分离(400g
×
5分钟、4℃)，废弃上清液，由此对细胞进行清洗，加入2％fbs/pbs溶液300μl，使用facs calibur(bd biosciences公司制)通过流式细胞术分析对信号进行定量。
[0116]
关于人末梢血单核细胞，使对在含有抗凝固剂的锥形管中采集的末梢血进行离心分离(500g
×
10分钟、4℃)而得到的细胞组分悬浊于pbs溶液之后，置于淋巴细胞分离液lymphosep(mp biomedicals公司cat#11444815)上，通过离心分离(1500rpm
×
30分钟、室温)获得血沉棕黄层。在所得到的血沉棕黄层中加入pbs溶液，再悬浊之后，进行离心分离(1500rpm
×
10分钟、室温)，通过除去上清液，取得末梢血单核细胞。使所得到的细胞悬浊于ripa溶液(150mm氯化钠、1mm edta、1％np
‑
40、1％脱氧胆酸钠、2mm正钒(v)酸钠、10mmβ
‑
甘油磷酸、1μg/ml抑肽酶、2μg/ml e
‑
64、1μg/ml亮抑肽酶、0.67μg/ml乌苯美司、0.67μg/ml抑肽素、43.5μg/ml pmsf、20mm tris
‑
hcl、ph7.4)之后，进行超声波破碎后，进行离心分离(15000g
×
15分钟、4℃)，回收上清液，制备细胞提取液。将所得到的细胞提取液在还原剂存在下加热处理之后，利用sds聚丙烯酰胺电泳法在凝胶上展开，电转印到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜，与含有5％脱脂奶的tbs
‑
t溶液在室温下反应1小时后，与含有识别比切断部位更靠氨基末端侧的大鼠抗突变型calr抗体的5％bsa/tbs
‑
t溶液在4℃下反应一夜。利用tbs
‑
t溶液进行清洗之后，在含有过氧化物酶标记的抗大鼠igg抗体(santa cruz公司cat#sc
‑
2006)的5％脱脂奶/tbs
‑
t溶液中在室温下进行反应1小时。用tbs
‑
t溶液对pvdf膜进行清洗之后，使用fusion摄像装置检测与过氧化物酶发光试剂反应而得到的信号。
[0117]
关于血小板，对在含有edta的锥形管中采集的末梢血进行离心分离(500g
×
10分钟、4℃)得到上清液，将对上清液进行离心分离(2000
×
g、15分钟、4℃)而得到的沉淀物用血小板清洗溶液(10mm柠檬酸钠、150mm氯化钠、1mm edta、1％右旋糖、ph7.4)500μl冲洗2次来制备。将所得到的血小板悬浊于ripa溶液之后，进行超声波破碎，其后，进行离心分离(15000g
×
15分钟、4℃)而回收上清液，制备细胞提取液。将所得到的细胞提取液在还原剂
存在下加热处理之后，利用sds聚丙烯酰胺电泳法在凝胶上展开，电转印到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜，与含有5％脱脂奶的tbs
‑
t溶液在室温下反应1小时后，与含有识别比切断部位更靠氨基末端侧的大鼠抗突变型calr抗体(b3抗体)的5％bsa/tbs
‑
t溶液在4℃下反应一夜。利用tbs
‑
t溶液进行清洗之后，与含有过氧化物酶标记的抗大鼠igg抗体(santa cruz公司cat#sc
‑
2006)的5％脱脂奶/tbs
‑
t溶液在室温下进行反应1小时。用tbs
‑
t溶液对pvdf膜进行清洗之后，使用fusion摄像装置检测与过氧化物酶发光试剂反应而得到的信号。
[0118]
(2)结果
[0119]
对于在人成巨核细胞白血病细胞株ut
‑
7/tpo中使del 52或ins 5型的突变型calr蛋白质表达而肿瘤性增殖的ut
‑
7/tpo/calr del52、ut
‑
7/tpo/calrins 5细胞、以及作为对照的使野生型calr表达的ut
‑
7/tpo/calr(wt)、仅导入有基因导入中所使用的载体的ut
‑
7/tpo/vec的培养上清液中所含的calr蛋白质，用识别野生型和突变型这两者的抗体(单克隆抗体d3e6，cell signaling公司cat#12238)和识别突变型的羧基末端序列的市售的抗体(单克隆抗体cal2，dianova公司cat#dia
‑
cal
‑
250)进行评价(图2)。其结果，如图2所示，在使用有识别野生型和突变型calr蛋白质的抗体(b3抗体)的免疫印迹中，表达突变型calr蛋白质的细胞除内源性的calr之外，还检测出了用突变型抗体无法识别的带(图3)。
[0120]
使用ntcb而在半胱氨酸残基的氨基末端侧片段化的肽片段中，作为仅在突变型calr蛋白质(使用del 52型)的切断型中发现的肽片段的分子量，得到25827.7和25418.4。通过将该数值和由切断得到的半胱氨酸残基的位置求出的推定分子量进行比较，作为del 52型的突变型calr蛋白质的切断部位，鉴定为第380号的蛋氨酸残基和第381号的精氨酸残基之间、以及第377号的蛋氨酸残基和第378号的精氨酸残基之间。
[0121]
使在氨基末端的信号序列的下游用flag tag标记、或用flag tag标记了羧基末端的del 52型或ins 5型的突变型calr蛋白质在ut
‑
7/tpo细胞中表达，关于细胞表面的突变型calr蛋白质的表达，使用抗flag抗体进行流式细胞术分析时，表达具有氨基末端的flag tag的突变型calr蛋白质的细胞与表达flag tag标记了羧基末端的突变型calr蛋白质的细胞相比，可得到更强的信号(图4、5)。接着，使用将在比切断部位更靠氨基末端侧含有突变型calr蛋白质特异性的序列的肽进行免疫而得到的抗体，进行图4、5的分析中所使用的细胞株的流式细胞术分析时，由于flag tag的添加位置引起的检测量的不同消失(图6、7)。由此显示：在突变型calr蛋白质特异性的序列中被切断而残存的羧基末端侧设定抗原识别部位对于更高灵敏度的检查试剂、或更强力的治疗药的创造是重要的。
[0122]
实际上，使用比切断部位更靠氨基末端侧的突变型calr特异的抗体，使用免疫印迹法对由calr基因突变阳性的患者得到的末梢血单核细胞或血小板的细胞提取液进行分析，结果，与细胞株的情况同样地，确认到被切断的突变型calr蛋白质的表达(图8)。由此显示：实际上即使在患者细胞中也发生同样的切断，在被切断而残存的羧基末端侧设定抗原识别部位对于更高灵敏度的检查试剂、或更强力的治疗药的创造是重要的。
[0123]
[试验例2]
[0124]
(1)3种抗体识别全长型和切断型的突变型calr蛋白质的确认
[0125]
将表达在氨基末端的信号序列的下游插入有flag tag的del 52型或ins 5型的突变型calr蛋白质的ut
‑
7/tpo细胞进行培养，通过离心分离(1,600g
×
5分钟、4℃)制备含有所分泌的突变型calr蛋白质的培养上清液。将所得到的培养上清液在sds和还原剂存在下
加热处理之后，利用sds聚丙烯酰胺电泳法在凝胶上展开，电转印到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜，与含有5％脱脂奶的tbs
‑
t溶液在室温下反应1小时后，与含有大鼠克隆b3、c6、g1抗体、或小鼠抗dykddddk tag抗体(富士胶片和光纯药公司cat#014
‑
22383)的5％bsa/tbs
‑
t溶液在4℃下反应一夜。利用tbs
‑
t溶液进行清洗之后，分别与含有过氧化物酶标记的山羊抗大鼠igg抗体(jackson immunoresearch inc.公司cat#112
‑
035
‑
003)、或过氧化物酶标记的山羊抗小鼠igg抗体(jackson immuno researchinc.公司cat#115
‑
035
‑
003)的5％脱脂奶/tbs
‑
t溶液在室温下进行反应1小时。用tbs
‑
t溶液清洗pvdf膜之后，使用fusion摄像装置检测与过氧化物酶发光试剂反应而得到的信号。
[0126]
其结果，如图9所示，确认了克隆b3、c6、g1抗体均识别全长型和切断型的突变型calr蛋白质。
[0127]
(2)3种抗体识别细胞表面的突变型calr蛋白质的确认
[0128]
将在氨基末端的信号序列的下游用flag tag标记的del 52型或ins 5型的突变型calr蛋白质在ut
‑
7/tpo细胞中表达，使用含有胎牛灭活血清10％的imdm培养基，在5％co2存在下于37℃进行培养。对增殖期的1
×
105个细胞用pbs清洗之后，在2％fbs/pbs溶液中与小鼠抗dykddddk tag抗体(富士胶片和光纯药公司cat#014
‑
22383)、或大鼠克隆b3、c6、g1抗体在冰上反应30分钟。反应后，使用2％fbs/pbs溶液清洗细胞之后，作为2次抗体，分别使抗小鼠igg
‑
alexa fluor647(thermo fisher scientific公司cat#a21235)和抗大鼠igg
‑
alexa fluor647(thermo fisher scientific公司cat#a21247)在2％fbs/pbs溶液中在冰上反应30分钟。在反应结束后通过离心回收的细胞，使含有4％对甲醛的pbs溶液在冰上反应15分钟。最后，加入2％fbs/pbs溶液后，进行离心分离(400g
×
5分钟、4℃)，废弃上清液，由此对细胞进行清洗，加入2％fbs/pbs溶液300μl，使用facs calibur(bdb iosciences公司制)，通过流式细胞术分析对信号进行定量。
[0129]
其结果，如图10所示，确认了克隆b3、c6、g1抗体均识别细胞表面的突变型calr蛋白质。
[0130]
[试验例3]
[0131]
(抗体的抗原结合力的评价)
[0132]
(1)利用elisa评价抗原结合力
[0133]
在每1孔吸附精制的100ng的del 52型的突变型calr蛋白质、或对照的bsa，使得到的elisa板(住友贝克莱特cat#ms
‑
8896f)用含有5mg/ml bsa的pbs在室温下反应1小时。用pbs对孔进行清洗之后，使含有0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800ng/ml的克隆b3、c6、g1抗体、或大鼠igg(santa cruz公司cat#2026)和5mg/ml bsa的pbs在室温下反应1小时。用pbs对孔进行清洗之后，使含有16ng/ml过氧化物酶标记的山羊抗大鼠igg抗体(jackson immuno research inc.公司cat#112
‑
035
‑
003)和5mg/ml bsa的pbs在室温下反应1小时。用tbs
‑
t溶液对孔进行清洗之后，添加tmb溶液(nacalai tesque cat#05298
‑
80)，在室温下反应15分钟后，添加1m硫酸水溶液，测定450nm和620nm的吸光度，求出吸光度的差之后，算出将由对照的bsa得到的值减去的值。
[0134]
其结果，如图11所示，得知：本发明的抗体(b3、c6、g1)均与突变型calr蛋白质由低浓度结合。
[0135]
(2)利用表面等离激元共振分析评价抗原结合力
[0136]
在表面等离激元共振分析装置biacore t200(ge healthcare公司)中装填表面等离激元共振分析用的传感器芯片(ge healthcare公司cat#br100530)后，用hbs
‑
ep缓冲液(ge healthcare公司cat#br100669)进行了平衡化。使用amine coupling kit(ge healthcare公司cat#br100050)，将用acetate 5.5(ge healthcare公司cat#br100352)以10μg/ml的浓度制备的克隆b3抗体以固定化量成为200ru的方式进行固定化。接着，使用利用hbs
‑
ep缓冲液以20、10、5、2.5、1.25nm的浓度制备的、在序列号1中所含的氨基酸序列(rrmmrtkmr)的氨基末端添加了半胱氨酸的肽，测定表面等离激元共振，利用biacore t200 evaluation software获得解离常数。
[0137]
其结果，如图12所示，可知本发明的抗体与突变型calr蛋白质强力地结合。
[0138]
[试验例4]
[0139]
(抗体的抗原识别部位的鉴定)
[0140]
确认了克隆b3、c6、g1抗体识别calr突变蛋白质上抗原所使用的氨基酸序列。使用免疫印迹法(图13a)和elisa法(图13b)评价各个抗体对于将抗原所使用的氨基酸和其周边的氨基酸每一个取代为丙氨酸的突变型calr蛋白质的反应性。
[0141]
(1)免疫印迹法
[0142]
使del 52型的突变型calr蛋白质的第367号的苏氨酸(t)至第378号的精氨酸(r)的区域的氨基酸1个1个地取代为丙氨酸(a)的蛋白质、或未进行取代的蛋白质在hek293t细胞内表达，通过离心分离(1,600g
×
5分钟、4℃)制备含有所分泌的突变型calr蛋白质的培养上清液。将所得到的蛋白质溶液在sds和还原剂存在下加热处理之后，利用sds聚丙烯酰胺电泳法在凝胶上展开，电转印到pvdf膜上，与含有5％脱脂奶的tbs
‑
t溶液在室温下反应1小时后，与含有过氧化物酶标记的克隆b3、c6、g1抗体、或小鼠抗calr抗体(abcam公司cat#ab22683)的5％bsa/tbs
‑
t溶液在4℃下反应一夜。与小鼠抗calr抗体反应后的pvdf膜利用tbs
‑
t溶液进行清洗后，在含有过氧化物酶标记的抗小鼠igg抗体(jackson immuno research inc.公司cat#115
‑
035
‑
003)的5％脱脂奶/tbs
‑
t溶液中，在室温下进行反应1小时。接着，对全部的pvdf膜用tbs
‑
t溶液清洗之后，使用fusion摄像装置(vilber
‑
lourmat公司制)检测与过氧化物酶发光试剂(thermo fisher scientific公司cat#34094)反应而得到的信号。
[0143]
其结果，如图13a所示，可知本发明的抗体识别序列号1的第1号的精氨酸至第9号的精氨酸之间。
[0144]
(2)elisa法
[0145]
使吸附有用上述的方法制备的突变型calr蛋白质的elisa板用含有5mg/ml bsa的pbs在室温下反应1小时。用pbs对孔进行清洗之后，使含有200ng/ml的克隆b3、c6、g1抗体、或小鼠抗calr抗体(santa cruz公司cat#sc
‑
373863)和5mg/ml bsa的pbs在室温下反应1小时。用pbs对孔进行清洗之后，使含有16ng/ml的过氧化物酶标记的山羊抗大鼠igg抗体(jackson immuno research inc.公司cat#112
‑
035
‑
003)或山羊抗小鼠igg抗体(santa cruz公司cat#sc
‑
2005)和5mg/ml bsa的pbs在室温下反应1小时。用tbs
‑
t溶液对孔进行清洗之后，添加tmb溶液，在室温下反应15分钟后，添加1m硫酸水溶液，测定450nm和620nm的吸光度，求出吸光度的差。
[0146]
其结果，如图13b所示，可知本发明的抗体识别序列号1的第1号的精氨酸至第9号
的精氨酸之间。
[0147]
[试验例5]
[0148]
(本发明抗体的序列信息的确定)
[0149]
关于本发明的抗体(b3、c6、g1)的重链和轻链的序列信息，由产生抗体的细胞，使用purelinc rna mini试剂盒(thermofisher公司cat#12183025)制备mrna。以所得到的mrna为模板，使用重链或轻链特异性的逆转录引物，利用rapid amplification of cdna ends法合成cdna之后，在质粒中进行克隆。通过对所得到的质粒进行桑格测序分析，确定重链和轻链的cdna的全长序列。
[0150]
将其结果示于图14～图17和序列号5～34。
[0151]
图14表示本发明抗体(b3、c6、g1)的重链可变区域的氨基酸序列。图15表示本发明抗体(b3、c6、g1)的轻链可变区域的氨基酸序列。图16表示本发明抗体(b3、c6、g1)的重链可变区域的碱基序列。图17表示本发明抗体(b3、c6、g1)的轻链可变区域的碱基序列。
[0152]
序列号5表示b3抗体的重链可变区域的氨基酸序列。序列号6表示c6抗体的重链可变区域的氨基酸序列。序列号7表示g1抗体的重链可变区域的氨基酸序列。序列号8表示b3抗体的轻链可变区域的氨基酸序列。序列号9表示c6抗体的轻链可变区域的氨基酸序列。序列号10表示g1抗体的轻链可变区域的氨基酸序列。
[0153]
序列号11表示b3抗体的重链可变区域的碱基序列。序列号12表示c6抗体的重链可变区域的碱基序列。序列号13表示g1抗体的重链可变区域的碱基序列。序列号14表示b3抗体的轻链可变区域的碱基序列。序列号15表示c6抗体的轻链可变区域的碱基序列。序列号16表示g1抗体的轻链可变区域的碱基序列。
[0154]
序列号17表示b3抗体的vh的cdr1的氨基酸序列。序列号18表示b3抗体的vh的cdr2的氨基酸序列。序列号19表示b3抗体的vh的cdr3的氨基酸序列。序列号20表示c6抗体的vh的cdr1的氨基酸序列。序列号21表示c6抗体的vh的cdr2的氨基酸序列。序列号22表示c6抗体的vh的cdr3的氨基酸序列。序列号23表示g1抗体的vh的cdr1的氨基酸序列。序列号24表示g1抗体的vh的cdr2的氨基酸序列。序列号25表示g1抗体的vh的cdr3的氨基酸序列。序列号26表示b3抗体的vl的cdr1的氨基酸序列。序列号27表示b3抗体的vl的cdr2的氨基酸序列。序列号28表示b3抗体的vl的cdr3的氨基酸序列。序列号29表示c6抗体的vl的cdr1的氨基酸序列。序列号30表示c6抗体的vl的cdr2的氨基酸序列。序列号31表示c6抗体的vl的cdr3的氨基酸序列。序列号32表示g1抗体的vl的cdr1的氨基酸序列。序列号33表示g1抗体的vl的cdr2的氨基酸序列。序列号34表示g1抗体的vl的cdr3的氨基酸序列。
[0155]
[试验例6]
[0156]
(治疗效果的评价)
[0157]
制作将克隆b3抗体的重链和轻链的可变区域与对应的小鼠igg2a的重链和轻链的恒定区域融合的嵌合体b3抗体，对移植表达del 52型的calr突变基因的造血干细胞进行而制造出的骨髄增殖性肿瘤模型小鼠进行给药，评价嵌合体抗体产生的治疗效果。
[0158]
将编码克隆b3抗体的重链可变区域和小鼠igg2a的恒定区域的基因序列、或编码克隆b3抗体的轻链可变区域和马免疫球蛋白κ的恒定区域的基因序列连结并插入b3小鼠嵌合体重链和轻链基因得到表达载体，将表达载体导入expicho
‑
s细胞(thermofisher公司cat#a29127)，使用expicho expression培养基(thermofisher公司cat#a2910001)，在5％
co2存在下于37℃培养10天。通过离心分离(4,000g
×
30分钟、4℃)回收培养上清液后，使嵌合体抗体吸附于hitrap proteing hp柱(ge healthcare公司cat#29048581)之后，使用0.1mglycine
‑
hcl(ph2.7)进行洗脱，将利用1m tris
‑
hcl(ph9.0)进行了中和的洗脱组分在pbs中透析，制备b3小鼠嵌合体抗体。
[0159]
在b3小鼠嵌合体抗体产生的治疗效果的评价中，使用骨髄移植模型小鼠。从8至10周龄的b6.cd45.1同族小鼠(三协labo)的大腿骨精制骨髄细胞，分取用apc标记抗c
‑
kit抗体标记的c
‑
kit阳性细胞后，分取ter119、cd4、cd8、gr
‑
1、cd45r、cd3e、cd11b阴性且cd117和sca1阳性的lsk细胞，用包含表达del 52型的突变型calr基因的pmscv
‑
ires
‑
gfp载体、或对照的载体的逆转录病毒感染。在感染72小时后，对照射了6格雷
×
2次的放射线的8至10周龄的c57bl/6j小鼠(东方酵母)每1只移植4000个lsk细胞，利用多项目自动血球计数装置(sysmex公司cat#poch
‑
100ivdiff)经时地测定末梢血中的血小板数，在移植第2个月，确认到由于突变型calr基因的表达而引起的作为骨髄增殖性肿瘤的表现型的血小板增多后，从移植后第9周每周给药上述的b3小鼠嵌合体抗体每1只250μg、或溶剂(pbs)，评价b3小鼠嵌合体抗体特异性的血小板增多的抑制效果。
[0160]
其结果，如图18所示，本发明抗体对于mpn显示优异的治疗效果。