藤仓镰刀菌、含有该菌的菌剂和除草剂及它们的应用的制作方法

1.本发明涉及杂草生物防治领域，具体地，涉及一株藤仓镰刀菌、含有该菌的菌剂和除草剂及它们的应用。


背景技术：

2.我国农田杂草种类复杂，已报道的1400余种杂草中，约60余种杂草能够侵入农田，对我国农业生产造成严重的影响。多数杂草根基发达，具有较强的环境适应能力，产籽力强，能够快速传播，这些都为杂草的有效防控增加了难度。每年我国因杂草危害造成大量的粮食、蔬菜、果树等损失，杂草危害已经是威胁我国农田产量安全的重要因素之一。
3.杂草的防治是农业生产的一个重要环节，虽然随着近代农业机械化和化学农药的推广应用，杂草危害已经得到了一定控制。化学防治是目前防治农田杂草的主要手段，然而随着化学除草剂的长期使用，也带来了诸如环境污染、农产品农药残留、杂草抗药性上升等负面影响。相对于化学除草剂，微生物除草剂具有环境友好、对作物安全性高、杂草不容易产生抗性等特点。因此，研究和开发微生物除草剂具有广阔的前景。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供了一株藤仓镰刀菌、含有该菌的菌剂和除草剂及它们的应用，能够高效防治田间的禾本科杂草和阔叶杂草，为新型生物除草剂的开发提供依据。
5.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种藤仓镰刀菌，所述藤仓镰刀菌(fusarium fujikuroi)的保藏编号为cgmcc no.21038。
6.本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的藤仓镰刀菌。
7.优选地，所述菌剂含有所述藤仓镰刀菌的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种，优选为活菌体和/或发酵产物。
8.优选地，所述菌剂为液态菌剂和/或固态菌剂，优选为液态菌剂。
9.本发明第三方面提供一种除草剂，所述除草剂包括上述的藤仓镰刀菌和/或上述的菌剂。
10.优选地，所述除草剂中所述藤仓镰刀菌的分生孢子数不少于106cfu/ml。
11.优选地，所述除草剂的制备方法包括：将所述藤仓镰刀菌经发酵培养得到发酵液，将所述发酵液除去菌丝体得到分生孢子液。
12.优选地，所述发酵培养的条件至少满足：接种量为1
×
102‑3×
102cfu/ml、温度为20
‑
35℃、转速为120
‑
200r/min、时间为8
‑
12天。
13.本发明第四方面提供上述的藤仓镰刀菌、上述的菌剂、上述的除草剂在防治杂草中的应用。
14.优选地，所述杂草为禾本科杂草和/或阔叶杂草，优选为牛筋草、看麦娘、棒头草、钻形紫菀和空心莲子草中的至少一种。
15.通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
16.本发明提供的藤仓镰刀菌分离自田间杂草马唐自然发病的叶片，来源于自然环境，因此，将其释放到自然界中不会造成任何生态或环境方面的隐患，是安全的生物防治介体；本发明提供的藤仓镰刀菌，能够浸染牛筋草、看麦娘、棒头草、钻形紫菀和空心莲子草等多种禾本科杂草和阔叶杂草，且致病力较强，能够起到有效防治禾本科杂草和阔叶杂草的目的，该藤仓镰刀菌的成分简单，环境友好，施用简单，杀草谱较广，具有进一步开发成生物除草剂的潜力。
17.本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
18.生物保藏
19.本发明提供的菌株为藤仓镰刀菌(fusarium fujikuroi)，并于2020年12月23日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.21038。
附图说明
20.图1是实施例1中分离得到的藤仓镰刀菌(ma4菌株)对马唐的致病性测定；
21.图2是藤仓镰刀菌(ma4菌株)在pda平板上的菌落形态；
22.图3是藤仓镰刀菌(ma4菌株)的分生孢子形态；
23.图4是藤仓镰刀菌(ma4菌株)的分生孢子液对马唐种子的萌发的影响试验图。
具体实施方式
24.以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
25.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
26.第一方面，本发明提供了一株藤仓镰刀菌，其中，所述藤仓镰刀菌(fusarium fujikuroi)的保藏编号为cgmcc no.21038。
27.本发明提供的藤仓镰刀菌从自然发病的马唐叶片组织分离得到。所述藤仓镰刀菌的分离可以采用本领域常规的用于新菌株分离的方法，例如可以采用组织分离法。
28.组织分离法具体可以包括：用无菌水将田间自然发病的马唐叶片漂洗两次，沿病健交界处剪成小块，将组织小块置于乙醇
‑
水溶液和次氯酸钠溶液中分别进行表面消毒，表面消毒后的马唐叶片组织用无菌蒸馏水漂洗多次，以彻底清除组织表面残留的消毒剂；再将马唐叶片组织块置于灭菌的培养皿内，于超净工作台内吹干，将吹干后的马唐叶片组织置于灭菌的pda平板上，进行恒温培养，待真菌长出菌落后用灭菌的接种针挑取菌丝至新的pda平板内，产孢后挑取单孢子进行纯化得到纯培养菌株；将纯培养菌株的分生孢子悬浮液回接至马唐幼苗，接种后经2
‑
5d出现明显的病斑，切取发病组织重新进行分离培养，所得分离物与原接种病原物一致，完成柯赫氏法则验证，证明分离物是马唐致病菌，得到分离菌
株。
29.本发明中，乙醇
‑
水溶液中的乙醇体积分数可以为60
‑
80％，次氯酸钠溶液中的次氯酸钠质量分数可以为0.5
‑
2％；pda平板的培养基组分可以为：马铃薯180
‑
220g、葡萄糖15
‑
25g、琼脂粉12
‑
18g、蒸馏水1000ml，自然ph，121℃高压蒸汽灭菌30min，备用；恒温培养的温度为25
‑
35℃。
30.本发明的发明人将得到的分离菌株进行了形态学鉴定和分子生物学鉴定，结果显示，该菌株为藤仓镰刀菌(fusarium fujikuroi)，并于2020年12月23日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21038。
31.本发明提供的藤仓镰刀菌经过发酵培养能够产生大量的藤仓镰刀菌的活菌体和/或发酵产物。本发明对发酵培养方法没有特别的限制，只要通过该发酵培养方法可以使所述藤仓镰刀菌大量增殖即可。例如，可以将藤仓镰刀菌转入平板培养基上进行活化，随后挑取菌落转入液体培养基中使得接种量为1
×
102‑3×
102cfu/ml，在温度为20
‑
35℃、转速为120
‑
200r/min的条件下，进行振荡培养8
‑
12天后得到发酵液。其中，所述培养基可以为本领域常规使用的培养基，例如，平板培养基可以为pda培养基，液体培养基可以为pdb培养基。
32.第二方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有上述的藤仓镰刀菌。在本发明中，对所述菌剂中藤仓镰刀菌的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择。
33.根据本发明，所述菌剂优选含有所述藤仓镰刀菌的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种，更优选为活菌体和/或发酵产物。本发明所提供的藤仓镰刀菌的菌体包括分生孢子和菌丝体，所述菌剂可以含有所述藤仓镰刀菌的分生孢子和/或菌丝体，优选为含有所述藤仓镰刀菌的分生孢子。在本发明中，术语“发酵产物”指的是藤仓镰刀菌在发酵或培养过程中产生的代谢产物(包括胞内代谢产物和/或胞外代谢产物)。
34.根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的辅料(赋形剂)等成分，例如所述菌剂可以为液态菌剂(例如可以为分生孢子液或其稀释液)和/或固态菌剂，优选为液态菌剂。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种辅料为本领域技术人员所熟知，在此不再详细说明。
35.第三方面，本发明提供了一种除草剂，其中，所述除草剂包括上述的藤仓镰刀菌和/或上述的菌剂。
36.根据本发明，除草剂中含有所述藤仓镰刀菌的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种，所述除草剂中还可以包括其他除草有效成分，所述其他除草有效成分包括化学物质和/或生物活体。优选情况下，所述除草剂中所述藤仓镰刀菌的分生孢子数不少于106cfu/ml。进一步优选地，所述除草剂中所述藤仓镰刀菌的分生孢子数为106‑
108cfu/ml。
37.根据本发明，所述除草剂的制备方法包括：将所述藤仓镰刀菌经发酵培养得到发酵液，将所述发酵液除去菌丝体得到含有所述藤仓镰刀菌的分生孢子的分生孢子液。示例性地，所述发酵液采用纱布过滤的方式吸附除去菌丝体；如发酵液除去菌丝体后分生孢子数的浓度过高，则可以利用无菌水稀释成分生孢子数不少于106cfu/ml的分生孢子液。
38.本发明的发明人在研究过程中发现，虽然本发明提供的藤仓镰刀菌是从自然发病的马唐叶片上分离得到的，但其对田间常见的禾本科杂草和其他阔叶杂草(如牛筋草、看麦娘、棒头草、钻形紫菀和空心莲子草等)均具有一定的防治作用。
39.第四方面，本发明还提供了上述的藤仓镰刀菌、上述的菌剂、上述的除草剂在防治杂草中的应用，优选为在防治禾本科杂草和/或阔叶杂草中的应用。示例性地，所述禾本科杂草可以为牛筋草、看麦娘和棒头草中的至少一种，阔叶杂草可以为钻形紫菀和/或空心莲子草。
40.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
41.以下实施例中，pda培养基的组分为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15g、1000ml蒸馏水、自然ph，121℃高压蒸汽灭菌30min，备用；
42.pdb培养基的组分为：马铃薯200g、葡萄糖20g、1000ml蒸馏水、自然ph，121℃高压蒸汽灭菌30min，备用；
43.以下实施例中，藤仓镰刀菌对杂草的侵染率和鲜重防效通过下列计算公式得出：
44.发芽抑制率＝(ck发芽率
‑
处理发芽率)/ck发芽率
×
100％，
45.根长抑制率＝(ck平均根长
‑
处理平均根长)/ck平均根长
×
100％，
46.芽长抑制率＝(ck平均芽长
‑
处理平均芽长)/ck平均茎长
×
100％，
47.侵染率(％)＝发病叶片数/处理总叶片数
×
100％，
48.鲜重防效(％)＝(对照平均鲜重
‑
处理平均鲜重)/对照平均鲜重
×
100％；
49.健康的马唐、牛筋草、看麦娘、棒头草等禾本科杂草以及钻形紫菀和空心莲子草等阔叶杂草来自湖南农业大学耘园基地，马唐种子采集自湖南农业大学耘园基地未施药空地，其他原料和试剂均为市售品。
50.实施例1
51.(1)用无菌水将田间自然发病的马唐叶片(采集自湖南农业大学耘园基地自然发病的马唐)漂洗两次，沿病健交界处剪成小块，将组织小块先置于体积分数为70％的乙醇溶液中表面消毒30s、再置于质量分数为1％的次氯酸钠溶液中表面消毒60s；将表面消毒后的马唐叶片组织用无菌蒸馏水漂洗3
‑
4次以彻底清除组织表面残留的消毒剂，随后将马唐叶片组织块置于灭菌的培养皿内，于超净工作台内吹干；
52.(2)将步骤(1)中吹干后的马唐叶片组织置于灭菌的pda平板上，置于28℃恒温培养箱内培养，待真菌长出菌落后用灭菌的接种针挑取菌丝至新的pda平板内，产孢后挑取单孢子进行纯化得到纯培养菌株；
53.(3)将步骤(2)得到的纯培养菌株的分生孢子悬浮液回接至马唐幼苗，接种后3d出现明显的病斑，如图1所示，切取发病组织重新进行分离培养，所得分离物与原接种病原物一致，完成了柯赫氏法则验证，证明分离物是马唐致病菌，将其命名为ma4。
54.马唐致病菌ma4的形态学鉴定和分子生物学鉴定
55.形态学鉴定：将纯化好的ma4菌株接种至pda平板，观察菌株在pda平板上的菌落形态，如图2所示，ma4菌株在pda平板上的菌落形态为白色，菌丝致密，待产孢后在电子显微镜下观察ma4菌株的分生孢子形态，如图3所示，ma4菌株的分生孢子呈椭圆形，有隔，单生。
56.分子生物学鉴定：采用真菌基因组dna提取试剂盒提取ma4菌株的dna，利用通用引物its4/its5、ef728f/ef986r和bt2a/bt2b分别扩增ma4菌株的its(internal transcribed spacer regions)、tef(translation elongation factor 1
‑
alpha genes)、tub(β
‑
tubulin)基因序列并测序，其中，its基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，tef基因核苷酸序列如seq id no:2所示，tub基因核苷酸序列如seq id no:3所示；将its、tef和tub基因
序列提交到ncbi，genbank号分别为mk443269，mk4432671和mk443268。将its、tef和tub基因序列在ncbi中进行blast，发现ma4菌株的its、tef和tub基因均与藤仓镰刀菌(fusarium fujikuroi)高度同源。
57.根据形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，得出ma4菌株为藤仓镰刀菌(fusarium fujikuroi)，并于2020年12月23日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21038。
58.实施例2
59.将实施例1得到的ma4菌株转入新鲜的pda平板上进行活化，然后挑取菌落转入液体pdb培养基中使得接种量为2
×
102cfu/ml，在温度为28℃、转速为160r/min的条件下发酵培养10天得到发酵液，将发酵液用四层纱布过滤去除菌丝体后，用无菌水稀释成分生孢子数为108cfu/ml的分生孢子液作为除草剂。
60.实施例3
61.将实施例1得到的ma4菌株转入新鲜的pda平板上进行活化，然后挑取菌落转入液体pdb培养基中使得接种量为1
×
102cfu/ml，在温度为20℃、转速为120r/min的条件下发酵培养12天得到发酵液，将发酵液用四层纱布过滤去除菌丝体后，用无菌水稀释成分生孢子数为106cfu/ml的分生孢子液作为除草剂。
62.实施例4
63.将实施例1得到的ma4菌株转入新鲜的pda平板上进行活化，然后挑取菌落转入液体pdb培养基中使得接种量为3
×
102cfu/ml，在温度为35℃、转速为200r/min的条件下发酵培养8天得到发酵液，将发酵液用四层纱布过滤去除菌丝体后，用无菌水稀释成分生孢子数为107cfu/ml的分生孢子液作为除草剂。
64.测试例1
65.将实施例2得到的分生孢子液，进行2倍等倍梯度稀释，分别得到1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍的分生孢子液等梯度浓度，将马唐种子浸种后置于7个含两层滤纸的培养皿中，每个培养皿中含有100颗马唐种子，以设置为与上述6个浓度的分生孢子液对应的处理组和一个空白对照组(ck)，处理组的培养皿中分别加入10ml对应浓度的分生孢子液进行处理，空白对照组的培养皿中加入10ml无菌水，7d后分别调查每个处理组和空白对照组的发芽率、根长、芽长，计算发芽抑制率、根长抑制率、芽长抑制率，结果见表1。
66.表1不同浓度ma4菌株的分生孢子液对马唐种子的影响
67.[0068][0069]
从表1的数据可以看出，ma4菌株的分生孢子液对马唐种子的萌发存在较强的抑制作用，具体参见图4所示；未经稀释的分生孢子液对马唐种子发芽抑制率达到94.2％，对马唐种子根长和芽长的抑制率也分别达到76.5％和95.9％。证明ma4具有较好的抑制马唐种子萌发以及根芽生长的作用。
[0070]
测试例2
[0071]
在塑料盆钵中种植马唐，分别在马唐3叶期、5叶期、7叶期，用实施例2制得的ma4菌株的分生孢子液进行茎叶喷雾处理，马唐在处理后3d开始出现褪绿和枯斑症状，处理后5d褪绿和坏死症状明显，处理后8d马唐地上部分完全枯死，株防效达到100％；剪取马唐的地上部分进行称重，以不喷雾处理的马唐作为对照，计算ma4菌株的分生孢子液对不同叶龄马唐的生防效果，结果见表2，对不同叶龄马唐的鲜重防效高达95.5％
‑
97.6％，结果表明ma4发酵液滤液对马唐具有很强的生防效果。
[0072]
表2 ma4菌株的分生孢子液对不同叶龄马唐的生防效果
[0073][0074]
测试例3
[0075]
在田间种植马唐，待马唐幼苗生长至4
‑
5叶期，用实施例2制得的ma4菌株的分生孢子液进行茎叶喷雾处理，以不喷雾处理的马唐作为对照，田间试验结果见表3。由表3可以看出，在ma4菌株的分生孢子液处理后28d，对马唐的株防效达到95.2％，鲜重防效达到98.4％。生测结果表明，藤仓镰刀菌ma4菌株的分生孢子液中含有对马唐形成强除草活性的物质，具有进一步研究与开发的潜力。
[0076]
表3 ma4对马唐的田间防效
[0077]
处理株防效鲜重防效处理后21d92.2
±
4.1
‑‑
处理后28d95.2
±
2.398.4
±
1.1
[0078]
测试例4
[0079]
在塑料盆钵中种植健康的牛筋草、看麦娘、棒头草、钻形紫菀和空心莲子草，用实施例2制得的ma4菌株的分生孢子液进行茎叶喷雾处理，以不喷雾处理的牛筋草作为对照，培养14d后统计ma4菌株的分生孢子液对各种杂草的鲜重抑制率，结果见表4。从表4可以看出，ma4菌株的分生孢子液对牛筋草、看麦娘、棒头草等多种禾本科杂草以及具有较强的侵染能力和鲜重抑制效果，对看麦娘、牛筋草、棒头草、钻形紫菀和空心莲子草的鲜重抑制率
分别达到87.4％、83.2％、79.5％、78.4％、68.2％，表明ma4菌株的分生孢子液在对马唐具有优越防效的同时，能够兼防牛筋草、看麦娘、棒头草等多种禾本科杂草及钻形紫菀和空心莲子草等阔叶草，且对作物安全。
[0080]
表4 ma4菌株的寄主范围测定
[0081][0082][0083]
注：发病株数占全体处理植株的30％以下表示为ls，发病株数占全体处理植株30％
‑
70％为ms，发病植株占70％以上为ss，无发病植株为ns。
[0084]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。