具有活性的感应草多糖及其制备方法与流程

1.本发明涉及具有活性的多糖提取领域。更具体地说，本发明涉及一种具有活性的感应草多糖及其制备方法。


背景技术：

2.多糖是生命活动的主要物质之一，具有抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、降血糖以及抗疲劳等多种生物活性，在疾病预防治疗中表现出强大的开发潜力，近几十年来备受学者关注，如香菇多糖、人参多糖、灵芝多糖均已成为市售医药类产品。
3.感应草(biophytum sensitivum)属于酢浆草科感应草属植物，生于疏林或灌丛中，分布于我国南部地区，在印度传统医药中有“生命植物”之称，被用作补品、兴奋剂。感应草含有多种类型化合物，包括黄酮类、酚类、挥发油等，具有多种生物活性，包括抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗菌等，但对其多糖类物质关注较少。
4.现有的临床上应用的α
‑
葡萄糖普酶抑制剂类药物主要包括阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。由于阿卡波糖等均为合成药物，口服时会出现恶心、呕吐等胃肠道不良反应。因此，越来越多的学者开始青睐于从药用植物中筛选天然α
‑
葡萄糖苷酶抑制剂，以期寻找到安全有效的药物。


技术实现要素：

5.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
6.本发明还有一个目的是提供一种具有活性的感应草多糖及其制备方法，其操作方法简单，开创性的从感应草植物中提取得到了具有较高α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性的感性草多糖，同时其还具有优异的抗氧化性，具有广阔的市场前景。
7.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种具有活性的感应草多糖的制备方法，包括以下步骤：
8.将感应草粉碎，在75～100℃条件下，用水对感应草粉末进行多次提取，合并提取液、浓缩得浓缩液；浓缩液采用醇沉和脱蛋白试剂进行精制，得到感应草多糖。
9.优选的是，感应草粉末与提取剂的质量体积比为1g：25ml，每次提取时间为40～60min，提取多次至最后一次提取液中无产品残留，合并提取液并浓缩得到浓缩液。
10.优选的是，醇沉和脱蛋白试剂进行精制的具体操作为：浓缩液中加入95％乙醇混合，至最终溶液中乙醇浓度为75％，0～5℃静置20h以上，抽滤，用sevage试剂脱蛋白，再加入95％乙醇，使乙醇终浓度为75％，0～5℃静置20h以上，抽滤，干燥，再透析，干燥。
11.优选的是，浓缩比例具体为1/40～1/30。
12.优选的是，所述提取温度具体为80℃，提取时间为50min。
13.优选的是，加入95％乙醇后，静置的温度为4℃，静置的时间为24h。
14.优选的是，所述透析的时间为24h。
15.具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性的感应草多糖，所述感应草多糖中的单糖组分包括木
糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和鼠李糖组成，对应的单糖的摩尔比为1.00：0.03：2.00：1.11：0.19。
16.一种抗氧化剂，其中包含所述感应草多糖。
17.一种α
‑
葡萄糖苷酶抑制剂，其中包含所述感应草多糖。
18.本发明至少包括以下有益效果：
19.本发明通过对酢浆草科感应草属植物感应草的地上部位进行多糖的提取；得到的多糖能有效抑制α
‑
葡萄糖苷酶活性，其活性优于临床常用降糖药物拜糖平，具有广阔的市场前景和生物利用价值；
20.本发明的制备方法得到的感应草多糖还具有优异的抗氧化活性，丰富了植物提取的抗氧化剂的种类，相对于人工合成得到的药品，生物适应度更高。
21.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
22.图1为本发明其中一种技术方案所述硅胶薄层色谱法分析感应草多糖的单糖组分；
23.图2为本发明实施例3的感应草多糖的单糖标准品混合物的hplc图；
24.图3为本发明实施例3感应草多糖的hplc图；
25.图1中，1.木糖(xyl)，2.葡萄糖(glc)，3.鼠李糖(rha)，4.甘露糖(man)，5.半乳糖(gal)，6.核糖(rib)，7.感应草多糖；
26.图2和图3中，1.甘露糖(man)，2.核糖(rib)，3.鼠李糖(rha)，4.葡萄糖(glc)，5.半乳糖(gal)，6.木糖(xyl)。
具体实施方式
27.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
28.本发明的实施例中，所述感应草为酢浆草科感应草属植物感应草(biophytum sensitivum)的地上部位。
29.<实施例1>
30.一种感应草多糖的提取方法，包括以下步骤：
31.s1、感应草干燥后粉碎成粉末，取感应草粉末1kg，采用水作为提取剂，提取温度为100℃，提取时间40min，其中，感应草粉末与提取剂的料液比为：1g感应草粉末对应25ml提取剂，提取多次至最后一次提取液中无产品残留，合并提取液，浓缩至2l，得到提取浓缩液；
32.s2、在提取浓缩液中加入体积分数95％乙醇，使的加入95％乙醇后，得到的混合物的乙醇终浓度为体积分数75％，在5℃环境下静置26h，抽滤，用sevage试剂脱蛋白，重复操作至无明显乳白色沉淀生成为止，再加入体积分数95％乙醇，使得到的混合物的乙醇终体积分数为75％，在5℃环境下静置26h，抽滤，干燥，再利用透析膜(分子量12000
‑
14000)透析24h，干燥，得到感应草多糖。
33.<实施例2>
34.一种感应草多糖的提取方法，包括以下步骤：
35.s1、感应草干燥后粉碎成粉末，取感应草粉末1.2kg，采用水作为提取剂，提取温度为75℃，提取时间60min，其中，感应草粉末与提取剂的料液比为：1g感应草粉末对应25ml提取剂，提取多次至最后一次提取液中无产品残留，合并提取液，浓缩至2l，得到提取浓缩液；
36.s2、在提取浓缩液中加入体积分数为95％乙醇，使得加入体积分数95％乙醇后，得到的混合物的乙醇终浓度为体积分数为75％，在0℃环境下静置20h，抽滤，用sevage试剂脱蛋白，重复操作至无明显乳白色沉淀生成为止，再加入体积分数为95％的乙醇，使得到的混合物的乙醇终体积分数为75％，在0℃环境下静置20h，抽滤，干燥，再利用透析膜(分子量12000
‑
14000)透析24h，干燥，得到感应草多糖。
37.<实施例3>
38.一种感应草多糖的提取方法，包括以下步骤：
39.s1、感应草干燥后粉碎成粉末，取感应草粉末0.8kg，采用水作为提取剂，提取温度为80℃，提取时间50min，提取多次至最后一次提取液中无产品残留，此处多次约3次，合并提取液，浓缩至2l，得到提取浓缩液；
40.其中，感应草粉末与提取剂的料液比为：1g感应草粉末对应25ml提取剂；
41.s2、在提取浓缩液中加入体积分数95％乙醇，使得加入体积分数为95％乙醇后，得到的混合物的乙醇终体积分数为75％，在4℃环境下静置24h，抽滤，用sevage试剂脱蛋白，重复操作至无明显乳白色沉淀生成为止，再加入体积分数为95％的乙醇，使得到的混合物的乙醇终体积分数为75％，在4℃环境下静置24h，抽滤，干燥，再利用透析膜(分子量12000
‑
14000)透析24h，干燥，得到感应草多糖。
42.结果检测：
43.取实施例3的感应草多糖，通过紫外光谱法检测，对感应草多糖的化学组成进行分析，得到其糖含量为69.03％，糖醛酸含量为16.48％。
44.取实施例3的感应草多糖，采用硅胶薄层色谱法和柱前衍生化
‑
hplc法对感应草多糖的单糖组成进行分析，感应草多糖由木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和鼠李糖组成，各单糖的摩尔比为1.00：0.03：2.00：1.11：0.19，葡萄糖含量最高，鼠李糖含量最低。其中，硅胶薄层色谱见附图1；柱前衍生化
‑
hplc对比见附图2～3；
45.实验例
46.一、感应草多糖具有α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性的检测
47.a：测定原理：以无色的对
‑
硝基苯酚
‑
α
‑
d
‑
葡萄糖苷(pnpg)作反应底物，经α
‑
葡萄糖苷酶水解后可生成黄色的对
‑
硝基苯酚(pnp)，405nm处产生最大吸收，通过在405nm下测定吸光度的变化间接测定酶活的抑制情况。
[0048][0049]
b：测定体系：
[0050]
将各待测药液按每孔50μl加入酶标板，每浓度设三复孔。另设一药物对照孔、空白
反应孔及空白对照孔。反应孔加入50μl的0.26u/mlα
‑
葡萄糖苷酶，对照孔加50μl磷酸缓冲液后在微型振荡器上震荡30秒，在恒温水浴锅中37℃孵育10min。然后每孔加100μl底物(10mg/ml pnpg)后，在微型振荡器上震荡30s，在恒温水浴锅中37℃孵育20min。最后每孔加入100μl 0.2mol/l na2co3终止反应。在酶标仪405nm处测定od值。
[0051]
c：α
‑
葡萄糖苷酶活性抑制率计算公式：
[0052][0053]
d：测定方法：各待测药液对α
‑
葡萄糖苷酶的抑制能力用半数抑制浓度(ic
50
)来衡量，抑制率为50％所对应的抑制剂的浓度即为ic
50
。
[0054]
精密称取实施例3得到的感应草多糖，采用磷酸缓冲液作为溶剂溶解，配制6个不同浓度梯度(3mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml)的待测药液；6个不同浓度用二倍稀释法依次得到浓度递减的溶液；
[0055]
精密称取市售化合物阿尔卡糖作为对照样品，采用磷酸缓冲液作为溶剂溶解，配制6个不同浓度梯度(3mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml)的待测对照药液；6个不同浓度用二倍稀释法依次得到浓度递减的溶液；
[0056]
按上述测定体系测定每个稀释浓度的待测液对α
‑
葡萄糖苷酶的抑制能力，计算ic
50
。得到的检测结果见表1。
[0057]
表1感应草多糖的α
‑
葡萄糖苷酶抑制活性
[0058][0059]
由表1的数据，通过计算可知，实施例3的感应草多糖对α
‑
葡萄糖苷酶的ic
50
为0.0425mg/ml，效果优于阿卡波糖(ic
50
＝0.546mg/ml)，通过表1数据可知，阿卡波糖的半抑制浓度为实施例3的感应草多糖的12.8倍。
[0060]
二、感应草多糖具有抗氧化活性对照试验
[0061]
a：测定原理：
[0062]
dpph是稳定的自由基，能在有机溶剂中稳定存在，在517nm下具有最大吸收。有抗氧化剂存在时，dpph的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在517nm下吸光值下降，吸光值降低表明抗氧化性增加。
[0063]
abts

与过硫酸钾反应生成绿色的abts

自由基，在734nm下有最大吸收，有抗氧化
剂存在时，在734nm下吸光值下降，吸光值降低同样表明抗氧化性增加。这两种为常用的评价抗氧化能力的体外分析方法。
[0064]
b：测定体系：取96孔酶标板，依次在板中各孔加入样品溶液和dpph自由基或abts

自由基溶液各100μl为样品组(a
i
)，对照组(a
j
)为超纯水和dpph自由基或abts

自由基溶液各100μl，空白组(a
c
)为超纯水和无水乙醇各100μl。振荡混匀后，避光反应30min，517/734nm处测定吸光值(a)，每组样品设置三个平行，计算平均值。阳性对照组为维生素c(v
c
)溶液。
[0065]
c：抗氧化活性计算公式：
[0066][0067]
d：测定方法：各待测药液的清除能力用半数清除浓度(ec
50
)来衡量，清除率为50％所对应的样品溶液浓度即为ec
50
。精密称取样品，以磷酸缓冲液溶解配成一定浓度，应用二倍稀释法依次得到浓度递减的溶液。按上述测定体系测定每个稀释浓度的清除率，计算ec
50
。
[0068]
表2感应草多糖对dpph自由基的清除能力
[0069][0070]
表3感应草多糖对abts

自由基的清除能力
[0071][0072]
通过表2与表3可以看出，感应草多糖对dpph自由基的ec
50
为0.082mg/ml，对abts

自由基的ec
50
为0.070mg/ml，本发明的制备方法得到的感应草多糖具有优异的抗氧化活性，丰富了植物提取的抗氧化剂的种类，相对于人工合成得到的药品，生物适应度更高。
[0073]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。