1.本发明涉及分子生物学,特别是一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法。
背景技术:
2.耐药结核病(drug
‑
resistant tuberculosis,dr
‑
tb)是指结核分枝杆菌(mtb)对于抗结核药物耐受而表现出抗结核药物治疗效果降低或者失效。耐药结核病在结核患者中占据了很大一部分比重,耐多药结核病(mdr
‑
tb)与广泛耐药结核病(xdr
‑
tb)已经成为临床亟待解决的难题之一。
3.对于抗结核药物,临床最常用以及效果最好的主要是一线药物利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素以及二线药物氟喹诺酮类。结核分枝杆菌对抗结核药物产生耐药性的主要原理为,当某种药物耐药相关的靶基因中的某个碱基位点发生了突变,可导致其所对应的密码子编码的氨基酸发生改变,使结核分枝杆菌对相应的药物产生耐药作用。市场一直在寻找对这6种药物产生耐药相关的基因突变位点的靶基因组合,能够实现快速、准确、全面的检测,本发明解决这样的问题。
4.市场通常采用探针熔解曲线法、实时荧光定量pcr技术分析突变,但是通常只能检测局限的几种位点突变,且不能报告具体的突变类型。市场需要一种技术能够直接获得mtb耐药相关基因的dna序列,分析目标基因所有突变情况;本发明解决这样的问题。
技术实现要素:
5.为解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法,本发明检测结核分枝杆菌8种耐药相关基因rpob、katg、
‑
15 inha、pnca、embb、rpsl、gyra、gyrb目标序列,从而得知6种临床常见抗结核药物的耐药突变情况,检测快速、准确、全面。
6.为了达到上述目的,本发明采用如下技术方案:一种基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法,包括如下步骤:步骤一,结核分枝杆菌插耐药相关基因rpob、katg、
‑
15 inha、pnca、embb、rpsl、gyra、gyrb的特异性引物mtb
‑
rpob
‑
f、mtb
‑
rpob
‑
r、mtb
‑
katg
‑
f、mtb
‑
katg
‑
r、mtb
‑
inha
‑
f、mtb
‑
inha
‑
r、mtb
‑
pnca
‑
f、mtb
‑
pnca
‑
r、mtb
‑
embb
‑
f、mtb
‑
embb
‑
r、mtb
‑
rpsl
‑
f、mtb
‑
rpsl
‑
r、mtb
‑
gyra
‑
f、mtb
‑
gyra
‑
r、mtb
‑
gyrb
‑
f、mtb
‑
gyrb
‑
r,扩增产物为445
‑
775 bp;步骤二,在正向引物的5’端加上aggtcttcacgatacgtcgag碱基序列,在反向引物的5’端加上gtccaatcagttgcagcttcag碱基序列,得到含有特定碱基序列的引物nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
r、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
f、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
r、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
f、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
r,nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
f、nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
r,nano
‑
mtb
‑
embb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
embb
‑
r、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
r;合成这8对含有特定碱基序列的引物,再将这8对引物混合,形成
引物池;步骤三,合成第二轮扩增需要使用的barcode 引物;步骤四,提取基因组dna;步骤五,用引物池进行第一轮扩增并纯化;步骤六,用barcode引物进行第二轮扩增并给各个样本加上不同的barcode标签;步骤七,构建测序文库并纯化;步骤八,使用纳米测序仪测序,对数据进行质控分析后,进行数据分析。
7.进一步的,步骤一中的引物mtb
‑
rpob
‑
f、mtb
‑
rpob
‑
r、mtb
‑
katg
‑
f、mtb
‑
katg
‑
r、mtb
‑
inha
‑
f、mtb
‑
inha
‑
r、mtb
‑
pnca
‑
f、mtb
‑
pnca
‑
r、mtb
‑
embb
‑
f、mtb
‑
embb
‑
r、mtb
‑
rpsl
‑
f、mtb
‑
rpsl
‑
r、mtb
‑
gyra
‑
f、mtb
‑
gyra
‑
r、mtb
‑
gyrb
‑
f、mtb
‑
gyrb
‑
r的序列分别是:seq01、seq02、seq03、seq04、seq05、seq06、seq07、seq08、seq09、seq10、seq11、seq12、seq13、seq14、seq15、seq16。
8.进一步的,步骤二中的引物nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
r、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
f、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
r、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
f、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
r,nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
f、nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
r,nano
‑
mtb
‑
embb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
embb
‑
r、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
r的序列分别是:seq17、seq18、seq19、seq20、seq21、seq22、seq23、seq24、seq25、seq26、seq27、seq28、seq29、seq30、seq31、seq32。
9.进一步的,步骤二中, nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpob
‑
r、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
f、nano
‑
mtb
‑
katg
‑
r、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
f、nano
‑
mtb
‑
inha
‑
r,nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
f、nano
‑
mtb
‑
pnca
‑
r,nano
‑
mtb
‑
embb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
embb
‑
r、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
f、nano
‑
mtb
‑
rpsl
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyra
‑
r、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
f、nano
‑
mtb
‑
gyrb
‑
r这8对引物按照浓度比1:1:1.5:2:1:1:0.8:0.8混合形成引物池。
10.进一步的,步骤五中用引物池进行第一轮扩增的反应总体系包括:2
×
pcr mix 25μl,引物池 5μl,基因组dna 50 ng,ddh2o补至50μl;反应程序为:95 ℃ 预变性5min;95 ℃变性15s ,58 ℃退火60 s,72 ℃延伸15 s,20个循环;95 ℃变性15s ,62 ℃退火60s,72 ℃延伸15s,20个循环;循环结束后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存;纯化采用磁珠纯化。
11.进一步的,步骤六中用barcode引物进行第二轮扩增的反应总体系包括:2
×
pcr mix 25μl,barcode 2μl,第一次扩增纯化后产物21μl,ddh2o补至50μl;反应程序为:95 ℃ 预变性5min;95 ℃变性15s ,62 ℃退火15s,72 ℃延伸30 s,12个循环;循环结束后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存;纯化采用磁珠纯化。
12.进一步的,步骤七中构建测序文库并纯化的具体方法包括:(1)pooling:将第二次扩增后的纯化产物进行pooling;(2)末端修复、加a尾:总体系为:pooling完的dna溶液50μl,末端修复mix 15μl;反应程序为,20 ℃ 反应15 min,65 ℃终止反应 15 min,4 ℃保存;(3)末端修复进行磁珠纯化;
(4)接头连接的总体系为:末端修复纯化后产物25μl,5
×
ligation buffer 10μl,t4 rapid dna ligase 5μl,adapter mix 1μl,ddh2o 9μl;反应程序为,20 ℃ 反应15 min,4 ℃保存;(5)将接头连接产物进行磁珠纯化后得到终文库。
13.进一步的,步骤八中使用nanopore公司的minion测序仪,测序试剂盒:sqk
‑
lsk109,测序芯片:r9进行纳米测序仪测序。
14.进一步的,步骤八中使用纳米测序仪测序,对数据进行质控分析后,进行数据分析的具体步骤包括:(a) 芯片诱发:配置诱发剂后诱发;诱发剂为:15μl flt,500μl fb, 200μl 去酶水;(b)上机文库点样:配置上机文库后加样,加样完毕后,盖上加样孔的盖子,关闭诱发试剂孔,插上数据线,与上机电脑相连接,设置上机程序后开始测序;上机文库为:加入18.8μl sqb,12.8 μl lb,200 ng dna文库,然后加入ddh2o补充至47μl;(c)数据下机后,通过对下机数据进行质控分析:将碱基识别错误率在99 %以下的序列进行过滤,然后将去除接头及barcode序列后长度在400 bp以下以及800 bp以上的序列进行过滤,最后将合格的序列与结核分枝杆菌基因组序列进行比对;(d)通过与数据库中的耐药相关基因的常见突变位点的比对分析,可以得到样本中常见耐药突变位点的突变情况。
15.采用上述技术方案后,本发明的有益之处在于:本发明设计8种耐药相关基因的目标区域的扩增引物,可以同时检测6种药物,通过序列比对,能对核苷酸突变进行分析,报告具体突变类型以及突变比例,操作简便,具备高通量、敏感、准确全面;这是目前市场上的分子检测手段所不具备的能力;本发明对多重pcr的引物池浓度比例进行调整,使得最终每个靶基因区域测序都能产生均一性较高的测序数据量;本发明构建nanopore扩增子建库测序方法,使pcr得到的扩增子能有效地通过minion测序仪的纳米孔,从而获得结核分枝杆菌耐药基因数据结果,纳米孔测序仪minion小巧灵活,可以随时随地实时测序,最快数十分钟即可获得目标序列。最快8小时即可完成从dna的扩增到数据分析,其他平台的检测如illumina二代测序需要1
‑
2天时间),灵活简便,准确灵敏。
附图说明
16.图1为本发明dna扩增与文库构建的流程示意图;图2为本发明利福平耐药相关突变碱基检出结果示意图(横坐标为不同混样方法对应的barcode编号,纵坐标为利福平耐药突变序列占总序列(测序获得的未突变序列与突变序列之和)的比例)。
具体实施方式
17.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
18.根据如下的基于纳米孔测序仪的结核分枝杆菌耐药型鉴定方法验证本发明的技术效果,包括如下步骤:步骤一:设计结核分枝杆菌插耐药相关基因rpob、katg、
‑
15 inha、pnca、embb、rpsl、gyra、gyrb目标序列引物,扩增产物为445
‑
775 bp。引物序列信息见表1。
19.结核分枝杆菌rna聚合酶β亚单位的编码基因rpob基因,是利福平的药物作用靶标。过氧化氢酶还原酶的编码基因katg基因、烯酰基运载蛋白还原酶的编码基因inha的
‑
15调节区,分别是异烟肼的药物活化位点以及药物作用靶标。吡嗪酰胺酶的编码基因pnca基因,是吡嗪酰胺的药物活化位点。s12核糖体蛋白的编码基因rpsl基因,是链霉素的药物作用靶标。阿拉伯糖基转移酶的编码基因embb基因,是乙胺丁醇的药物作用靶标。dna旋转酶a、b的编码基因gyra、gyrb基因,是氟喹诺酮类药物的作用靶标。本发明选取这样的组合在检测结果全面,准确灵敏高上具有协同作用。
20.表1 结核分枝杆菌耐药相关基因特异性引物 步骤二,在上述正向引物的5’端加上aggtcttcacgatacgtcgag碱基序列,反向引物的5’端加上gtccaatcagttgcagcttcag碱基序列,具体见表2。加上特定的序列是为了在使用barcode引物进行二次扩增时使barcode引物与这些特定序列结合从而进行pcr扩增,最终得到具有barcode标签信息的扩增产物,从而在数据分析时能对不同样本进行区分。
21.表2含特定碱基序列的引物
合成含特定碱基序列的8对引物(100
ꢀµ
m),将8对引物混合形成引物池,引物池的浓度比例为1:1:1.5:2:1:1:0.8:0.8。本实施例中的引物浓度比例并非唯一,一般来说,当pcr反应体系中的引物浓度在0.1
‑
0.5
µ
m时均能达到实验目的。
22.步骤三,合成nanopore公司的二轮扩增barcode 引物,共96种(这里只合成了前12种);具体见表3。
23.表3 barcode引物
步骤四,结核分枝杆菌阳性样本耐药相关基因目标序列第一轮扩增与产物纯化;pcr获得扩增子与文库构建流程见图1 使用混好的引物池对结核样本dna进行pcr扩增(命名为1、2、3、4):反应总体系50μl,其中2
×
pcr mix(vazyme)25μl,引物池 5μl,基因组dna 50 ng,ddh2o补至50μl。反应程序为:95 ℃ 预变性5min;95 ℃变性15s ,58 ℃退火60 s,72 ℃延伸15 s,20个循环;95 ℃变性15s ,62 ℃退火60s,72 ℃延伸15s,20个循环;循环结束后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。
[0024] 在50μl pcr产物加入35μl ampure xp beads,吹打混匀后室温静置5 min;置于磁力架上,待2
‑
5 min液体澄清后弃上清;加入200 μl 新配的80%乙醇,磁力架上静置30 s后弃上清,重复一次;吸干净残留的乙醇,开盖室温晾干约5min,待磁珠干燥即加入23μl ddh2o洗脱dna;吹打混匀后室温静置3 min,吸取21μl 用于第二次扩增。
[0025]
步骤五,第二次扩增,给样本加上不同的barcode标签 用barcode引物进行pcr扩增:反应总体系50μl,其中2
×
pcr mix(vazyme)25μl,barcode 2μl,第一次扩增纯化后产物21μl,ddh2o补至50μl。反应程序为:95 ℃ 预变性5min;95 ℃变性15s ,62 ℃退火15s,72 ℃延伸30 s,12个循环;循环结束后72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。
[0026] 磁珠纯化方法与实施例2中的方法完全相同。
[0027]
步骤六:测序文库的构建、纯化: pooling:将第二次扩增后的纯化产物按照每个样本100 ng进行pooling,pooling后总体积不超过50 μl,不足50 μl的用ddh2o补充至50 μl。
[0028] 末端修复、加a尾:总体系为65μl,pooling完的dna溶液50μl,末端修复mix(vazyme)15μl。反应程序为,20 ℃ 反应15 min,65 ℃终止反应 15 min,4 ℃保存。
[0029] 末端修复纯化,在65μl pcr产物加入52μl ampure xp beads,之后纯化方式与实施例2 中的纯化方法相同,最后洗脱dna时用27μl ddh2o洗脱,取25μl用于接头连接。
[0030]
接头连接:总体系为50μl,末端修复纯化后产物25μl,5
×
ligationbuffer(neb)10μl,t4rapiddnaligase(neb)5μl,adaptermix(nanopore)1μl,ddh2o9μl。反应程序为,20℃反应15min,4℃保存。
[0031]
接头连接产物纯化:在50μl接头连接产物中加入35μlampurexpbeads,吹打混匀后室温静置5min;置于磁力架上,待2
‑
5min液体澄清后弃上清;加入200μlsfb(nanopore),磁力架上静置30s后弃上清,重复一次;吸干净残留的乙醇,开盖室温晾干约5min,待磁珠干燥即加入15μlddh2o洗脱dna;吹打混匀后室温静置3min,吸取13μl即得到终文库。
[0032]
步骤七:使用nanopore公司的minion测序仪测序(测序试剂盒:sqk
‑
lsk109,测序芯片:r9)芯片诱发:诱发剂的配制:取一个1.5mlep管,加入15μlflt,500μlfb,然后加入200μl的去酶水,吹打混匀。
[0033]
诱发:将已质检完毕的芯片插入到上机机器中,打开加诱发试剂的孔,用1000μl的移液枪,吸取450μl的诱发剂,加入诱发剂前先调小一点量程,使枪尖带有小液珠,插入孔中,调小量程使液体缓缓进入芯片,直到不能调小量程为止。诱发剂加入完毕后,关闭孔洞静置5min。接着打开孔洞,按照上一步方法继续加入200μl的诱发剂。
[0034]
上机文库点样:上机文库的配置:取一个ep管,加入18.8μlsqb,12.8μllb,200ngdna文库,然后加入ddh2o补充至47μl,吹打混匀。
[0035]
加样:打开加样孔,用100μl的移液枪,吸取47μl的上机文库,加样时,枪尖悬空在加样孔上方,缓慢按动移液枪,确保上机文库一滴一滴地加入。加样完毕后,盖上加样孔的盖子,关闭诱发试剂孔,插上数据线,与上机电脑相连接,设置上机程序后开始测序。每个样本数据量达到200k即可停止测序。
[0036]
数据下机后,过滤接头序列等无效数据:将碱基识别错误率在99%以下的序列进行过滤,然后将去除接头及barcode序列后长度在400bp以下以及800bp以上的序列进行过滤。最后将合格的序列与结核分枝杆菌基因组序列进行比对,通过与数据库中的耐药相关基因的常见突变位点的比对分析,可以得到样本中常见耐药突变位点的突变情况。
[0037]
实验一:对4例结核阳性样本使用本发明进行了结核耐药基因突变检测(编号1,2,3,4),有一例样本未检测到耐药基因相关突变,三例样本检测到了耐药基因相关突变,结果见表5。(注:第3列916a>g即embb基因的916位碱基由a突变成了g,第4列甲硫氨酸306缬氨酸即前述突变导致embb基因的第306位密码子所编码的氨基酸由甲硫氨酸变成了缬氨酸)。另外,在实施例中,未检测到氟喹诺酮类药物耐药相关的gyrb基因的突变,是因为gyrb基因的突变频率较低,但该基因也会产生耐药相关突变如苏氨酸511天冬酰胺、脯氨酸592丝氨酸。
[0038]
表54例样本结核耐药基因突变鉴定结果
实验二,耐药突变株的检测限实验:将1例利福平敏感(编号1)和1例利福平耐药(编号2,丝氨酸450亮氨酸)的结核分枝杆菌病dna按照表6所述方法混合后使用本发明进行检测。结果如图2所示。
[0039]
表6两例样本按不同比例混合(使用7个barcode标签对不同混合方式加以区分)结果分析:由表6和图2可知:本发明检出的导致利福平耐药的rpob基因450位密码子突变序列占比与实验中混样比例能够保持良好的符合关系。说明当某个耐药位点的突变频率在10%以上时,本发明对于结核分枝杆菌耐药株的检测具有准确的报告结果。
[0040]
实验三,检测灵敏性实验:将已知拷贝数(10000cfu/ml)的利福平耐药(丝氨酸450亮氨酸)结核dna进行梯度稀释,得到一系列不同浓度的结核dna(1000cfu/ml、100cfu/ml、10cfu/ml、1cfu/ml)。然后用本发明所述方法进行耐药检测,耐药突变鉴定结果如表7所示。
[0041]
表7本发明灵敏性验证结果结果分析:表7表明本发明的检测限可低至100cfu/ml,能达到常规的分子检测方
法的普遍检测限(100cfu/ml)。
[0042]
实验四,检测准确性实验:选取8例结核分枝杆菌dna,其中7例为已知耐药突变,1例为无耐药相关突变。具体见表8。
[0043]
表8本发明准确性验证结果实验结果分析:由表8可知:用本发明对这8例样本进行结核分枝杆菌耐药检测结果与已知耐药突变情况达到100%的一致性,说明了本发明对于结核耐药突变检测极高的准确性。
[0044]
本发明设计8种耐药相关基因的目标区域的扩增引物,可以同时检测6种药物,通过序列比对,能对核苷酸突变进行分析,报告具体突变类型以及突变比例,操作简便,具备高通量、敏感、准确全面的优点;目前市场上的分子检测手段不具备这样的能力,具有广大的市场价值。
[0045]
除上述优选实施例外,本发明还有其他的实施方式,本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形,只要不脱离本发明的精神,均应属于本发明权利要求书中所定义的范围。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询,结果仅供参考。