一种蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量PCR检测试剂盒的制作方法

一种蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量pcr检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术，涉及一种蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量pcr检测试剂盒及应用，是一种可同时检测蜱虫、非洲猪瘟病毒和猪基因组的三重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法，可短时间内完成对三种基因组的检测。在检测非洲猪瘟病毒的同时，可为蜱虫的宿主分析和非洲猪瘟病毒的溯源研究提供科学依据。


背景技术：

2.蜱虫广泛分布于世界各个地区，各生长阶段都需要寻找合适的宿主吸血。蜱虫最严重的危害是其体内携带的多种病原体可在吸血及更换宿主的过程中广泛传播。蜱虫可传播多种病毒、细菌、原虫等病原体，非洲猪瘟病毒被证明是其中一种，该病毒的传播途径包括经由蜱虫等生物媒介传播。所以快速并准确诊断蜱虫是否携带和传播非洲猪瘟病毒，是控制和预防该传染病的重要步骤。
3.非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，严重危害全球养猪业。该病病程极短，死亡率极高。世界动物卫生组织(oie)将其列为必须报告的动物疫病，中国将其列为一类动物疫病，也是最复杂的传染病之一。目前非洲猪瘟尚无有效疫苗、无有效的治疗措施，控制只能依靠检测加上扑杀。
4.近年来，非洲猪瘟的危害程度呈上升趋势，在世界范围内形成了相当大的扩散面和污染面。我国当前防控形势仍然复杂严峻，境外疫情传入风险增加。非洲猪瘟病毒的快速并有效的检测是预防和控制疾病流行的重要前提。然而，蜱虫作为非洲猪瘟病毒的储存宿主和生物载体，研究其在病毒传播中的作用具有重要意义。非洲猪瘟病毒检测方法集中于常规pcr技术和荧光定量pcr技术，这两种方法都是oie推荐的，其灵敏度高、特异性强、重复性好，适合特定病毒的检测。为解决所述问题，本发明开发了一种新颖、高效、高度灵敏且特异的三重荧光定量pcr检测试剂盒，满足实际检测蜱传非洲猪瘟病毒的应用需求，有望可以成为控制和预防非洲猪瘟疫病的实用型诊断工具。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量pcr检测试剂盒，具有良好特异性、较高敏感性和稳定性。
6.本发明试剂盒包含：pcr反应液，热启动taq dna聚合酶，探针法荧光定量pcr配套buffer，三对特异性引物和相应的探针，无核酶的水、对照品(包括标准品阳性对照和阴性对照)。其中，pcr反应液含有mg
2
离子、pcr缓冲液、dntps混合物等荧光定量pcr体系所必需的组分。对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为带有蜱虫、非洲猪瘟病毒和猪基因组dna片段的标准品模板，阴性对照为无核酶的水。
7.三重荧光定量pcr检测试剂盒中用于鉴定蜱虫基因组的18s rrna基因特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物的碱基序列如seq id no.1所示，
下游引物的碱基序列如seq id no.2所示，荧光探针的碱基序列如seq id no.3所示；
8.用于鉴定非洲猪瘟病毒的b646l基因特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物的碱基序列如seq id no.4所示，下游引物的碱基序列如seq id no.5所示，荧光探针的碱基序列如seq id no.6所示；
9.用于鉴定猪基因组的cox1基因特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物的碱基序列如seq id no.7所示，下游引物的碱基序列如seq id no.8所示，荧光探针的碱基序列如seq id no.9所示。
10.阳性标准品目的基因的具体序列见序列表seq id no.10
‑
12。检测蜱虫基因组的18srrna基因片段具有seq id no.10所示的核苷酸序列；检测非洲猪瘟病毒基因组的b646l基因片段具有seq id no.11所示的核苷酸序列；而检测猪基因组的cox1基因片段具有seq id no.12所示的核苷酸序列。分别将三种目的基因扩增，连入pmd19
‑
t载体，构建重组质粒用作标准品模板。
11.本试剂盒保存于
‑
20℃，并尽量减少反复冻融次数。
12.本发明的另一个目的是提供所述试剂盒在检测蜱虫、非洲猪瘟病毒和猪基因组中应用，通过以下步骤实现：
13.步骤一：利用“白布拖拉法”实地野外采集蜱虫或从动物身上摘取蜱虫样品，每一只蜱虫放入一个1.5ml无菌离心管中；
14.步骤二：按照基因组提取试剂盒说明书进行操作，提取和纯化样品中的dna。首先将采集的蜱虫用无水乙醇洗净并捣碎，加入200μl缓冲液ga(或磷酸盐缓冲液)制成细胞悬液。再经蛋白酶k水浴消化3h。加入200μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心以去除管盖内壁的水珠；加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15s，简短离心以去除管盖内壁的水珠；将所得溶液和絮状沉淀都转移至一个置于收集管中的吸附柱cb3中，12000rpm离心30s，倒掉废液；加入500μl缓冲液gd(使用前确保加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液；加入600μl漂洗液pw(使用前确保加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液；重复上一步骤；12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱cb3室温放置数分钟；将吸附柱转移到一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50μl洗脱缓冲液te，室温放置2
‑
5min，12000rpm离心2min。最后每一份提取的蜱虫基因组dna由洗脱缓冲液洗脱，可以直接使用或于
‑
20℃冻存备用；
15.步骤三：以所述步骤二中提取的蜱虫样品基因组dna作为待检测模板，在荧光定量pcr反应液中加入设计好的多对引物和探针，在一个反应管中进行三重荧光定量pcr扩增反应。所述扩增反应体系混合液的组分及其体积如下所示：10μl probe master mix(含有mg
2
离子、dntps混合物、热启动taq dna聚合酶等)，2μl模板dna，检测18s基因的上下游引物各0.8μl，探针0.4μl；检测非洲猪瘟病毒b646l基因的上下游引物各0.8μl，探针0.4μl；检测cox1基因的上下游引物各0.8μl，探针0.8μl(所用的引物和探针的浓度为10μm)，无核酶的水1.6μl。所述的反应混合液在荧光定量pcr仪运行的扩增反应程序为：37℃污染消化2min，95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火延伸30s，重复循环进行上述的变性和退火延伸程
序共40次。在最优反应混合物和程序下，进行三重荧光定量pcr检测反应；
16.步骤四：选择荧光定量pcr仪所有荧光检测通道开放，fam、vic、rox为多重反应同时测试，设定阈值，由电脑分析并得到ct值。根据得到扩增曲线和读取的ct值进行结果判定。
17.作为本发明的进一步说明，对于三种基因组所述的结果判定方法是根据扩增曲线和生成的ct值，当ct值≤32个循环时可判断结果为阳性；ct值≥38，即为阴性。ct值处于32到38之间的认为是可疑样品，需要再次确认。
18.作为本发明的进一步说明，每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，阳性对照使用构建的标准品质粒作为模板，阴性对照的模板为无核酶水。所述的水均无核酶水，也可使用灭菌双蒸水。
19.作为本发明的进一步说明，反应混合液中使用的引物和探针浓度为10μm。
20.作为本发明的进一步说明，所述三重荧光定量pcr反应混合液各组分用量均为经过一系列实验优化后选定的比例。而满足以下范围条件均可完成对三种基因组的检测：反应混合液中mg
2
的浓度为1.0
‑
3.0mm，所述dntps混合物浓度为20
‑
200μm，上下游引物浓度为0.1
‑
0.5μm，探针浓度为0.1
‑
0.5μm，taq dna聚合酶浓度为0.5
‑
5u/反应。
21.作为本发明的进一步说明，所述的蜱传非洲猪瘟病毒的三重荧光定量pcr检测试剂盒，每一份蜱虫检测样品都应设置3
‑
4个平行孔。对于存在疑问的样品，应至少进行三次重复实验。
22.本发明试剂盒包括用于检测蜱虫的鉴定基因18s rrna的特异性引物和荧光探针，该特异性引物和荧光探针可确保所有蜱虫都可以被检测，作为整个系统内部参照使用，避免假阳性结果。
23.本发明试剂盒包括用于检测非洲猪瘟病毒的鉴定基因b646l的特异性引物和荧光探针，实验验证表明与猪的其他重要病原体不会产生交叉反应，包括古典猪瘟病毒(csfv)、伪狂犬病病毒(prv)、猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(prrsv)、猪圆环病毒(pcv)，可用作特异检测非洲猪瘟病毒的方法。同时，优化后体系的检测效果略优于oie推荐的检测方法。
24.本发明试剂盒中包括了用于单一检测猪物种的cox1基因的特异性引物和荧光探针，而不会对马、牛、羊、犬和猫的基因组dna出现反应。所述cox1基因的特异性引物和荧光探针可用于分析蜱虫的寄生阶段与猪作为宿主的内部联系，同时可以验证非洲猪瘟病毒是否还存在其他携带宿主，为今后的研究提供证明。在检测蜱传非洲猪瘟病毒的过程中作为溯源体系使用。
25.本发明具备以下良好效果：(1)本发明的三重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法特异性良好。能够同时检测蜱虫、非洲猪瘟病毒和猪的基因组dna，且与其他基因没有交叉反应。通过普通pcr和荧光定量pcr双重验证了引物和探针的特异性。利用标准品连续稀释液作为模板产生的扩增曲线和标准曲线证明了该体系具有较好的稳定性。(2)本发明的三重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法敏感性较高。对蜱虫、非洲猪瘟病毒和猪的重组质粒标准品的检出下限分别为125.1拷贝数/微升、517.9拷贝数/微升、543.6拷贝数/微升。非洲猪瘟病毒单一检测体系的检出灵敏度略优于世界动物卫生组织推荐的方法，满足实际检测需要。(3)本发明的三重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法重复性良好。将标准品模板连续稀释液通过三重荧光定量pcr扩增反应在不同日期的三台独立机器中进行重复性分析测
试。组内与组间重复性试验的变异系数(cv)的范围为0.05％至2.75％，表明三重荧光定量pcr体系具有良好的重复性。(4)本发明的三重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法具有高效性和创新性。(5)本发明的三重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法应用于浙江省内采集的120只蜱虫临床样本。每5只蜱虫设为一份检测样品，共24份，进行三次重复实验。检测结果为：所有检测样品都检测到蜱虫基因组的信号，蜱虫基因组阳性率为100.0％(24/24)；只有两份样品检测出cox1基因的荧光信号，故猪的基因组检出阳性率为8.3％(2/24)。但是在本次实验中，未能检出非洲猪瘟病毒的基因组，阳性率为0％(0/24)。证明了本发明的试剂盒和检测方法具备较高准确性和实用性，同时可以用于猪血临床样品中的非洲猪瘟病毒检测。综上所述，本发明的三重荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法为蜱传非洲猪瘟病毒临床检测和流行病学调查提供了简便、高效、可信度高的技术手段。
附图说明
26.图1标准品质粒的pcr产物电泳验证。
27.图2三种标记基因特异性引物的pcr验证。
28.图3三重荧光定量pcr检测体系的产物电泳验证。
29.图4三重检测体系的标准曲线及扩增曲线。
30.图5三重荧光定量检测试剂盒的临床样品检测。
具体实施方式
31.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明。应该理解，实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
32.实施例1在本实施例中，提供一种具有良好特异性、较高敏感性和稳定性的蜱传非洲猪瘟病毒三重荧光定量pcr检测试剂盒，其步骤如下：
33.1.材料la taq dna聚合酶反应系统、pmd19
‑
t克隆系统、dna分子量标准marker购自于宝生物工程(大连)有限公司，2
×
master pcr mix反应系统购自于近岸蛋白质科技有限公司，2
×
aceq u

probe master mix反应系统购自于南京诺维赞生物科技有限公司，血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒购于tiangen公司，质粒小量抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购于axygen公司，氨苄青霉素等常用试剂均购自于上海生工生物工程技术服务有限公司，pcr仪为proflex pcr仪，荧光定量pcr仪器为美国伯乐cfx96荧光定量pcr仪。
34.2.引物探针的设计与合成
35.以上述目的基因序列为模板，使用primer premier 5.0软件进行分析、设计引物和探针。扩增引物由杭州有康生物科技有限公司合成，探针由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
36.3.三种基因组dna标准品的制备及pcr验证根据基因组提取试剂盒说明书，利用实验室储存的蜱虫样品、家猪肌肉组织提取基因组dna，用相应的标准品上下游引物在pcr仪上进行la taq dna聚合酶扩增，反应条件为94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸20s共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。pcr产物经2％琼脂糖电泳确认条带大小正确之后切下目的条带进行凝胶回收。回收产物用克隆系统插入pmd19
‑
t载体，并转化大肠杆菌，在含氨苄青霉素的培养基中培养，将阳性克隆送有康生物科技(杭州)有限公司测序部进行测序验证。测序表明插入片段正确，对应的凝胶回收产物用无菌去离子水调整为10
11
拷贝数/微升，即为标准品，以作为后续实验的模板稀释液和阳性对照。asfv的标准品质粒由公司合成。并将三种质粒分别命名为pmd
‑
19t
‑
tick18s、pmd
‑
19t
‑
asfvb646l和pmd
‑
19t
‑
pigcox1。此外，质粒拷贝数通过下式计算：n(毫升)＝[6.02
×
10
23
(拷贝数/摩尔)
×
c(克/毫升)]/mw(克/摩尔)，其中c为浓度，mw为计算的平均分子量(双链dna)，计算方法是碱基的数量(b)
×
660。通过质粒中插入片段中的碱基数目来确定b。
[0037]
pcr验证结果经测序表明，上述设计的标准品完全与预期符合，蜱虫、非洲猪瘟病毒和猪基因组的三种标准品目的基因片段序列分别如序列表的seq id no.10,11,12所示。再次经过pcr及电泳验证结果见图1：泳道m：dna分子量标准marker(100bp plus)；泳道1,4,7：分别以蜱虫、非洲猪瘟病毒和家猪的基因组dna作为模板的扩增条带；泳道2,5,8：以构建的三种质粒标准品作为模板的扩增条带；泳道3,6,9：阴性对照品。
[0038]
4.蜱虫和猪基因组特异性引物的pcr验证采集马、牛、羊、犬和猫几个物种的肌肉组织或血液，按照dna提取试剂盒说明书提取基因组dna，并测定其浓度，然后用无菌去离子水调整为可用作后续验证模板的适宜浓度。同时，利用上述方法提取储存在浙江大学寄生虫实验室的10份蜱虫样品的基因组dna，蜱虫样品的种属包括血蜱属，硬蜱属和扇头蜱属。每份样品的基因组dna由50μl缓冲液洗脱到1.5ml无菌离心管中，保存在
‑
20℃以备后续使用。
[0039]
利用获得的dna验证每对引物的特异性。取10μl 2
×
master pcr mix反应液冰浴融化后，加入对应的上下游引物各1μl，待检dna模板1μl，用7μl无核酶的水补足至20μl。制备好的pcr反应试剂管用微量移液器吹打混匀后瞬时高速离心2s，置于pcr仪上后运行如下反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸20s共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。然后取10μl扩增产物经2％琼脂糖电泳确认条带大小，并进行测序验证。
a组中利用猪、马、牛、羊、犬、猫六个物种的基因组dna验证本实验建立的cox1基因的特异性；b组中利用实验室储存的蜱虫dna和猪、马、牛、羊、犬、猫的基因组dna验证18s rrna引物的特异性；c组中利用几种重要的猪病原体共同验证非洲猪瘟病毒的检测体系，该部分实验由浙江省检验检疫科学技术研究院协助完成；阴性对照是利用无核酶的水作为模板。
[0040]
pcr产物电泳验证结果如图2：a组：构建的非洲猪瘟病毒检测体系的引物验证泳道m：dna分子量标准marker(100bp plus)；泳道a：以提取的非洲猪瘟病毒基因组作为模板，泳道b
‑
g：分别以另外几种猪病原体基因组作为模板(包括csfv、prv、prrsv、pcv2、pcv3、pcv4)，泳道h为阴性对照；b组：构建的cox1鉴定基因引物的验证泳道m：dna分子量标准marker(100bp plus)；泳道1：以猪的基因组作为模板，泳道2
‑
6：以其余各物种基因组作为模板，泳道7为阴性对照；每个物种都利用相同内参基因进行扩增验证。c组：构建的18s rrna基因引物的验证泳道m：dna分子量标准marker(100bp plus)；泳道0：以蜱虫基因组作为模板，泳道1
‑
6：利用上述各物种基因组作为模板，泳道7为阴性对照。
[0041]
5.三重荧光定量pcr检测试剂盒的验证按照制造商的说明，使用2
×
probe master mix说明书提供的反应条件和反应程序在美国伯乐cfx96荧光定量pcr仪上进行反应。将设计好的三对引物和对应的探针，在同一个反应管中进行荧光定量pcr扩增反应。三重荧光定量反应混合液包括10μl probe master mix，三对浓度为10μm的引物、探针组合各0.8μl、无核酶的水5.6μl以及质粒模板2μl。而在设定的五个组别中加入的模板不同，
[0042]
第一组中只加入蜱虫的pmd
‑
19t
‑
tick18s标准品质粒；第二组中只加入非洲猪瘟病毒的标准品质粒pmd
‑
19t
‑
asfvb646l作为模板；第三组利用质粒pmd
‑
19t
‑
pigcox1作为模板；第四组的模板是三种质粒等比例混合；第五组为阴性对照，以无核酸酶的水作为模板。每个组别设置三个平行孔实验，最后将荧光定量pcr的反应产物进行经2％琼脂糖核酸电泳验证，确定目的条带的大小以及数量。
[0043]
荧光定量pcr的反应结果为：前三个加入单一模板的组别中，只出现了单一扩增曲线；第四组中产生三条扩增曲线，且曲线均满足似“s”型；而第五组没有荧光产生。琼脂糖电泳结果如图3：泳道m：dna分子量标准marker(100bp plus)；泳道1
‑
5为对应的组别荧光定量pcr反应产物的核酸电泳条带，每个组别有三个泳道。目的条带大小和数目与预期相符，证明三重荧光定量pcr检测试剂盒构建成功。
[0044]
6.三重荧光定量pcr检测试剂盒的分析和优化首先鉴定三种单重检测体系，利用特定的引物探针序列组合检测相应的标准品模板，进行荧光定量pcr扩增反应。将上述制备的每种标准品浓度调整为10
11
拷贝数/微升，再从10
11
到101拷贝数/微升进行十倍倍比梯度稀释。每一份稀释样品都用作单重检测体系的模板，共10份稀释液，然后和相应的引物探针在伯乐cfx96荧光定量pcr仪进行分析和优化，每个模板进行三个平行实验。每种基因组检测的荧光定量pcr反应体系均为20μl，包括10μl probe master mix，质粒模板2μl，浓度为10μm的引物、探针各0.8μl和无核酶的水5.6μl。荧光定量pcr仪运行的扩增反应程序为：37℃污染消化2min，95℃预变性30s，95℃变性10s，60℃退火延伸30s，重复循环进行上述的变性和退火延伸程序共40次。绘制出单一荧光定量pcr检测体系的标准曲线，计算出拟合优度(r2)和扩增效率(e)。同时调整体系内引物和探针的浓度配比，使单一体系最优。
[0045]
将上述得到的每个单一检测体系内最优配比的引物和探针都加入到一个反应管中进行三重荧光定量pcr反应。同时将三种标准品质粒等比合并，制备三重体系的标准品，同样进行十倍倍比梯度稀释，利用上述方法得到三重体系的扩增曲线。根据扩增曲线绘制出三种待检测基因组体系的标准曲线。最终再次通过调整试剂盒内各组分的配比，使三重荧光定量pcr检测体系达到最优。
[0046]
7.三重体系的标准曲线和扩增曲线图4中的a、b、c是三重检测体系生成的3条标准曲线，每条标准曲线的拟合优度(r2)均大于0.99，扩增效率(e)处于90％
‑
110％之间。符合预期的评估标准，证明了该三重体系具有良好的稳定性。图4中d是本次研究构建的非洲猪瘟病毒的单一荧光定量检测方法，通过实验由荧光定量pcr仪器产生标准曲线。图4中e是利用世界动物卫生组织推荐的引物和探针的序列及配比进行实验，由荧光定量pcr仪器产生的标准曲线。步骤6中三重体系产生的扩增曲线由荧光定量pcr仪器自动生成，如图4中f所示：其中，红色曲线代表标记猪cox1基因片段的荧光基团产生的信号强度；绿色曲线代表蜱虫18s基因片段的荧光基团产生的信号；蓝色曲线代表检测非洲猪瘟病毒基因组的荧光基团信号。
[0047]
通过每条标准曲线计算出每个检测体系的检测限，将三重荧光定量pcr检测体系的敏感度与单一检测体系进行对比评估。结果如下表所示，三重检测体系中的检测非洲猪瘟病毒的灵敏度与世界动物卫生组织推荐的方法灵敏度近似相等，满足实际要求。对于蜱虫和猪的基因组检测灵敏度相对较高，可作为三重荧光定量pcr检测试剂盒使用。另外，为了进行重复性分析，将标准品模板连续稀释液通过三重荧光定量pcr扩增反应在不同日期的三台独立机器中进行重复性分析测试。结果表明：组内与组间重复性试验的变异系数(cv)的范围为0.05％至2.75％，表明三重荧光定量pcr体系具有良好的重复性。
[0048][0049]
8.三重荧光定量检测试剂盒的应用方法同步骤6，经过一系列体系内混合液的优化实验，最终确定扩增反应体系混合液具体由以下组分组成：10μl probe master mix(含有mg
2
离子、dntps混合物、热启动taq dna聚合酶等)，2μl模板dna，检测18s基因的上下游引物各0.8μl，探针0.4μl；检测非洲猪瘟病毒b646l基因的上下游引物各0.8μl，探针0.4μl；检测cox1基因的上下游引物各0.8μl，探针0.8μl，无核酶的水1.6μl。在2020年8月到11月期间，在浙江省杭州市与宁波市采集到蜱虫120只。每五只收集到一个1.5ml无菌离心管，洗净后根据基因组提取试剂盒说明书提取蜱虫基因组，共24份。按照优化实验得到的反应混合液用量进行荧光定量pcr反应。
[0050]
结果参见图5：与上述仪器自动生成的图4扩增曲线意义相同。绿色曲线代表检测蜱虫18s rrna基因目的片段的扩增曲线，ct值均为20左右。表明所有检测的样品都存在蜱虫基因组，阳性率为100.0％(24/24)，也证明了样品基因组dna提取成功。红色曲线代表猪cox1基因片段的检测结果，有两组检测样品产生的ct值为30左右，认为是阳性样品，其余组别为阴性。表明在24份蜱虫样品中，只有两份样品中存在着猪的基因组dna，检出阳性率为
8.3％(2/24)；蓝色曲线代表检测非洲猪瘟病毒基因组的荧光信号，未能检出非洲猪瘟病毒的基因组，阳性率为0％(0/24)。
[0051]
本发明是结合最佳实施例进行描述的，该三重荧光定量检测试剂盒确定也可以应用于检测临床猪血病料中的非洲猪瘟病毒。然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。