一种用于冠状病毒检测分型的多重RT-PCR试剂盒、方法及引物组与流程

一种用于冠状病毒检测分型的多重rt-pcr试剂盒、方法及引物组
技术领域
1.本发明涉及病毒核酸检测技术领域，具体涉及一种针对人呼吸道 样本进行七种人易感冠状病毒检测并分型的多重rt-pcr试剂盒及其 使用方法以及专用的引物组合。


背景技术：

2.冠状病毒属于巢状病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，因电镜下 病毒颗粒形式类似于王冠而得名，能感染从哺乳动物到禽类等一大批 脊椎动物，到目前为止共发现七种能够感染人体的冠状病毒，分别为 2019新型冠状病毒(sars-cov-2)、人冠状病毒229e(hcov-229e)、 人冠状病毒nl63(hcov-nl63)、人冠状病毒hku1(hcov-hku1)、 人冠状病毒oc43(hcov-oc43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒 (sars-cov)和中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)。在这七种 冠状病毒种，hcov-229e、hcov-nl63、hcov-hku1、hcov-oc43 呈全球性分布及在人群中普遍存在，通常引起呼吸道感染，特别是婴 幼儿，临床症状为发热，流涕，咳嗽等，严重者可能出现毛细支气管 肺炎，肺炎，喉炎等症状。sars-cov于2003年爆发，共造成全球 8422人感染，916人死亡，临床症状为严重的急性呼吸道感染导致呼 吸衰竭并最终导致死亡。mers-cov于2012年及2015年呈现地域 性流行趋势，在26个国家中共有1618人感染，579人死亡，临床症 状为重症呼吸道感染导致的肾功能衰竭而死亡。截止2020年3月， sars-cov-2在全球范围内已有10余万人感染，其中死亡4000多人， 主要临床表现为发热、乏力、干咳、呼吸困难等，部分患者病症轻微， 可无发热，但也出现少量重症患者，其表现为急性呼吸窘迫综合征、 脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒及出凝血功能障碍等。
3.由于针对不同冠状病毒感染患者的诊疗方式存在本质区别，使得 冠状病毒分型具有潜在临床价值，特别是在sars-cov-2爆发期间， 通过冠状病毒分型检测将不同感染源的患者进行分流，集中医疗资源 对sars-cov-2感染者进行针对性治疗，有助于提升治愈率，同时阻 止疫情蔓延。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是克服背景技术的技术缺陷，提供一 种用于冠状病毒检测分型的多重rt-pcr试剂盒及其使用方法以及专 用的引物组合，该试剂盒采用单管多重rt-pcr同时检测 sars-cov-2s基因和orf1ab基因、hcov-nl63 orf1ab基因、 sars-cov orf1ab基因、hcov-hku1 orf1ab基因、hcov-229e orf1ab基因、mers-cov orf1ab基因、hcov-oc43 orf1ab基因 和人内参b2m基因，区分呼吸道样本中不同型别的冠状病毒。本发 明的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好， 能通过对人内参b2m基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量 监控，并利用dutp-ung酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的 假阳性结果出现。
5.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
6.本发明所提供的一种用于冠状病毒分型的多重rt-pcr检测试剂 盒包含rt-pcr反
应液、引物组、rt-pcr酶液、阳性对照以及阴性 对照。其中rt-pcr反应液包括多重rt-pcr反应所需的dntps、 dutp、mg
2
、缓冲液(表1)。
7.表1 rt-pcr反应液试剂组成(50人份)
[0008][0009][0010]
其中引物组包含用于扩增sars-cov-2s基因和orf1ab基因、 hcov-nl63 orflab基因、sars-cov orflab基因、hcov-hku1 orf1ab基因、hcov-229e orf1ab基因、mers-cov orf1ab基因、 hcov-oc43 orf1ab基因和人内参b2m基因的引物，引物序列信息 如表2所示，引物组组成如表3所示。由上述正反向引物和衍生序列 也属于本发明内容，所述衍生序列是指在seq id no：1～18的基础上， 在序列的5’端或3’端添加或减少一个或多个碱基得到的序列。
[0011]
表2 用于冠状病毒分型的引物序列
[0012]
[0013][0014]
表3 引物组组成(50人份)
[0015]
[0016][0017]
所述引物组中，用于扩增sars-cov-2s基因的正向引物，如seq id no：1所示的5’端添加荧光报告基团fam；用于扩增sars-cov-2 orf1ab基因的正向引物，如seq id no：3所示的5’端添加荧光报告 基团fam；用于扩增hcov-nl63 orf1ab基因的正向引物，如seq id no：5所示的5’端添加荧光报告基团fam；用于扩增sars-cov orf1ab基因的正向引物，如seq id no：7所示的5’端添加荧光报告 基团fam；用于扩增hcov-hku1 orf1ab基因的正向引物，如seq id no：9所示的5’端添加荧光报告基团fam；用于扩增hcov-229e orf1ab基因的正向引物，如seq id no：11所示的5’端添加荧光报 告基团fam；用于扩增mers-cov orf1ab基因的正向引物，如seq id no：13所示的5’端添加荧光报告基团fam；用于扩增hcov-oc43 orf1ab基因的正向引物，如seq id no：15所示的5’端添加荧光报 告基团fam；用于检测人内参b2m基因的正向引物，如seq id no：17所示的5’端添加荧光报告基团fam。
[0018]
其中rt-pcr酶液中包含逆转录酶、热启动dna聚合酶和ung 酶，其组分配比详见表4。
[0019]
表4 rt-pcr酶液各组分配比(50人份)
[0020][0021]
其中阳性对照为包含sars-cov-2s基因和orf1ab基因、 hcov-nl63 orf1ab基因、sars-cov orf1ab基因、hcov-hku1 orf1ab基因、hcov-229e orf1ab基因、mers-cov orf1ab基因、 hcov-oc43 orf1ab基因和人内参b2m基因序列的重组质粒；所述 冠状病毒分型检测阴性对照为rnase-free h2o。
[0022]
进一步地，所述试剂盒的检测方法为通过对人呼吸道样本进行采 集和rna提取，配制扩增反应体系后进行多重反转录pcr扩增，并 对获得的扩增产物进行毛细管电泳，根据毛细管电泳图谱进行冠状病 毒分型判断；具体使用方法包括以下步骤：
[0023]
(1)采用核酸自动提取仪对采集的呼吸道样本进行rna提取；
[0024]
(2)根据表5在8联管中配制rt-pcr反应体系；
[0025]
表5 rt-pcr反应体系(单次反应)
[0026][0027][0028]
(3)将配制好的体系振荡、混匀、离心后置于pcr仪上，按照 表6程序进行rt-pcr扩增；
[0029]
表6 rt-pcr扩增程序
[0030][0031]
(4)准备电泳样品，每个电泳孔分别加入hi-di 8.7μl，size-500 0.3μl，rt-pcr产物1μl，混匀后离心备用；
[0032]
(5)毛细管电泳分离样品，将样品板置于3500dx基因分析仪 中，选择“fragment”电泳方法，进行电泳，具体操作方法详见3500dx 操作说明书；
[0033]
(6)结果分析。当特征靶点的峰高大于等于500rfu，判定为 阳性结果，并判断冠状病毒型别；当特征靶点的峰高小于等于300 rfu，判定为阴性结果；当特征靶点的峰高大于300rfu并小于500 rfu时，判定为灰区，需重新取样并再次检测，若结果为阳性或灰 区，则判定为阳性结果，并判断冠状病毒型别，否则判定为阴性结果。
[0034]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0035]
本发明公开了一种用于冠状病毒分型的多重rt-pcr试剂盒及其 使用方法以及专用的引物组合，该试剂盒采用单管多重rt-pcr同时 检测sars-cov-2s基因和orf1ab基因、hcov-nl63 orf1ab基因、 sars-cov orf1ab基因、hcov-hku1 orf1ab基因、hcov-229e orf1ab基因、mers-cov orf1ab基因、hcov-oc43 orf1ab基因 和人内参b2m基因，区分呼吸道样本中不同型别的冠状病毒。本发 明的冠状病毒分型检测试剂盒检测周期短、灵敏度高、分型效果好， 能通过对人内参b2m基因的监测实现对样本提取和扩增过程的质量 监控，并利用dutp-ung酶防污染体系降低由气溶胶污染而导致的 假阳性结果出现。
附图说明
[0036]
图1为冠状病毒分型检测试剂盒阳性对照检测结果。
[0037]
图2为冠状病毒分型检测试剂盒阳性样本a检测结果。
[0038]
图3为冠状病毒分型检测试剂盒阳性样本b检测结果。
[0039]
图4为冠状病毒分型检测试剂盒阳性样本c检测结果。
电泳方法，进行电泳，具体操作方法详见3500dx操作 说明书；
[0061]
(5)毛细管电泳结果如图1所示，冠状病毒分型检测试剂盒对阳 性对照扩增良好，扩增产物长度与预期长度一致，各个产物和引物间 无明显干扰。
[0062]
实施例2
[0063]
本实施例应用冠状病毒分型检测试剂盒检测呼吸道阳性样本，包 括如下步骤：
[0064]
(1)收集临床呼吸道阳性样本，具体样本信息详见表7；
[0065]
表7 呼吸道阳性样本信息
[0066]
样本编号冠状病毒感染型别确诊方法asars-cov-2qpcrbhcov-oc43测序chcov-nl63测序dhcov-229e测序ehcov-hku1测序
[0067]
(2)使用核酸提取试剂在全自动核酸提取仪上同时对呼吸道样 本a/b/c/d/e进行rna提取，将完成提取的核酸样本置于-20℃保存；
[0068]
(3)根据表5配制rt-pcr反应体系，配制完成后将反应管瞬时 离心10s，并竖直置于冰上；
[0069]
(4)将反应管置于pcr仪，根据表6设定程序并开始rt-pcr反 应；
[0070]
(5)准备电泳样品，每个电泳孔分别加入hi-di 8.7μl，size-500 0.3μl，pcr产物1μl，混匀后离心备用；
[0071]
(6)毛细管电泳分离样品，将样品板置于3500dx基因分析仪中， 选择“fragment”电泳方法，进行电泳，具体操作方法详见3500dx操作 说明书；
[0072]
(7)结果分析。冠状病毒分型检测试剂盒对样本a的检测结果 (图2)表明，感染样本a的冠状病毒型别为sars-cov-2，与qpcr 检测结果一致；样本b的检测结果(图3)表明，感染样本b的冠状病 毒型别为hcov-oc43，与测序结果一致；样本c的检测结果(图4) 表明，感染样本c的冠状病毒型别为hcov-nl63，与测序结果一致； 样本d的检测结果(图5)表明，感染样本d的冠状病毒型别为 hcov-229e，与测序结果一致；样本e的检测结果(图6)表明，感染 样本e的冠状病毒型别为hcov-hku1，与测序结果一致。上述结果表 明，冠状病毒分型检测试剂盒对临床样本同样具有非常好的分型效 果，能够针对呼吸道样本区分冠状病毒型别。
[0073]
实施例3
[0074]
本实施例应用冠状病毒分型检测试剂盒检测其他常见呼吸道病 毒感染样本，包括如下步骤：
[0075]
(1)收集临床呼吸道阳性样本，具体样本信息详见表8；
[0076]
表8 其他常见呼吸道病原体感染样本信息
[0077][0078][0079]
(2)使用核酸提取试剂在全自动核酸提取仪上同时对呼吸道样 本f/g/h/i/j/k/l/m/n/o/p进行rna提取，将完成提取的核酸样本置于
ꢀ-
20℃保存；
[0080]
(3)根据表5配制rt-pcr反应体系，配制完成后将反应管瞬时 离心10s，并竖直置于冰上；
[0081]
(4)将反应管置于pcr仪，根据表6设定程序并开始rt-pcr反 应；
[0082]
(5)准备电泳样品，每个电泳孔分别加入hi-di 8.7μl，size-500 0.3μl，pcr产物1μl，混匀后离心备用；
[0083]
(6)毛细管电泳分离样品，将样品板置于3500dx基因分析仪中， 选择“fragment”电泳方法，进行电泳，具体操作方法详见3500dx操作 说明书；
[0084]
(7)结果分析。如图7～图17所示，冠状病毒分型检测试剂盒对 其他常见呼吸道病毒具有较好的特异性，在rt-pcr过程中不会因为 非特异性扩增而造成假阳性结果的出现。
[0085]
上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本 技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、 添加或替换，也应属于本发明的保护范围。