一种动物源性成分检测方法及其应用与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种动物源性成分检测方法及其应用。


背景技术：

2.食品安全关系着人们身体健康，关系着人民幸福感的提高。当前，食源性病原菌污染、农药及兽药残留等是食品安全中人们最普遍关注的问题。而随着人们生活水平的日益提高，未来的食品安全问题更多地表现为对食品的质量、品质、营养性等的监控。其中，对食品物种的鉴定是关系食品安全、质量、品质和营养性等各方面控制的重要科学问题。
3.随着经济的发展和生活水平的提高，人们对肉类的需求日益增加，品种选择越来越丰富。然而，近年来国内外肉类掺假事件频发，巨大的价格差异驱动着一些不法经营者以低价肉替代高价肉而未在标签上注明来降低成本。从近年来屡次曝光的羊肉掺假，到2013年欧洲的“马肉丑闻”，再到2014年国内沃尔玛的“驴肉掺假门”，各种肉类掺假的事件层出不穷。这不仅严重侵害了消费者利益，而且更严重的是造成恶劣的社会影响，对整个肉类产业也会造成巨大伤害。同时，严重的国际肉类食品掺假情况给我国带来了极大的安全隐患。在西方，一项对近千种肉制品的检测分析表明，有近20%的产品存在标识与品种不完全相符的现象，肉制品质量安全已成为全社会共同关注的热点话题。现今，我国对这些“掺假肉”的制作加工没有任何标准可循。
4.一直以来，国内外众多学者也对动物源性成分的检测技术进行了大量的研究，现阶段可用于肉类食品成分鉴定的基因通常位于线粒体(mtdna)上，包括细胞色素b(cytb)基因、细胞色素c氧化酶亚基i(coi)基因、12srdna、16srdna、d
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loop基因等。目前，国内外用于肉制品的掺假、掺杂检验以pcr
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rflp、多重pcr、实时定量pcr等方法为主。但是，这些技术一般每次仅能检测一种或两种指标，无法全面分析检测食品中所涉及的多种动物源性成分，当遇到几个不同品种的混合样品时，要确定每个品种在混合物中的相对量需要找到品种中唯一的已知目标序列作为参考序列，而且要获得精确的测定结果非常困难，难以满足高效快速、批量大、大规模、操作简单等检测需求。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供的一种动物源性成分检测方法及其应用，该方法能同时进行96个混合样品的成分及组分分析，灵敏度高、检测时间短，能够解决同时测定几个不同品种的混合样品的难题，实现对未知动物源性成分的快速鉴定和掺假、掺杂的精确测定。
6.为达到上述目的，本发明采用如下的技术方案：一种动物源性成分检测方法，包括以下步骤：（1）构建数据库；（2）样品dna提取；（3）cytb基因序列扩增；
（4）miseq测序及测序分析；所述步骤（1）构建数据库的方法如下：a1. 收集物种完整的cytb基因fasta序列；b1. 将这些序列及对应的taxonomy信息整合成fasta格式的文件，然后转换成数据库dat格式；c1. 在miseq reporter metagenomics中设置并导入数据库；所述数据库包含186个属，476个种的动物cytb基因序列信息；所述步骤（3）cytb基因序列扩增方法如下：a2. 设计引物cytb
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f和cytb
‑
r扩增各样品的短片段序列；其中，引物cytb
‑
f: 5
’‑
ccatccaacatctcagcatgatgaaa
‑3’
引物cytb
‑
r: 5
’‑
gcccctcagaatgatatttgtcctca
‑3’
b2. pcr反应体系为20μl，其中premix taq 12.5μl、正反向引物10μm各0.5μl、模板dna 1μl、超纯水5.5μl，pcr反应程序先后采用降落pcr{95℃，3min；3循环（95℃，30s；62℃，30s；72℃，10s）；3循环（95℃，30s；60℃，30s；72℃，10s）；3循环（95℃，30s；58℃，30s；72℃，10s）；26循环（95℃，30s；55℃，30s；72℃，10s）；3循环（95℃，30 s；53℃，30s；72℃，10s）72℃，7min}，得到pcr产物；c2. 将得到的pcr产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，目的片段大小为100~350bp，用ampure xp beads纯化各样品pcr产物。
7.进一步的，所述步骤（2）样品dna提取的方法为：将肉类样品匀浆粉碎，称取1mg样品用基因组dna提取试剂盒提取样品总dna。
8.进一步的，所述步骤（4）miseq测序及测序分析步骤为：a3. 在扩增引物的5’端加入接头和测序用引物序列，再通过有限循环pcr加入illumina测序接头和标签序列以区分不同样品；b3. 用nextera xt index kit进行pcr扩增加入测序标记，pcr反应体系为50μl，包括premix taq 25μl、nextera xt index正反向引物各5μl，模板dna5μl、超纯水10μl，pcr 反应条件为95℃3min；8循环（95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s）；72℃5min，得到样品pcr产物；c3. 用ampure xp beads纯化各样品pcr产物，通过qubit
® fluorometer对pcr产物定量分析，并统一稀释成4nm，将各样品以及phix control一同构成测序样品文库，变性处理后，采用miseq reagent kit v2 (500
‑
cycles)试剂盒上机测序；d3. 测序结束后，通过miseq reporter metagenomics分析得到样品成分及组分结果。
9.进一步的，所述的引物cytb
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f和引物cytb
‑
r的序列如seq id no:1和seq id no:2所示。
10.本发明的另一目的在于提供所述的动物源性成分检测方法在肉制品掺假、掺杂检验中的应用。
11.相对于现有技术，本发明一种动物源性成分检测方法及其应用具有以下优势：（1）本发明提供的一种动物源性成分检测方法，该检测方法对提取的样品dna直接进行高通量测序分析，保证了足够的数据量，设计通用引物能同时确定掺有几个不同品种
的肉制品，并能确定每个品种在肉制品中的相对含量，实现未知动物源性成分的快速鉴定和掺假、掺杂的精确测定。
12.（2）本发明一种动物源性成分检测方法，构建的数据库包含了市场上常见的禽畜肉类，数据库安装在与测序仪相连的计算机工作站上，仪器测序结束后可直接进行数据分析和比对，提高了信息获取的速度，节省了时间和人力成本。本发明提供的动物源性成分检测方法能够满足高效快速、批量大、大规模、操作简单、检测时间短等检测需求。
13.（3）本发明一种动物源性成分检测方法，该方法能同时进行96个混合样品的成分及组分分析，灵敏度高、操作简单、检测时间短，检测限为0.01%和0.1μg。
14.（4）本发明一种动物源性成分检测方法可以解决肉制品中不可预见动物源性成分难以同时鉴定的技术难题，从源头上杜绝肉制品掺假掺杂行为，从根本上解决肉制品食用安全问题。
15.附图说明
16.图1为本发明实施例2中所述的各物种cytb基因扩增结果图；图中：m
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dl2,000 dna marker(takara，3427q)； 1
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驴； 2
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牛； 3
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鸭子； 4
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鸽子； 5
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火鸡；6
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鹧鸪；7
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猪； 8
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鸡；9
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羊； 10
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水； 11
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空白；12
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dl500 dna marker；图2 为miseq reporter metagenomics的鸡肉测序结果分析图。
具体实施方式
17.下面结合实施例及附图来详细说明本发明。
18.实施例11、数据库的构建收集物种完整的cytb基因fasta序列，将这些序列及对应的taxonomy信息整合成fasta格式的文件，然后转换成数据库dat格式，在miseq reporter metagenomics中设置并导入数据库，建立市场上常见禽畜肉分类数据库，用于高通量测序结果的比对分析，所述数据库包含186个属，476个种的动物cytb基因序列信息，部分数据库信息见表1。
19.2、样品dna提取：将肉类样品匀浆粉碎，称取1mg样品用基因组dna提取试剂盒提取样品总dna。
20.3、cytb基因序列扩增：a2. 设计引物cytb
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f和cytb
‑
r扩增各样品的短片段序列，引物cytb
‑
f: 5
’‑
ccatccaacatctcagcatgatgaaa
‑3’ꢀ
（seq id no:1）引物cytb
‑
r: 5
’‑
gcccctcagaatgatatttgtcctca
‑3’ꢀ
（seq id no:2）。
21.b2. pcr反应体系为20μl，其中premix taq 12.5μl、正反向引物(10μm)各0.5μl、模板dna 1μl、超纯水5.5μl，pcr反应程序先后采用降落pcr{95℃，3min；3循环（95℃，30s；62℃，30s；72℃，10s）；3循环（95℃，30s；60℃，30s；72℃，10s）；3循环（95℃，30s；58℃，30s；
72℃，10s）；26循环（95℃，30s；55℃，30s；72℃，10s）；3循环（95℃，30 s；53℃，30s；72℃，10s）72℃，7min}，得到pcr产物；c2. 将得到的pcr产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，目的片段大小为100～350bp，用ampure xp beads纯化各样品pcr产物。
22.4、miseq测序步骤为：a3. 在扩增引物的5’端加入接头和测序用引物序列，再通过有限循环pcr加入illumina测序接头和标签序列以区分不同样品；b3. 用nextera xt index kit进行pcr扩增加入测序标记，pcr反应体系为50μl，包括premix taq 25μl、nextera xt index正反向引物各5μl，模板dna5μl、超纯水10μl，pcr 反应条件为95℃3min；8循环（95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s）；72℃5min，得到样品pcr产物；c3. 用ampure xp beads纯化各样品pcr产物，通过qubit
® fluorometer对pcr产物定量分析，并统一稀释成4nm，将各样品以及phix control一同构成测序样品文库，变性处理后，采用miseq reagent kit v2 (500
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cycles)试剂盒上机测序，通过miseq reporter metagenomics分析样品成分及组分。
23.5、样品检测从市场中购买火腿肠、牛肉片等，通过荧光定量pcr和高通量测序进行成分检测。两种方法的检测结果一致，部分样品中检出未标示的成分，且含量较高，见表2。
24.实施例2方法确认1、 特异性分别称取单一样品猫肉、猪肉、牛肉、鼠肉、鸡肉、鹅肉、火鸡肉、羊肉、水牛肉、鸭肉、兔肉、鹌鹑肉、狗肉、驴肉和鸽子肉各1mg，自制混合样品ha（牛：狗：鹅=1：1：1）、hc（牛：狗：鹅=1：1：98）、he（牛：羊=1：1）和hg（牛：羊=3：1）各1mg，提取样品dna，扩增cytb基因短片段序列，进行1%的琼脂糖凝胶电泳，得到pcr产物片段大小为350bp，见图1。通过illumina miseq测序，miseq reporter metagenomics分析得到，各样品成分和组分与实际样本基本一致，见表3。
[0025] 2灵敏度将牛肉和羊肉按照99：1制成混合样品hf，然后进行10倍递增稀释制成混合样品hk（999：1）和hj（9999：1），分别称取1mg，提取样品dna，扩增cytb基因短片段序列，进行高通量测序分析，结果与实际样本基本一致，见表2，说明该方法对样品的检测限可达到混合比例0.01%及起始质量0.1μg。
[0026]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。