一种表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法与流程

1.本发明属于细胞工程技术领域，具体地说，涉及一种表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法。


背景技术：

2.人类对表皮干细胞的研究，已有几十年历史，但由于其难以诱导分化一直被认为是单能干细胞，即仅能分化成为表皮的相关成分。再生医学在医学领域中炙手可热，干细胞的研究在再生医学领域中已占据了重要的地位，干细胞由于其具有多分化潜能，在特定的条件下可以分化为各种组织器官的能力得到科学家们的关注。胚胎干细胞是一种全能干细胞，其能分化为除胎盘外的所有组织和器官。但由于胚胎干细胞的研究涉及伦理学的诸多问题，所以本领域技术人员一直致力于寻找另外一种全能干细胞来替代胚胎干细胞。
3.人们把目标逐渐锁定在成体干细胞上。目前，本领域技术人员已经成功的将msc(间充质干细胞)，adsc(脂肪干细胞)等成体干细胞诱导分化为其他类型的细胞，如软骨细胞、骨细胞、心肌细胞等。msc最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。表皮干细胞又称专一性干细胞或单能细胞，是指只能产生一种细胞类型，但具有自我更新属性的细胞。本领域技术人员一直将表皮干细胞归为单能细胞。对于表皮干细胞的应用范围也受单能细胞的影响而受限。


技术实现要素：

4.、要解决的问题针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，工艺简单，可以有效实现两种细胞间的细胞分化。
5.、技术方案为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
6.一种表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
7.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
8.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：
ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀ
10份
‑
20份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1份
‑
3份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5份
‑
0.8份；其中培养温度为37℃、培养时间为7d、二氧化碳浓度为5%。
9.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
12份
‑
16份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1份
‑
3份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5份
‑
0.8份。
10.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.7份。
11.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10份
‑
20份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1份
‑
3份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5份
‑
0.8份；其中培养温度为37℃、培养时间为7d、二氧化碳浓度为5%。
12.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
12份
‑
18份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1份
‑
3份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5份
‑
0.8份。
13.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6份。
14.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
15.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，
igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
16.、有益效果相比于现有技术，本发明的有益效果为：本发明基于表皮干细胞与肝脏细胞的共培养体系，利用共培养体系巧妙地使表皮干细胞与肝脏细胞分工合作，采用诱导液把转化生长因子igf
‑
1和igf
‑
2导入表皮干细胞，经转染的表皮干细胞向肝脏细胞提供持续的、局部的和过表达的β
‑
磷酸甘油钠，刺激表皮干细胞定向肝脏细胞分化，使转化生长因子不需要外源添加，由转染后的肝脏细胞提供，从而防止生长因子被蛋白酶分解，并避免基因转染过程中对表皮干细胞可能产生的伤害，保持表皮干细胞更高的存活率与更好的分化的能力。
具体实施方式
17.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
18.实施例1本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
19.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
20.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5份；其中培养温度为37℃、培养时间为7d、二氧化碳浓度为5%。
21.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5份；其中培养温度为37℃、培养时间为7d、二氧化碳浓度为5%。
22.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
23.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：
维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
24.实施例2本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
25.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
26.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀ
20份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.8份；其中培养温度为37℃、培养时间为7d、二氧化碳浓度为5%。
27.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.8份；其中培养温度为37℃、培养时间为7d、二氧化碳浓度为5%。
28.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
29.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
30.实施例3本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：
（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
31.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
32.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀ
12份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5份。
33.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
12份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
3份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5份。
34.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
35.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
36.实施例4本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
37.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
38.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，
步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
16份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.8份。
39.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
18份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.8份。
40.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
41.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
42.实施例5本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
43.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
44.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.7份。
45.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6份。
46.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
47.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
48.对比例1本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
49.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
50.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份。
51.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6份。
52.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
53.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
54.对比例2本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
55.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
56.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.7份。
57.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份。
58.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
59.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
60.对比例3本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
61.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
62.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀ
14份。
63.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6份。
64.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
65.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
66.对比例4本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
67.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
68.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.7份。
69.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀ
15份。
70.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
71.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，
步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
72.对比例5本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
73.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
74.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.7份。
75.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6份。
76.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
77.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
78.对比例6本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖
的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
79.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
80.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.7份。
81.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6份。
82.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
83.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
84.对比例7本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
85.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
86.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14份，
氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.7份。
87.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6份。
88.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
89.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，β
‑
磷酸甘油钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15mol/l，igf
‑2ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
20μg/l。
90.对比例8本实施例的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法，包括以下步骤：（1）表皮干细胞的预处理：将表皮干细胞转移到细胞培养液中进行培养，得到繁殖的表皮干细胞；（2）表皮干细胞的分离处理：将步骤（1）中繁殖的表皮细胞进行二次培养，待表皮干细胞长至融合度为70%，以1：3进行传代，传至3代后，进行冷冻贮存；（3）表皮干细胞的分化处理：将步骤（2）中冷冻的表皮干细胞与肝脏细胞进行混合，并配置成细胞悬液，随后置于诱导液中，直至完成分化过程。
91.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中培养后表皮干细胞的密度为1x105个/ml。
92.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（1）中细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
14份，氯化钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，醋酸钾
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.7份。
93.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（2）中二次培养的细胞培养液的组分如下：ham's f
‑
10培养基
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
15份，海藻酸钠
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2份，氯化钙
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.6份。
94.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中表皮干细胞与肝脏细胞之间的数量比为1：0.5。
95.上述所述的表皮干细胞向肝脏细胞分化的改进方法中，步骤（3）中细胞悬液的密度为1x106个/ml；
步骤（3）中诱导液的组分如下：维生素c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
60μg/l，fbs
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10%体积分数，igf
‑1ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
25μg/l。
96.实施例6选择实施例1
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5制备的产品及对比例1
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8制备的产品，进行如下的试验：参考中国发明专利，申请号：cn201910859880.0，公开号：cn110684725a，公开了一种诱导干细胞定向软骨分化的方法。
97.其中实施例1制备的产品的转化率为65.4%；其中实施例2制备的产品的转化率为66.7%；其中实施例3制备的产品的转化率为66.1%；其中实施例4制备的产品的转化率为68.4%；其中实施例5制备的产品的转化率为70.2%；其中对比例1制备的产品的转化率为63.0%；其中对比例2制备的产品的转化率为60.5%；其中对比例3制备的产品的转化率为52.4%；其中对比例4制备的产品的转化率为58.2%；其中对比例5制备的产品的转化率为36.1%；其中对比例6制备的产品的转化率为20.5%；其中对比例7制备的产品的转化率为24.2%；其中对比例8制备的产品的转化率为11.8%。
98.以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。