表达CAR和shRNA的逆转录病毒载体及其应用的制作方法

表达car和shrna的逆转录病毒载体及其应用
技术领域
1.本发明涉及肿瘤治疗技术领域，特别涉及一种表达的嵌合抗原受体(car)和shrna逆转录病毒载体及其应用。


背景技术：

2.短发夹rna(short hairpin rna，shrna)属于rna干扰(rna interference，rnai)范畴，转导或转染细胞后，在细胞核中合成前体shrna，其正义链和反义链通过碱基配对形成茎区，中间未配对的核苷酸形成环状，整个结构成发夹结构。经过核糖核酸酶iiidrosha及dgcr8加工后，被exportin
‑
5蛋白转运到细胞质中，然后经核糖核酸酶iiidicer及trbp/pact酶切，去除环状结构的序列，形成sirna。sirna与risc识别并整合后，发生解旋并去掉双链中一条rna链，然后通过碱基互补序列识别和占据靶mrna，导致其降解。shrna可以通过转导的方式稳定表达，特异性靶向抑制目标mrna的表达，在治疗、诊断及科学研究中具有广泛的应用。目前已有通过慢病毒载体转导的方式，将特异性靶向免疫检查点受体的shrna与car
‑
t细胞共表达来抑制免疫检查点受体的表达，抑制肿瘤微环境，从而调节免疫反应。
3.lsd1是一种依赖于黄素的单胺氧化酶，也是第一个被发现的组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶，在黄嘌呤
‑
腺嘌呤二核苷酸存在的条件下参与单甲基化或二甲基化的h3k4或h3k9的去甲基化，从表观遗传修饰方面调控不同环境下基因转录的激活或抑制，参与不同的生理过程，包括造血、脂肪的生成、发育过程等，在肿瘤的发生中也起重要作用，lsd1抑制剂是一种潜在的抗肿瘤免疫抑制剂。抑制lsd1可刺激提高肿瘤的免疫原性，刺激干扰素依赖的抗肿瘤免疫力，促进t细胞浸润。目前已经有许多lsd1抑制剂正在进行癌症治疗的临床评估。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，本发明提供构建一种新的shrna与car共表达于car
‑
t细胞的联合治疗方法。
5.在一种实施方式中，提供一种表达car和shrna的逆转录病毒载体，该病毒载体中靶向lsd1的shrna与car共表达。
6.在一种实施方式中，该病毒载体中u6启动子和ef1α启动子分别整合到car表达载体中，代替长末端重复序列来驱动表达，由u6启动子驱动lsd1 shrna的表达ef1α启动子驱动抗car的表达，所述抗car优选是抗cd19 car和/或cd38 car。
7.在一种实施方式中，所述逆转录病毒载体中包括依次串联的u6启动子、lsd1 shrna、ef1α启动子、上游的信号肽和用于检测的myc标签；cd19 car抗原结合区域；cd8铰链
‑
跨膜结构域；cd28或4
‑
1bb协同激活结构域和cd3ζ胞内信号传导结构域。
8.在一种实施方式中，靶向lsd1的shrna的克隆id是trcn0000046068，克隆名称是nm_015013.1
‑
1812s1c1，序列是seq id no:2:gcctagacattaaactgaata。
9.在一种实施方式中，靶向lsd1的shrna的克隆id是trcn0000046069，克隆名称是
nm_015013.1
‑
2168s1c1，序列是seq id no:3:gctccaatactgttggcacta。
10.在一种实施方式中，提供一种靶向嵌合抗原受体t细胞，其包括由上述逆转录病毒载体表达的靶向嵌合抗原受体。
11.在一种实施方式中，提供一种治疗肿瘤的药物，其含有上述的嵌合抗原受体t细胞。
12.在一种实施方式中，所述肿瘤是多发性骨髓瘤。
13.在一种实施方式中，提供上述逆转录病毒载体的应用，将编码所述嵌合抗原受体的基因片段插入所述载体中，包装成病毒载体颗粒，感染人t细胞，制备得到嵌合抗原受体t细胞，用于表面cd19阳性和/或cd38阳性的肿瘤治疗。
14.在本发明中采用基因工程手段构建mfg(逆转录病毒载体质粒)
‑
lsd1 shrna
‑
anti
‑
cd19 car逆转录病毒载体质粒，将u6启动子、lsd1 shrna和ef1α启动子整合到表达car的逆转录病毒载体中，由u6启动子驱动lsd1 shrna的表达，ef1α启动子驱动anti
‑
cd19 car的表达。进行逆转录病毒载体包装，获得较高滴度的两种lsd1 shrna anti
‑
cd19 car逆转录病毒载体，转导人原代t细胞，流式细胞术检测转导效率均达50％以上，成功构建lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞。qpcr检测lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞中lsd1表达水平明显降低，说明lsd1 shrna可以与car基因同时表达，且同时表达lsd1 shrna没有影响anti
‑
cd19 car的表达。
15.lsd1 shrna增强anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体外抗肿瘤功能。通过流式细胞术凋亡检测、萤光素酶检测、rtca检测证明lsd1 shrna能增强anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体外杀伤肿瘤细胞功能；通过压力测试实验证明lsd1 shrna能促进anti
‑
cd19 car
‑
t细胞在反复抗原刺激下的长期抗肿瘤功能；通过elisa检测细胞因子实验，证明lsd1 shrna能促进anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤肿瘤细胞时ifn
‑
γ、tnf
‑
α、il
‑
2的释放水平，促进anti
‑
cd19 car
‑
t细胞抗肿瘤功能；通过细胞计数计算细胞增殖倍数及cfse增殖检测证明lsd1 shrna能增强anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体外增殖能力。
16.lsd1 shrna增强anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体内抗肿瘤功能。使用免疫缺陷的nod
‑
prkdc
scid il2rg
null npg小鼠构建raji
‑
luc细胞肿瘤动物模型，lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗后，通过小动物活体成像、体重监测、外周血t细胞流式细胞术检测等方法，证明lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞在体内显示出良好的抗肿瘤功能，使肿瘤完全清除，并明显延长肿瘤模型小鼠的生存期，虽然lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组与rnau6 anti
‑
car
‑
t细胞治疗组在小动物活体成像肿瘤生物发光信号和存活率上没有明显差异，但在第二次注射car
‑
t细胞7天后对小鼠血清ifn
‑
γ的elisa检测发现lsd1 shrna共表达的anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组小鼠血清ifn
‑
γ水平显著增加，lsd1 shrna增强car
‑
t细胞体内抗肿瘤功能。在第52天研究终止时，流式细胞术检测到lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组小鼠外周血中t细胞数量明显高于对照组，说明lsd1 shrna促进了car
‑
t细胞体内增殖能力。因此，lsd1 shrna过表达促进anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体内抗肿瘤活性及增殖能力。
17.在本发明中将lsd1 shrna与anti
‑
cd19 car共表达于car
‑
t细胞，实现lsd1 shrna对car
‑
t细胞功能的同步调节，构建联合治疗方法。并对lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞进行体内、外功能验证，证明lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞在体内、外均具有较好的细
胞活性、增殖能力与抗肿瘤能力。
附图说明
18.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
19.图1是不同car表达载体示意图，其中图1a是未改造的抗cd19car表达载体示意图，图1b是改造的对照u6抗cd19car表达载体示意图，图1c是u6
‑
lsd1shrna
‑
抗cd19car表达载体示意图；
20.图2是逆转录病毒载体表达质粒转染phoenix
‑
eco细胞效率检测结果图，其中图2a是pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑1‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car，图2b是pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑2‑
ef1 α
‑
anti
‑
cd19 car；
21.图3是亲嗜性逆转录病毒载体转导pg13细胞效率检测结果图，其中图3a是lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car；图3b是lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car；
22.图4是lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞中lsd1表达水平检测(n＝3)结果图，其中图4a是lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞lsd1表达水平检测；图4b是lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞lsd1表达水平检测，与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞比较，*p<0.05，**p<0.01；
23.图5是lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体外杀伤raji细胞效率检测(n＝3)结果图，与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞比较，*p<0.05；
24.图6是体外重复抗原刺激后car
‑
t细胞杀伤的压力测试检测结果图，其中6a：第一个共培养周期后细胞杀伤效率检测；6b：第二个共培养周期后细胞杀伤效率检测；6c：第三个共培养周期后细胞杀伤效率检测；与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞比较，*p<0.05，**p<0.01；
25.图7是lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤raji
‑
luc细胞效率检测结果图，与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞比较，*p<0.05；
26.图8是lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤sw620细胞效率检测(n＝3)结果图，其中图8a是sw620细胞指数变化；图8b是实验终止时间截点的sw620细胞指数，
27.(与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞比较，***p<0.001)；
28.图9是lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞细胞因子释放水平检测(n＝3)结果图，其中9a是共培养细胞上清中ifn
‑
γ释放水平；9b是共培养细胞上清中tnf
‑
α释放水平；9c是共培养细胞上清中il
‑
2释放水平(与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞比较，*p<0.05，**p<0.01)；
29.图10是lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞增殖记录图，其中10a是细胞增殖曲线，10b是细胞存活率曲线；
30.图11是car
‑
t细胞中cd4 t细胞与cd8 t细胞检测结果图；
31.图12是小动物活体成像肿瘤生物发光信号强度监测(n＝6)结果图，12a是肿瘤面积变化，12b是肿瘤生物发光的整体信号强度；
32.图13是npg小鼠生存曲线(n＝6)；
33.图14是npg小鼠体重变化曲线(n＝6)；
34.图15血清ifn
‑
γ释放水平检测(n＝6)结果图，与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组比较，*p<0.05，**p<0.01。
具体实施方式
35.为了使本领域技术领域人员更好地理解本技术中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本技术保护的范围。
36.实施例一本发明的car结构与质粒图谱
37.本发明中将lsd1 shrna应用于car
‑
t细胞工程，构建一种新的联合治疗方法，将lsd1 shrna整合到表达car的逆转录病毒载体中，同时进行基因表达的调节。为了确保靶mrna的有效抑制，选择靶向lsd1 mrna不同序列靶点的两个shrna。为了使lsd1 shrna和car能够更好地表达，将u6启动子和ef1α启动子分别整合到car表达载体中，代替长末端重复序列(ltr)来驱动表达，由u6启动子驱动lsd1 shrna的表达，ef1α启动子驱动anti
‑
cd19 car的表达以延长car在t细胞中的表达，参见图1，其中图1a是未改造的抗cd19car表达载体示意图，图1b是改造的对照u6抗cd19car表达载体示意图，图1c是u6
‑
lsd1shrna
‑
抗cd19car表达载体示意图。图1中mmlv(truncated)是mmlv编码的逆转录病毒辅助dna。通过体内外功能检测评价lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞的抗肿瘤功能。为探索car
‑
t细胞活性改良、功能优化提供新的研究思路，为多发性骨髓瘤的治疗提供新的方法，也为其他血液系统肿瘤以及实体瘤car
‑
t细胞治疗奠定实验基础。抗cd19 car的scfv氨基酸序列：
38.diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvss(seq id no:1)
39.实施例二pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒的构建
40.1.lsd1 shrna碱基序列检索
41.根据数据库及文献检索，获得人lsd1 shrna靶序列，选取两个lsd1 shrna靶序列用于构建pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒，pmfg代表逆转录病毒载体质粒，见表1。参考网址：https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/trans/details？transname＝nm_015013.4。
42.表1 lsd1 shrna靶序列及引物
[0043][0044]
2.lsd1 shrna
‑
1片段制备
[0045]
设计引物，将lsd1 shrna
‑
1引物5’端引入限制性内切酶位点agei，3’端引入限制性内切酶位点ecori，合成相应的引物序列，引物合成工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。将lsd1 shrna
‑
1的上下游引物逐渐退火获得lsd1 shrna
‑
1片段，且lsd1 shrna
‑
1 dna末端为粘性末端。反应条件：95℃ 5min，92.5℃ 3min，90℃ 3min，87.5℃ 3min
……
依次递减2.5℃，至温度降至10℃。
[0046]
3u6
‑
lsd1 shrna
‑
2片段制备
[0047]
合成u6
‑
lsd1 shrna
‑
2序列，dna序列5’端引入限制性内切酶位点mlu i，3’端引入限制性内切酶位点pac i，整个dna序列克隆入puc57载体。
[0048]
4.pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒表达验证
[0049]
复苏hek
‑
293t细胞并接种于t75细胞培养瓶中，当细胞在t75培养瓶中汇合度达到约80％时，将hek
‑
293t细胞传代并接种到6孔细胞培养板中，每孔1
×
106个细胞，共接种3个孔。分别标记为pmfg
‑
u6
‑
rna
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car对照孔、pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑1‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car实验孔、pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑2‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car实验孔，放入37℃co2培养箱。待细胞汇合度达到约80％时，用转染试剂fugene hd将表达质粒转染hek
‑
293t细胞，放置于37℃ co2培养箱中孵育24h。
[0050]
24h后小心移除各组细胞培养板中的培养基上清，丢弃，每孔补加3ml新鲜的dmem完全培养基。24h后小心移除各组细胞培养板中的培养基上清，丢弃，用1
×
pbs洗细胞后，胰酶消化细胞，收集细胞于1.5ml ep管中，进行细胞计数。各组取1
×
106个细胞用于流式细胞术检测转染效率，取2
×
106个细胞用于细胞总rna提取，rt
‑
qpcr检测lsd1的表达水平。
[0051]
5.lsd1表达水平检测
[0052]
提取转染或转导后的细胞总rna，qpcr染料法检测lsd1表达水平，以gapdh基因为内参基因，引物序列见表2.12，jw389与jw390为lsd1基因目的片段扩增引物，见表2。数据处理用2
‑
δδct方法计算lsd1表达水平的倍数变化。
[0053]
表2 qpcr检测lsd1基因表达水平的引物序列
[0054][0055]
6.结果
[0056]
6.1pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑1‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒构建
[0057]
用限制性内切酶age i与ecor i双酶切pmd18s
‑
t
‑
u6
‑
rna质粒，将质粒中rna序列
替换为lsd1 shrna
‑
1序列，获得pmd18s
‑
t
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑
1质粒。然后用限制性内切酶pac i与mlu i
‑
hf双酶切pmd18s
‑
t
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑
1质粒，获得u6
‑
lsd1 shrna
‑
1片段。将u6
‑
lsd1 shrna
‑
1片段与pmfg
‑
u6
‑
rna
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒中的u6
‑
rna替换，获得pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑1‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒。
[0058]
6.1.1pmd18s
‑
t
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑
1质粒构建
[0059]
限制性内切酶age i与ecor i双酶切pmd18s
‑
t
‑
u6
‑
rna质粒，获得pmd18s
‑
t
‑
u6(age i/ecor i)载体。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并凝胶纯化及回收dna，目的载体大小约3kb。
[0060]
将lsd1 shrna
‑
1片段连接入pmd18s
‑
t
‑
u6(age i/ecor i)载体，获得pmd18s
‑
t
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑
1。连接、转化、质粒小量提取过程同前。选取酶切鉴定正确的质粒送测序，测序引物为通用引物m13
‑
for。测序结果显示，u6
‑
lsd1 shrna
‑
1碱基序列完全正确。
[0061]
6.1.2pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑1‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒构建
[0062]
用限制性内切酶pac i与mlu i
‑
hf分别双酶切pmd18s
‑
t
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑
1质粒与pmfg
‑
u6
‑
rna
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒，获得u6
‑
lsd1 shrna
‑
1片段，与pmfg
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car载体。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并凝胶纯化及回收dna，u6
‑
lsd1 shrna
‑
1目的片段大小337bp，pmfg
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car载体大小约9.2kb。
[0063]
将u6
‑
lsd1 shrna
‑
1目的片段连接进入pmfg
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car载体，获得pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑1‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car。连接、转化、质粒小量提取过程同前。选取酶切鉴定正确的质粒送测序，结果显示，质粒构建成功。
[0064]
7.pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑2‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒构建
[0065]
用限制性内切酶pac i与mlu i
‑
hf酶切puc57
‑
lsd1 shrna
‑
2质粒，获得u6
‑
lsd1 shrna
‑
2片段。将u6
‑
lsd1 shrna
‑
2片段与pmfg
‑
u6
‑
rna
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒中的u6
‑
rna替换，获得pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑2‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒。
[0066]
7.1u6
‑
lsd1 shrna
‑
2片段与pmfg
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car载体获得
[0067]
用限制性内切酶pac i与mlu i
‑
hf分别酶切puc57
‑
lsd1 shrna
‑
2质粒与pmfg
‑
u6
‑
rna
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒，获得u6
‑
lsd1 shrna
‑
2片段与pmfg
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car载体。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并凝胶纯化及回收dna，u6
‑
lsd1 shrna
‑
2目的片段大小324bp，pmfg
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car载体大小约9.2kb。
[0068]
7.2pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑2‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒构建与鉴定
[0069]
将u6
‑
lsd1 shrna
‑
2片段连接入pmfg
‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car载体，获得pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑2‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car。连接、转化、质粒小量提取过程同前。选取酶切鉴定正确的质粒送测序，结果显示，质粒构建成功。
[0070]
7.3pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑
anti
‑
cd19 car质粒表达检测
[0071]
pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑1‑
anti
‑
cd19 car与pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑2‑
anti
‑
cd19 car质粒转染hek
‑
293t细胞，48h后流式细胞术检测转染效率。结果显示：具有较高的转染效率。rt
‑
qpcr检测lsd1表达水平变化。结果显示：转染了mfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑1‑
anti
‑
cd19 car的hek
‑
293t细胞组lsd1表达水平(0.49
±
0.044:1)与转染了mfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑2‑
anti
‑
cd19 car的hek
‑
293t细胞组lsd1表达水平(0.79
±
0.003:1)均明显低于对照组，因此lsd1 shrna可以正常表达并发挥功能。因此，可以进行下一步逆转录病毒载体包装实验，构
建lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞，并进行体内、外功能验证。
[0072]
实施例三lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞的构建
[0073]
1.lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞构建
[0074]
通过制备逆转录病毒载体、转导t细胞，构建lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞，用的rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞作为对照组，流式细胞术检测car
‑
t细胞转导效率。
[0075]
2.lsd1 shrna anti
‑
cd19 car亲嗜性逆转录病毒载体制备
[0076]
pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑1‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car与pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑2‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car表达质粒分别转染phoenix
‑
eco细胞，制备亲嗜性逆转录病毒载体。转染48h后流式细胞术检测phoenix
‑
eco细胞myc标签表达水平，结果显示：pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑1‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car与pmfg
‑
u6
‑
lsd1 shrna
‑2‑
ef1α
‑
anti
‑
cd19 car质粒能在phoenix
‑
eco细胞中较高水平表达，参见图2。
[0077]
3.lsd1 shrna anti
‑
cd19 car双嗜性逆转录病毒载体制备
[0078]
亲嗜性逆转录病毒载体分别转导pg13细胞，建立稳定生产lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car双嗜性逆转录病毒载体的pg13细胞系，与稳定生产lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car双嗜性逆转录病毒载体的pg13细胞系。流式细胞术检测亲嗜性逆转录病毒载体转导pg13细胞转导效率，结果显示：pg13细胞转导效率均达70％以上，参见图3，说明成功构建了稳定生产lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car双嗜性逆转录病毒载体的pg13细胞系与稳定生产lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car双嗜性逆转录病毒载体的pg13细胞系。
[0079]
4.逆转录病毒载体滴度检测
[0080]
收获双嗜性逆转录病毒载体，rt
‑
qpcr检测病毒载体滴度，成功制备逆转录病毒载体，可以进行下一步实验。
[0081]
5.lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞构建
[0082]
从健康志愿者捐献的外周血中分离pbmc，t细胞体外培养、活化。分别用lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car双嗜性逆转录病毒载体、lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car双嗜性逆转录病毒载体转导t细胞，构建lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞，流式细胞术检测转导效率。结果显示：转导效率均达到50％以上，说明同时表达lsd1 shrna并没有影响anti
‑
cd19 car的表达。
[0083]
6.lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞整合拷贝数检测
[0084]
qpcr检测lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞病毒载体基因整合拷贝数。结果显示，所有car
‑
t细胞逆转录病毒载体整合拷贝数均小于3，anti
‑
cd19 car拷贝数为2.26
±
0.12，rnau6 anti
‑
cd19 car拷贝数为1.81
±
0.03，lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car拷贝数为2.27
±
0.41，lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car拷贝数为2.31
±
0.25。
[0085]
7.lsd1表达水平的检测
[0086]
lsd1 shrna anti
‑
cd19 car逆转录病毒载体转导人原代t细胞构建lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞，采用fitc标记的cd19重组抗原分子，流式细胞术检测anti
‑
cd19 car的表达，结果显示：anti
‑
cd19 car高效表达。然后rt
‑
qpcr检测lsd1的表达水平，结果显示：lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞中lsd1表达水平均明显降低，参见图4。这说明将shrna整合到表达car的逆转录病毒载体中、同时进
行基因表达及调节的联合治疗方法可以得到实现，已实现了lsd1shrna与anti
‑
cd19 car的同时表达。
[0087]
实施例四lsd1 shrna增强anti
‑
cd19 car
‑
t细胞抗肿瘤功能的体外研究
[0088]
1.lsd1 shrna增强anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体外杀伤肿瘤细胞功能检测
[0089]
1.1.lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体外杀伤raji细胞效率检测
[0090]
将lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与cd19分子表达阳性的肿瘤细胞raji按数量比为1:16，1:8，1:4，1:2，1:1共培养12h，流式细胞术检测lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤raji细胞效率。结果显示：lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤效率明显增强，pant指的是未转化的t细胞，见图5。
[0091][0092][0093]
1.2lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体外杀伤raji细胞压力测试检测将car
‑
t细胞与raji细胞按数量比1:1共培养48h后。流式细胞术检测共培养细胞的cd19分子表达，结果发现lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞组与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞组均已无cd19分子表达阳性的细胞。重复3个周期共培养，每次共培养周期结束后，进行car
‑
t细胞杀伤raji细胞的凋亡检测实验，流式细胞术检测car
‑
t细胞体外杀伤raji细胞的杀伤效率，共检测3次。
[0094]
第1次共培养48h后，car
‑
t细胞杀伤raji细胞的凋亡检测实验发现：lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤raji细胞的杀伤效率较无抗原刺激情况下的杀伤效率均有所增强，且lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞较rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤raji细胞效率明显增强，见图6a。
[0095][0096]
第2次共培养48h后，car
‑
t细胞杀伤raji细胞的凋亡检测实验发现：lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤raji细胞的杀伤效率较第1个共培养周期后的杀伤效率无明显差别，lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞较rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤raji细胞效率仍有显著增强，见图6b。
[0097][0098]
第3次共培养48h后，car
‑
t细胞杀伤raji细胞的凋亡检测实验发现：lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤raji细胞的杀伤效率较第2个共培养周期后的杀伤效率有所下降，这说明car
‑
t细胞在长期肿瘤抗原刺激下可能逐渐耗竭，而lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞较rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤raji细胞效率仍有显著增强，这说明lsd1 shrna可能对anti
‑
cd19 car
‑
t细胞长期抗肿瘤功能有益，见图6c和下表。
[0099][0100]
1.3lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体外杀伤raji
‑
luc细胞效率检测
[0101]
将lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与稳定表达萤光素酶的raji
‑
luc细胞共培养，萤光素酶检测car
‑
t细胞杀伤效率。结果显示：两组lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞较rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤raji
‑
luc细胞效率均明显增强，见图7和下表。
[0102][0103]
1.4lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤sw620细胞效率检测。
[0104]
向rtca配套的e
‑
plate 96检测板中接种1
×
104个sw620细胞/孔，检测记录48h后，加入2500个pant或rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t或lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞(效靶比1:4)，继续记录3天。检测结束后，数据分析结果显示：lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细
胞组sw620细胞指数明显低于rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞对照组，并有统计学差异，见图8和下表，这说明lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞杀伤sw620细胞杀伤效率明显增强。
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111]
[0112][0113]
1.5lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞细胞因子释放水平检测
[0114]
elisa检测lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与靶细胞raji共培养12h后，共培养细胞上清中细胞因子释放水平。结果发现：细胞上清中ifn
‑
γ、tnf
‑
α、l
‑
2释放水平均明显增高，参见图9和下表。
[0115][0116]
2.lsd1 shrna增强anti
‑
cd19 car
‑
t细胞体外增殖能力检测
[0117]
2.1cfse增殖检测
[0118]
将rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞、lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞及lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞cfse染色后，取染色后的细胞进行流式细胞术分析。结果显示：组间cfse染色较为均匀，fitc信号平均荧光强度无明显差别。
[0119]
将cfse染色均匀的car
‑
t细胞分别在靶细胞抗原刺激情况下(效应细胞与靶细胞数量比1:2)培养24h，流式细胞术检测car
‑
t细胞增殖情况。结果显示：两组lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞相比较，fitc信号平均荧光强度均明显降低，即cfse信号强度均明显降低，lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞增殖速度明显较快。
[0120][0121]
2.2细胞增殖记录。
[0122]
细胞持续培养20天，每48h进行细胞计数，并将细胞传代，使其浓度为1
×
106个/ml。根据细胞计数，计算细胞生长倍数，制作lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞增殖曲线与存活率曲线。可见随着细胞培养时间延长，在第15天之后，lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞增殖能力与持久性较rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞有所增强，见图10和下表。
[0123][0124][0125]
2.3car
‑
t细胞中cd4

t细胞与cd8

t细胞检测
[0126]
当只有效应细胞存在时，rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞以及lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞中cd4

t细胞与cd8

t细胞比例无明显差别，lsd1 shrna并没有对cd4

t细胞与cd8

t细胞的比例变化产生明显的影响；当效应细胞与靶细胞raji共培养12h后，rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞与lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞中cd8

t细胞均明显增多，组间无明显差异，见图11。
[0127]
2.4tcm细胞检测
[0128]
tcm细胞表达cd45ro和cd62l分子阳性，流式细胞术检测lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞中tcm细胞含量变化，即cd3阳性细胞群中，cd45ro和cd62l双阳性细胞群比例变化，结果发现：lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞中tcm细胞含量与对照组rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞中tcm含量无明显差别。
[0129]
实施例五lsd1 shrna增强anti
‑
cd19 car
‑
t细胞抗肿瘤功能的体内研究
[0130]
1.构建肿瘤动物模型
[0131]
npg小鼠尾静脉注射raji
‑
luc细胞4天后，小动物活体成像可见肿瘤信号，平均光量子数为(1.53
±
0.34)
×
104，说明肿瘤动物模型构建成功。
[0132]
2.小动物活体成像肿瘤监测
[0133]
小动物活体成像检测结果显示：模型组和注射未转导car的pant治疗组小鼠肿瘤信号逐渐增强并陆续死亡，而rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组及lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组小鼠肿瘤信号消失，并持续到实验结束的第52天未检测到肿瘤信号，肿瘤面积大小和整体信号强度变化见图12。
[0134][0135]
3.3记录小鼠生存曲线
[0136]
第0天尾静脉注射raji
‑
luc细胞，持续监测小鼠生存情况至第52天，可见car
‑
t细
胞治疗组小鼠的生存时间均明显延长，见图13和下表。
[0137][0138]
3.4小鼠体重检测
[0139]
监测小鼠体重变化，可见模型组和pant组小鼠在肿瘤细胞注射后第20天左右，体重急剧下降，并随后死亡。而car
‑
t细胞治疗组小鼠的体重变化较平稳，有缓慢升高的趋势，见图14和下表。
[0140]
小鼠体重变化(g)
[0141][0142][0143]
3.5体内t细胞增殖水平检测在car
‑
t细胞治疗组小鼠外周血中能持续检测到cd3

t至实验终止。在肿瘤细胞raji
‑
luc注射入npg小鼠后第52天，使用bv785标记的抗人cd3抗体流式细胞术检测t细胞含量，anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组小鼠外周血中cd3

t细胞在外周血有核细胞比例为(1.29
±
0.99)％；rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组为(1.82
±
0.94)％；lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组为(5.32
±
1.17)％，lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组为(9.52
±
5.23)％。根据标准曲线计算t细胞数，即：每100μl小鼠外周血中含anti
‑
cd19 car
‑
t细胞5187.04
±
8329.14个；rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞7181.21
±
7951.34个；lsd1 shrna
‑
1 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞38597.9
±
9925.14个；lsd1 shrna
‑
2 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞72228.47
±
44207.59个。lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组小鼠外周血中t细胞含量明显高于rnau6 anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组。
[0144]
3.6小鼠血清中ifn
‑
γ释放水平检测
[0145]
elisa检测第二次注射car
‑
t细胞7天后，npg小鼠血清中ifn
‑
γ释放水平。结果可见lsd1 shrna anti
‑
cd19 car
‑
t细胞治疗组小鼠血清中ifn
‑
γ释放水平均明显增高，见图15和下表。
[0146][0147]
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
[0148]
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。