cap蛋白的基因工程菌株及其构建、发酵方法与流程

1.本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种cap蛋白的基因工 程菌株及其构建、发酵方法。


背景技术：

2.猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)在分类学上属圆环病毒科圆环 病毒属。现已知pcv有两个血清型，即pcv1和pcv2。pcv2引起多种猪 圆环病毒相关疾病，包括猪皮炎肾病综合症、猪繁殖障碍、肺炎、肠炎、 急性肺水肿等，并与其他病原体造成混合型感染(如猪细小病毒、猪肺炎 支原体、猪蓝耳病毒等)，给全球养猪业带来重大的经济损失。
3.pcv2在是目前已知的最小dna病毒，直径约为12
‑
23nm，为无囊膜 的二十面体对称结构，含有共价闭合的单股环状双义链dna，基因组大小 约为1.76kb。pcv2基因组包含四个开放阅读框orf1、orf2、orf3、orf4， 其中orf1包含945个核苷酸，编码rep’蛋白(含有314个氨基酸)和 rep蛋白，其与病毒的复制相关；orf2包含702
‑
705个核苷酸，编码cap 蛋白，cap蛋白为衣壳蛋白，能使机体产生较为强烈的免疫应答；orf3位 于orf1内的内部，但与方向其相反，含有315个核苷酸，其表达的蛋白 对病毒复制是非必需的，但与pcv2诱导的细胞凋亡有关。
4.衣壳蛋白(capsid protein,cp)是pcv2病毒唯一的结构和免疫原性蛋 白；cp的分子量约为28kda。将orf2基因在昆虫细胞中表达，电镜下观 察可以发现cp能够自组装成病毒样颗粒(virus
‑
like particles,vlps)(sarkers etal.,2016)。目前，cap蛋白上共鉴定出至少6个表位区域(shang s betal.,2009；dominique mah
é
etal.,2000)，值得关注的是，近年来， cp(169
‑
183aa)被认为是pcv衣壳蛋白上的一个“衰减表位”，所谓衰减表 位，指的是不像其它抗原表位那样能刺激机体产生保护性的中和抗体，而 一种具有免疫优势的表位，它能诱使机体产生大量的针对衰减表位非保护 性抗，从而妨碍中和抗体的产生。benjamin r等分别用圆环vlps和单体免 疫猪；vlps能产生较高浓度中和抗体，然而单体产生了大量的非中和抗体； 由单体产生的抗体能识别衰减表位169
‑
180aa，但不能抵抗病毒感染； 169
‑
180aa作为衰减表位将体液免疫从中和保护表位转移，降低了中和抗 体的产生，影响免疫效果。通过x衍射分析pcv衣壳蛋白的晶体结构，可 以看出当衣壳蛋白以单体形式存在时，衰减表位cp(169
‑
183aa)向外形成了 一个环状结构，突出于cp蛋白亚单位表面，这就能更好地被宿主免疫细胞 所识别，也就是具有免疫优势的原因。但是，当衣壳蛋白单体，组装成完 整的vlps时，衰减表位cp(169
‑
183aa)却并不会暴露在vlps的表面，而 是埋于vlps的内部，所以不能够被宿主免疫细胞识别，机体会针对暴露在 外的中和表位，产生中和抗体进而阻止病毒与宿主细胞结合。
5.然而，很多情况下，衣壳蛋白都不是以组装成完整的vlps形式存在于 机体中的。当病毒入侵宿主后，病毒核酸进入细胞内并开始复制，用于包 装病毒核酸并形成病毒样颗粒的衣壳蛋白被超量制备。一旦受感染的细胞 在衣壳蛋白尚未完全用于组装病毒样颗粒时破裂，单体蛋白就会释放出来， 被宿主免疫细胞捕获，机体就会针对更具免疫优势的诱
骗表位产生大量的 抗体。然而，这些抗体并不具有中和病毒的活性，当病毒入侵时，它们并 不能够保护宿主。(trible b r etal.,2012；jin j,etal.,2018)
6.当前，针对cap蛋白衰减表位，研究人员做了很多方面的工作，yu等 2016发现cap蛋白中的诱骗表位(169
‑
180(aa))是导致pcvad的毒力因子 (yu et al.,2016)。一种含有大肠杆菌表达的不含诱骗抗原表位(169
‑
180aa)的 cap蛋白的重组疫苗，能有效保护猪对pcv2病毒的免疫(yu et al.,2016)； junyeong jin于2018年的研究发现，pcv2疫苗中衰减表位的水平直接影响 免疫动物血清中和活性，这个指标可以用来市用疫苗的效果(junyeong jinetal.,2018)；bo
‑
kyoung jung于2020年的研究发现，利用蓝耳抗原的中和 表位替换pcv2型cap蛋白衰减表位，能够诱导出更高水平的圆环中和抗体 (bo
‑
kyoung jung etal.,2020)。但目前还没有针对诱骗表位(169
‑
180(aa))进 行突变，在不影响其vlps组装及稳定性的前提下，大幅降低非中和抗体的 产生的研究。


技术实现要素：

7.本发明的第一个目的在于提供一种cap蛋白的基因工程菌株，其能够在 保持vlps稳定性不变的前提下，大幅降低非中和抗体的产生；
8.本发明的第二个目的在于提供一种cap蛋白的基因工程菌株的构建方 法，其构建出的基因工程菌株具有上述优点；
9.本发明的第三个目的在于提供一种cap蛋白的基因工程菌株的发酵方 法，能够培养出大量上述基因工程菌株。
10.本发明通过以下技术方案实现：
11.cap蛋白的基因工程菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏号：cgmcc no.22614，保藏日：2021年5月26日，分 类命名：大肠埃希氏菌(拉丁文名称：escherichia coli)，保藏地址：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
12.进一步地，基因工程菌株是过表达pcv
‑
2cap蛋白的大肠杆菌，并针对 pcv
‑
2cap蛋白基因中的诱骗表位进行了单点突变或双点突变；诱骗表位为 169～180aa。
13.诱骗表位(169～180aa)是导致机体产生非中和抗体的主要原因，非中 和抗体影响了具有保护作用的中和抗体的产生。本发明对诱骗表位中的氨 基酸位点进行单点突变和双点突变，使得机体无法识别诱骗表位，取消诱 骗表位的免疫优势，诱导机体产生更多的中和抗体。
14.进一步地，针对诱骗表位进行单点突变，突变位点为q175l，p176l， p176a，n177l，n178l或k179l。将突变后的基因序列分别命名为 mcap(q175l)、mcap(p176l)、mcap(p176a)、mcap(n177l)、mcap(k179l)。
15.作为替代的，针对诱骗表位进行双点突变，突变位点为p176a和 k179l。将突变后的基因序列分别命名为mcap(p176a；k179l)。
16.进一步地，pcv
‑
2cap蛋白基因为在ncbi
‑
locus_tag为af201311_2的 基因。
17.上述cap蛋白的基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
18.s1：以经过密码子优化的pcv
‑
2cap蛋白基因为模板，n端去除32个 氨基酸；针对pcv
‑
2cap蛋白基因中的诱骗表位进行单点突变或双点突变；
19.s2：以s1中合成的基因为模板，经过引物f1/r1进行pcr扩增，扩 增后得到的cap蛋白基因经过酶切后，插入到经过同样酶切的载体上，构建cap蛋白基因的表达质粒；
20.s3：将s2中得到的表达质粒转化至宿主菌株，经过筛选后获得突变后 cap蛋白基因过表达菌株。
21.进一步地，载体为pet28a。
22.将目标基因单点突变或者双点突变后，以合成mcap(q175l)、 mcap(p176l)、mcap(p176a)、mcap(n177l)、mcap(n178l)、mcap(k179l) 或mcap(p176a；k179l)基因为模板，进行pcr扩增，再将目标基因插入到 载体上，构建表达质粒pet28a
‑
mcap(q175l)、pet28a
‑
mcap(p176l)、 pet28a
‑
mcap(p176a)、pet28a
‑
mcap(n177l)、pet28a
‑
mcap(n178l)、 pet28a
‑
mcap(k179l)或pet28a
‑
mcap(p176a；k179l)，再将质粒转化至宿主 菌株clearcoli
tm
bl21(de3)，经转化子筛选和卡那霉素抗性筛选获得 mcap(q175l)、mcap(p176l)、mcap(p176a)、mcap(n177l)、mcap(n178l)、 mcap(k179l)或mcap(p176a；k179l)基因过表达菌株。
23.进一步地，s2中，引物的序列为：
24.f1：gaaggagatataccatgggcatgacctatccgcgtcgccg；
25.r1：gtggtggtgctcgagcggattcagcggcggatccttaaag。
26.进一步地，s2中，酶切使用的酶为bamhi和hindiii双酶切。
27.cap蛋白的基因工程菌株的发酵方法，使用lb培养基对上述基因工程 菌株的构建方法构建得到的基因工程菌株进行培养，当波长设定为600nm 时测定的光密度值达到0.6时，进行iptg诱导表达，表达温度为28℃，诱 导时间为5h。
28.本发明的技术方案至少具有如下优点和有益效果：
29.(1)本发明提供的cap蛋白的基因工程菌株，生产出的cap蛋白在不 影响vlps的组装和稳定性的情况下，能够大幅降低非中和抗体的产生；使 用本发明的基因工程菌株生产出的cap蛋白制备得到的疫苗能够对仔猪起 到良好的保护作用；
30.(2)本发明提供的cap蛋白的基因工程菌株的构建方法，能够构建出 具有上述优点的基因工程菌株；
31.(3)本发明提供的cap蛋白的基因工程菌株的发酵方法，能够培养出 大量具有上述优点的基因工程菌株。
附图说明
32.图1为单点突变样品1～6的cap基因的菌落pcr验证图；
33.图2为单点突变样品1～6的重组载体的酶切验证；
34.图3为单点突变样品1～6的重组蛋白表达的sds
‑
page验证；
35.图4为双点突变样品7的cap基因的的菌落pcr验证图；
36.图5为双点突变样品7的重组蛋白表达的sds
‑
page验证；
37.图6为双点突变样品7的重组蛋白表达纯化后的sds
‑
page验证；
38.图7为双点突变重组蛋白表达纯化后投射电镜照片(100nm)；
39.图8为双点突变重组蛋白表达纯化后投射电镜照片(200nm)。
具体实施方式
40.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发 明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件 者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产 厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
41.实施例1
42.(1)含有cap基因重组质粒的构建
43.cap基因以及单点突变(mcap(q175l)、mcap(p176l)、mcap(p176a)、 mcap(n177l)、mcap(n178l)、mcap(k179l))的基因由生工生物工程(上 海)有限公司合成，然后经过引物f1/r1进行pcr扩增，通过bamhi/hindiii 酶切后，插入到经过同样酶切的载体pet28a上，经过连接后转化 clearcoli
tm
bl21(de3)感受态细胞，卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，将筛 选到的单克隆进行菌落pcr验证，验证正确的单克隆提交生工生物工程(上 海)有限公司进行测序，测序正确后即构建重组质粒pet28a
‑
mcap(q175l)、 pet28a
‑
mcap(p176l)、pet28a
‑
mcap(p176a)、pet28a
‑
mcap(n177l)、 pet28a
‑
mcap(n178l)、pet28a
‑
mcap(k179l)成功。其中，引物的序列为：
44.f1：gaaggagatataccatgggcatgacctatccgcgtcgccg；
45.r1：gtggtggtgctcgagcggattcagcggcggatccttaaag。
46.验证结果如图1所示。
47.(2)含有cap基因重组菌株的蛋白表达
48.将已经验证成功的重组菌株转接与lb液体培养基中进行活化，37℃、 220rpm培养12h，活化后的菌株按照2％的接种量转接与250ml的三角瓶含 50mllb的发酵液中，37℃、220rpm培养，菌体浓度至od
600
至0.6时加入 终浓度为1mmol的iptg进行诱导表达，诱导稳定为28℃，转速220rpm， 诱导培养9h后收集菌体。
49.(3)诱骗表位突变cap蛋白的纯化
50.将发酵收集到的菌体用复溶buffer(20mmol的pb，ph值为7.2,150mmol 的醋酸钠，200mmol的氯化钠)进行复溶后进行菌体破碎，破碎后的菌体 离心(12000rpm、20min)收集上清液，将上清液置于60℃水浴锅中处理 40min，再次离心(8000rpm)离心15min后收集上清液。
51.将不同突变位点的重组菌株得到的纯化蛋白分别命名为样品1～样品6。
52.实施例2
53.(1)含有cap基因重组质粒的构建
54.双点突变(mcap(p176a；k179l))的基因由生工生物工程(上海)有限 公司合成，然后经过引物f1/r1进行pcr扩增，通过bamhi/hindiii酶切 后，插入到经过同样酶切的载体pet28a上，经过连接后转化 clearcoli
tm
bl21(de3)感受态细胞，卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，将筛 选到的单克隆进行菌落pcr验证，验证正确的单克隆提交生工生物工程(上 海)有限公司进行测序，测序正确后即构建重组质粒pet28a
‑
mcap(p176a；k179l)成功。其中，引物的序列为：
55.f1：gaaggagatataccatgggcatgacctatccgcgtcgccg；
56.r1：gtggtggtgctcgagcggattcagcggcggatccttaaag。
57.后续步骤与实施例1相同，将双点突变的重组菌株得到的纯化蛋白命 名为样品7。
58.实验例1
59.(1)cap蛋白的sds
‑
page验证
60.将纯化后的样品1～7吸取80ml加20ml*5蛋白上样buffer，用12％蛋 白电泳蛋白胶，上样体积为每孔10ul，染色脱水后观察。
61.验证结果如图3和图5所示。
62.(2)琼脂凝胶扩散沉淀实验(agp)
63.平板制备
64.配制100ml琼脂液：称取1g进口琼脂糖、8gnacl于250ml锥形瓶中， 量取甲液24ml，乙液76ml倒入锥形瓶，用纱布及牛皮纸包裹瓶口，放入微 波炉加热。待液体稍微冷却后，在水平台面上，用50ml注射器吸取煮好 的琼扩液体约22ml，在90mm干净平皿中浇成厚度为2.5毫米的凝胶板， 待完全冷却凝固后，用直径4mm的梅花形打孔器打孔，中间孔与外周孔 距离为3mm。用针头轻轻挑出孔中的琼脂。将琼扩板轻轻放在酒精灯火焰 上烘烤加热约10秒每孔，并不断用手背感觉琼扩板的温度，使琼扩板不 能高于人体的承受温度，使之封底彻底同时保持孔型良好。
65.其中，甲液为3.85g的na2hpo4·
12h2o加水至1l；乙液为1.36g的 kh2po4加水至1l。
66.样品稀释及加样
67.将上述纯化的样品1～7取出，于“v”型板上分别做2、4、8、16、32、 64、128、256倍稀释，在琼扩板周围孔加入稀释好的样品。分别取2、4、 8、16、32、64、128、256倍梯度加样，并同时重复一组孔。同时设定一组 已知抗原效价的阳性对照(抗原效价在32～64之间)。稀释样品加好后在中 间孔加入cap阳性血清(60μl)。
68.琼扩板反应和读数
69.将做好的琼扩板放入湿盒，盖好盖放入37℃温箱中反应，反应48～72 小时后取出琼扩板读数；按照成线清晰及重复孔是否读数一致，判定效价。
70.重组蛋白表达的抗原抗体琼扩验证结果如表1所示：
71.表1 重组蛋白表达的抗原抗体琼扩验证结果表
72.菌种琼扩(24h)样品10样品20样品38样品40样品51样品62样品716对照组8
73.将双点突变纯化后的样品7用电镜观察，在不同倍数下得到图7、图8 所示照片，说明双点突变后并没有影响vlps的组装。
74.综上所述，本发明提供的pcv
‑
2cap蛋白的基因工程菌株能够生产出既 不影响vlps组装和稳定性，又能减少非中和抗体产生的cap蛋白，对更有 效的猪圆环2型病毒疫苗
的生产有重要作用。