一种可结合CD206的抗体及其应用的制作方法

一种可结合cd206的抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于抗肿瘤药物领域，具体涉及一种可结合人或鼠cd206的抗体及其应用。


背景技术：

2.一些基因突变是肿瘤产生的原因。化疗虽然可以抑制肿瘤细胞的生长，但是往往也能对正常组织和细胞也有损伤，导致身体健康受损或诱发肿瘤基因突变，导致肿瘤复发。因此，靶向治疗成为研究热点。
3.抗体偶联药物(antibody
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drug conjugates，adc)特异性抗体与具有细胞毒性的药物偶联，将药物靶向特定的抗原，从而使药物杀伤表达相应抗原的细胞。adc一般由“弹头”药物(细胞毒性药物)、抗体以及偶联链3部分组成。稳定结合型的adc能够将药物拉向靶细胞，防止其在外周血和正常细胞表面降解。因此，在同等给药剂量下，稳定型adc像缓释剂一样能够长时间在体保持对靶细胞的有效杀伤浓度而不释放出多余的毒素，使得adc在目标组织中具有更高效的杀伤效应和更少的不良反应。
4.为了实现对肿瘤细胞的有效且特异性的杀伤，一方面要确定与肿瘤细胞相关的抗原，另一方面要制备和筛选针对该抗原的特异性抗体，并且该抗体可用于偶联细胞毒性药物而不影响其特异性和亲和力。
5.肿瘤相关性巨噬细胞包括m1和m2两种亚型，其中，m2型肿瘤相关性巨噬细胞促进肿瘤生长与各类肿瘤的不良预后有关，而m1型肿瘤相关性巨噬细胞则有抗肿瘤功能。因此，可将m2型肿瘤相关性巨噬细胞作为特异性靶点进行干预，联合基于t细胞的肿瘤免疫治疗，并有效保留具有抗肿瘤活性的m1型巨噬细胞。
6.我们在研究过程中发现，m2型肿瘤相关性巨噬细胞表面特异性表达受体cd206，可作为靶抗原。为了实现针对m2型瘤相关性巨噬细胞的特异性杀伤，我们使用cd206制备了抗体，并构建了抗体偶联药物。


技术实现要素：

7.为解决以上问题，本发明提供了一种可结合cd206的抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区的cdr1
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3的序列如seq id no：14
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16所示，所述轻链可变区的cdr1
‑
3的序列如seq id no：17
‑
19所示。
8.在一个具体实施方案中，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no:4或其突变体所示。
9.在一个具体实施方案中，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:4或其突变体所示。
10.在一个具体实施方案中，所述抗体的序列如seq id no:10所示。
11.本发明还提供了上述抗体在制备抗肿瘤药物或特异性杀伤m2型巨噬细胞的药物中的应用。
12.本发明还提供了一种抗体偶联药物，包括上述抗体作为n端结构域。
13.在一个具体实施方案中，所述抗体偶联药物还包括具有细胞毒性的多肽作为c端结构域。
14.在一个具体实施方案中，所述具有细胞毒性的多肽的序列如seq id no:12所示。
15.在一个具体实施方案中，所述抗体偶联药物的序列如seq id no:13所示。
16.本发明筛选得到的抗体可特异性的结合m2型巨噬细胞表面分子标志cd206，并且可与血清白蛋白和细胞毒素pe结合，形成的抗体偶联药物既能够特异性识别m2型巨噬细胞，同时也保持了对细胞的杀伤作用。因此，可作为有效的抗肿瘤靶向药物。
附图说明
17.图1为8个杂交瘤细胞株上清经流式检测的荧光强度统计图；
18.图2为不同处理的巨噬细胞系经流式检测的流式图；
19.图3为4℃下用荧光标记的细胞毒素与m1型和m2型巨噬细胞孵育后的流式细胞检测mfi统计截图；
20.图4为37℃下用荧光标记的细胞毒素与m1型和m2型巨噬细胞孵育后的流式细胞检测mfi统计截图；
21.图5为六孔板细胞毒性试验的显微照片；
22.图6为cck
‑
8实验中od450的统计图。
具体实施方式
23.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
24.1、抗体的筛选与制备
25.固相合成法按相应序列合成cd206多肽，hplc及mass质检结果表明，合成的多肽序列正确，纯度大于90％，总量满足要求。将cd206与mbs
‑
klh连接物进行交联，形成cd206
‑
klh共价复合物，作为免疫原。
26.使用上述免疫原免疫小鼠，用量如下：初免时每只小鼠注射100μg抗原 等体积的弗氏完全佐剂；加强免疫时每只小鼠注射50μg抗原 等体积的弗氏不完全佐剂。进行了5次加强免疫后，从小鼠尾静脉取血制备抗血清，进elisa检测显示，抗血清具有较高效价，取小鼠脾细胞进行融合筛选。
27.将免疫小鼠的脾细胞与复苏的sp2/0细胞融合，方法如下：按1:3
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1:10的比例混合骨髓瘤细胞和脾细胞，标准流程进行细胞融合操作，随后用hat
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dmem完全培养基培养，融合后3天即可以看到杂交瘤细胞，第7天换1/2hat完全培养基，第8天换1/2ht培养基。融合后10天左右开始进行筛选检测。吸取细胞上清100ul/孔，进行间接elisa检测。根据elisa结果，判断阳性孔。进行第二次复检，进一步确认阳性孔。
28.对复筛的阳性孔细胞做两轮亚克隆。检测出稳定阳性的杂交瘤细胞株，作为最终制备单抗的细胞，并扩大培养。使用美国southern biotech的单抗亚型鉴定试剂盒，分别测各个上清的亚型。经过两轮亚克隆及复检，确定阳性细胞株及其亚型，进一步鉴定阳性细胞株上清液所含抗体与cd206的结合力以及与cd206结合后的内吞能力。确定8个阳性细胞株及其所属亚型。使用杂交瘤上清与il
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4诱导分化的m2型肿瘤相关性巨噬细胞孵育，通过过
流式检测荧光强度，结果显示，8#细胞株(6d5，igg1)具有较高的荧光强度，可以用于靶向m2型肿瘤相关性巨噬细胞(图1)。分别使用未分化的巨噬细胞系(raw)、il
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4孵育的raw以及il
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4和6d5的上清孵育的raw进行流式检测，得出的流式图如图2所示，显示出杂交瘤上清中的抗体对m2型肿瘤相关性巨噬细胞具有较强的亲和力。
29.培养杂交瘤细胞株6d5，提取rna，反转录制备cdna。用设计合成的小鼠igg特异引物组测序。
30.结果显示，细胞株6d5对应的抗体重链的dna编码序列如seq id no:1所示，对应的氨基酸序列如seq id no:2所示，其中，重链可变区的dna编码序列如seq id no:3所示，对应的氨基酸序列如seq id no:4所示(其中，第26
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33位氨基酸为cdr1，序列如seq id no:14所示；第51
‑
58位氨基酸为cdr2，序列如seq id no:15所示；第97
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104位氨基酸为cdr3，序列如seq id no:16所示)。抗体轻链的dna编码序列如seq id no:5所示，对应的氨基酸序列如seq id no:6所示，其中，轻链可变区的dna编码序列如seq id no:7所示，对应的氨基酸序列如seq id no:8所示(其中，第27
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32位氨基酸为cdr1，序列如seq id no:17所示；第50
‑
62位氨基酸为cdr2，序列如seq id no:18所示；第89
‑
97位氨基酸为cdr3，序列如seq id no:19所示)。
31.2、单链抗体的构建
32.根据上述序列，我们将重链可变区第44位丝氨酸和轻链可变区第100位甘氨酸均突变成半胱氨酸，通过该突变，增加了最后形成的单链抗体的稳定性。然后将突变后的重链可变区和轻链可变区用柔性多肽链连接(seq id no:9)起来，得到单链抗体，序列如seq id no:10所示。根据elisa实验显示，单链抗体对cd206具有良好的亲和力和特异性。
33.3、靶向药物的偶联
34.使用白蛋白结合结构域(abd，序列如seq id no:11所示)以延长血清半衰期。铜绿假单胞菌pe38的外毒素pe38x8，通过催化伸长因子2的不可逆性核糖基化阻止核糖体功能抑制蛋白质功能，从而在细胞质中发挥细胞毒性作用，介导靶细胞死亡。删除pe38x8天然细胞结合域并去掉t细胞表位，得到截短形式的pe38x8，以下简称pe(seq id no:12)，降低了免疫原性，以利于对肿瘤部位多次给药。
35.将柔性连接肽将单链抗体与pe按从n端到c端的方向连接，得到αcd206
‑
pe。
36.使用柔性连接肽将单链抗体、abd和截短形式的pe38x8按从n端到c端的方向依次连接起来，得到靶向m2型肿瘤相关性巨噬细胞的抗体偶联药物(氨基酸序列如seq id no:13所示)，αcd206
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abd
‑
pe。
37.以上蛋白(pe、αcd206
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pe和αcd206
‑
abd
‑
pe)构建表达载体，使用大肠杆菌进行表达。
38.4、细胞内吞与结合
39.将构建好的蛋白pe和αcd206
‑
pe用zip alexa fluor
tm
488rapid antibody labeling kit(thermo fisher scientific)标记；将巨噬细胞系raw接种于两个12孔板中，其中一个12孔板加入lps诱导m1型巨噬细胞分化，另外一个12孔板加入il
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4诱导m2型巨噬细胞分化；分化完全后，将标记的pe、αcd206
‑
pe分别加入到12孔板的六个孔中并加入含0.1％胎牛血清的pbs，放入4℃孵育30min；然后加入pbs中止反应，1200rpm离心6min，清洗两次。然后用流式细胞仪测定孵育混合物的mfi。结果如图3所示，αcd206
‑
pe发生细胞表面
结合但抑制内化。孵育后，m1巨噬细胞的平均荧光强度(mfi)小于m2巨噬细胞。相反，用标记的“pe”孵育的m1和m2巨噬细胞具有更低的mfi。
40.同样的实验重复一遍，不同之处在于细胞毒素的孵育温度为37℃。结果如图4所示，αcd206
‑
pe与m1型、m2型巨噬细胞表面结合和内化可同时进行。孵育后，m1巨噬细胞的平均荧光强度(mfi)小于m2巨噬细胞。相反，用标记的“pe”孵育的m1和m2巨噬细胞具有更低的mfi。
41.以上结果显示，αcd206
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pe比pe更倾向于m2型巨噬细胞结合，并且内化37℃下不受影响。
42.5、细胞毒性实验
43.5.1六孔板实验
44.方法如下：将巨噬细胞系raw接种于两个六孔板中，于37℃下培养8h贴壁，然后六孔板的第一排孔中分别加入2.5μl il
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4(20ng/μl)刺激48小时，使其分化成m2型巨噬细胞。向两个六孔板中的一个加入pe，另一个加入αcd206
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pe。图5示出了加入细胞毒素后第三天和第四天的情况，结果显示，未加il
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4的孔中，细胞数比较稳定，而il
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4诱导的孔中，随着时间推移被杀伤的细胞越多。由于加入细胞毒素之前，只诱导了8小时，raw细胞尚未被诱导成m2型细胞，因此，αcd206
‑
pe对这些细胞不具有杀伤作用。但是，随着时间推移，越来越多的细胞被诱导成m2型细胞而被αcd206
‑
pe。在加pe的六孔板里，不存在该现象。可见，αcd206与pe的偶联既没有影响pe杀伤力，有没有影响抗体的特异性，两者构成的偶联药物可特异性地杀伤m2型巨噬细胞，而对未分化的raw细胞未显示出明显的杀伤作用。
45.5.2cck8试剂酶标仪检测实验
46.方法如下：将raw细胞接种到96孔板(每孔10,000个细胞)中，加入il
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4刺激48h，加入细胞毒素孵育48h，然后每孔加入10μl cck8试剂孵育48h。使用酶标仪测定450nm下的吸光度。结果如图6所示，偶联单链抗体和abd不会影响pe的毒性。
47.以上实验说明，本发明的单链抗体与abd和pe之间不会产生相互影响，所构建的adc在体外可以特异性地杀伤m2型巨噬细胞。
48.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。