新的AAV变体的制作方法

新的aav变体
1.与相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月16日提交的pct申请号pct/cn2019/111525的利益和优先权，所述申请的全部内容为所有目的通过参考并入本文。
技术领域
3.本发明涉及基因疗法，特别是涉及腺相关病毒(aav)。


背景技术：

4.由于对人类疾病的了解不断加深以及基因递送技术的突破，临床基因疗法取得了越来越大的成功。在这些技术中，重组腺相关病毒(raav)载体正在越来越多的临床试验中使用。raav提供了几个重要优点：(1)良好的安全性：没有已知的人类疾病与aav相关。所述病毒只能在特殊环境下复制。所述载体中不存在病毒蛋白。raav载体很少整合到宿主基因组中。(2)在体外和体内感染分裂和非分裂细胞两者的能力。(3)转入基因在各种不同组织中的长期表达。(4)不存在巨大的免疫应答。它们全都对在大量动物模型以及包括利伯氏先天性黑蒙症、乙型血友病、α
‑
1抗胰蛋白酶缺乏症、帕金森氏病、卡纳万病和肌营养不良症在内的越来越多的临床研究中被证实的功效有贡献。在2012年，欧盟委员会批准了用于脂蛋白脂肪酶缺乏症的基于raav的产品，这是西方世界批准的第一种基因疗法产品。在2017年，voretigene neparvovec
‑
rzyl(luxturna)这种用于治疗与双等位基因rpe65突变相关的视网膜营养不良症的基因疗法，成为第一种美国食品药品监督管理局(fda)批准的体内基因疗法产品。2019年5月24日，us fda批准了第一种用于脊髓性肌萎缩症的药物，它也是一种基于aav的基因疗法。
5.使用aav载体进行基因递送的挑战源于下述简单的考虑，即允许aav发生自然感染的特性与大多数医学应用(例如基因疗法)所需的特性不同。因此，对aav载体进行工程化改造使得病毒能够从自然进化的限制中释放出来，从而使它们能够获得新的且具有生物医学价值的表型，一直是并将继续是研究领域中的主要挑战。
6.随着临床阶段基因疗法研究数量的不断增加，另外两种天然存在的血清型aav8和aav9已被证明具有更强大的基因递送能力。然而，aav8和aav9的主要细胞受体仍然未知。目前，用于基础理解以及基因递送应用两者的aav8和aav9载体的工程化改造是有限的。


技术实现要素：

7.本发明提供了包含一个或多个氨基酸替换的变体aav衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包含对应于天然aav 8或aav9衣壳蛋白的vr viii区的替换氨基酸序列。
8.在一个实施方式中，所述变体aav衣壳蛋白包含在对应于天然aav 8的氨基酸序列(seq id no：1)的氨基酸残基n585、l586、q587、q588、q589、n590、t591、a592、p593、q594、i595、g596、t597、v598中的一者或多者处包含替换的变体aav衣壳蛋白，所述氨基酸残基的替换选自n585y、l586n、l586q、l586k、l586h、l586f、q587n、q588 n、q588s、q588a、q588d、
q588g、q589t、q589a、q589g、q589s、q589n、n590a、n590s、n590d、n590t、n590q、t591s、t591a、t591r、t591e、t591g、a592q、a592d、a592g、a592r、a592t、p593a、p593t、q594t、q594a、q594i、q594s、q594d、i595a、i595t、i595v、i595t、i595s、i595y、g596q、g596s、g596a、g596e、t597a、t597l、t597d、t597s、t597n、t597v、t597w、t597m、v598d。
9.在一个实施方式中，所述衣壳蛋白在对应于天然aav 8(seq id no：1)的第585至597或585至598位氨基酸的氨基酸处包含替换氨基酸序列。
10.在一个实施方式中，所述衣壳蛋白在对应于天然aav 8(seq id no：1)的第585至598位氨基酸的氨基酸处包含式i的替换氨基酸序列：x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
x
13
x
14
，其中
11.x1选自asn和tyr，
12.x2选自leu、asn、gln、lys、his和phe，
13.x3选自gln和asn，
14.x4选自gln、asn、ser、ala、asp和gly，
15.x5选自gln、thr、ala、gly、ser和asn，
16.x6选自asn、ala、ser、asp、thr和gln，
17.x7选自thr、ser、ala、arg、glu和gly，
18.x8选自ala、gln、asp、gly、arg和thr，
19.x9选自pro、ala和thr，
20.x
10
选自gln、thr、ala、ile、ser和asp，
21.x
11
选自ile、ala、thr、val、thr、ser和tyr，
22.x
12
选自gly、gln、ser、ala和glu，
23.x
13
选自thr、ala、leu、asp、ser、asn、val、trp和met，
24.x
14
选自val和asp，
25.所述序列不包含seq id no：2的氨基酸序列(天然aav8 vr viii)。
26.在一个实施方式中，所述衣壳蛋白在对应于天然aav 8(seq id no：1)的第585至597位氨基酸的氨基酸处包含式iv的替换氨基酸序列：x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
x
13
，其中
27.x1是asn，
28.x2选自leu、asn、his和phe，
29.x3是gln，
30.x4选自gln、asn、ser和ala，
31.x5选自gln、thr、ala、gly、ser和asn，
32.x6选自asn、thr和gln，
33.x7选自thr、ser和ala，
34.x8选自ala、gln、gly和arg，
35.x9选自pro和ala，
36.x
10
选自gln、thr、ala、ile、ser和asp，
37.x
11
选自ile、ala、thr和val，
38.x
12
选自gly、gln、ser、ala和glu，
39.x
13
选自thr、ala、leu、asp、asn、val、trp和met，
40.所述序列不包含seq id no：2的氨基酸序列(天然aav8 vr viii)。
41.在一个实施方式中，所述衣壳蛋白在对应于天然aav 8(seq id no：1)的第585至597位氨基酸的氨基酸处包含式ii的替换氨基酸序列：x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
x
13
，其中
42.x1是asn，
43.x2选自leu、asn和phe，
44.x3是gln，
45.x4选自gln、asn、ser和ala，
46.x5选自thr、ala和ser，
47.x6选自asn、ser和thr，
48.x7选自thr、ala和gly，
49.x8选自ala、gln、gly和arg，
50.x9选自pro和ala，
51.x
10
选自gln、ala和ile，
52.x
11
选自thr和val，
53.x
12
选自gly和gln，
54.x
13
选自thr、leu、asn和asp。
55.在本发明中，wt aav8衣壳蛋白的ncbi参考序列是yp_077180.1(genbank：aan03857.1)，如seq id no：1中所示。
56.seq id no：1(wt aav8衣壳的氨基酸序列)
57.maadgylpdwlednlsegirewwalkpgapkpkanqqkqddgrglvlpgykylgpfngldkgepvnaadaaalehdkaydqqlqagdnpylrynhadaefqerlqedtsfggnlgravfqakkrvleplglveegaktapgkkrpvepspqrspdsstgigkkgqqparkrlnfgqtgdsesvpdpqplgeppaapsgvgpntmaagggapmadnnegadgvgsssgnwhcdstwlgdrvittstrtwalptynnhlykqisngtsggatndntyfgystpwgyfdfnrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlsfklfniqvkevtqnegtktiannltstiqvftdseyqlpyvlgsahqgclppfpadvfmipqygyltlnngsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnfqftytfedvpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsrtqttggtantqtlgfsqggpntmanqaknwlpgpcyrqqrvstttgqnnnsnfawtagtkyhlngrnslanpgiamathkddeerffpsngilifgkqnaardnadysdvmltseeeikttnpvateeygivadnlqqqntapqigtvnsqgalpgmvwqnrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggfglkhpppqilikntpvpadppttfnqsklnsfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnyykstsvdfavntegvyseprpigtryltrnl*
58.wt aav8衣壳的dna序列是
59.atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtgggcgctgaaacctggagccccgaagcccaaagccaaccagcaaaagcaggacgacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctggagcacgacaaggcctacgaccagcagctgcaggcgggtgacaatccgtacctgcggtataaccacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaagaagcgggttctcgaacctctcggtctggttgaggaaggcgctaagacggctcctggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgttctccagactcctctacgggcatcggcaagaaaggccaacagcccgccagaaaaagactcaattttggtcagactggcgactcagagtcagttccagaccctcaacctctcggagaacctccagcagcgccctctggtgtgggacctaatacaatggctgcaggcggtggcgcaccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtagttcctcgggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcc
no：43)的第583至596位氨基酸的氨基酸处包含式i的替换氨基酸序列：x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
x
13
x
14
，其中
64.x1选自asn和tyr，
65.x2选自leu、asn、gln、lys、his和phe，
66.x3选自gln和asn，
67.x4选自gln、asn、ser、ala、asp和gly，
68.x5选自gln、thr、ala、gly、ser和asn，
69.x6选自asn、ala、ser、asp、thr和gln，
70.x7选自thr、ser、ala、arg、glu和gly，
71.x8选自ala、gln、asp、gly、arg和thr，
72.x9选自pro、ala和thr，
73.x
10
选自gln、thr、ala、ile、ser和asp，
74.x
11
选自ile、ala、thr、val、thr、ser和tyr，
75.x
12
选自gly、gln、ser、ala和glu，
76.x
13
选自thr、ala、leu、asp、ser、asn、val、trp和met，
77.x
14
选自val和asp，
78.所述序列不包含seq id no：33的氨基酸序列(天然aav9 vr viii)。
79.在一个实施方式中，与野生型aav9衣壳蛋白相比，vr viii区是seq id no：43(aav9)的第583至595位氨基酸；所述衣壳蛋白在对应于天然aav 9(seq id no：43)的第583至595位氨基酸的氨基酸处包含式ii的替换氨基酸序列：x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
x
11
x
12
x
13
，其中
80.x1是asn，
81.x2是leu，
82.x3是gln，
83.x4是asn或ser，
84.x5选自ala、ser和gly，
85.x6是asn，
86.x7是thr，
87.x8选自ala、gln和gly，
88.x9是pro或ala，
89.x
10
选自gln、thr和ala，
90.x
11
是thr，
91.x
12
选自gly、gln、ala和glu，
92.x
13
选自thr、asn和asp。
93.在本发明中，wt aav9衣壳蛋白的ncbi参考序列是aas99264.1(genbank：ahf53541.1)，如seq id no：43中所示。
94.seq id no：43(wt aav9衣壳的氨基酸序列)
95.maadgylpdwlednlsegirewwalkpgapqpkanqqhqdnarglvlpgykylgpgngldkgepvnaadaaalehdkaydqqlkagdnpylkynhadaefqerlkedtsfggnlgravfqakkrlleplglveeaaktapgkkrpveqspqepdssagigksgaqpakkrlnfgqtgdtesvpdpqpigeppaapsgvgsltmasgggapvadnnegadgvgs
ssgnwhcdsqwlgdrvittstrtwalptynnhlykqisnstsggssndnayfgystpwgyfdfnrfhchfsprdwqrlinnnwgfrpkrlnfklfniqvkevtdnngvktiannltstvqvftdsdyqlpyvlgsahegclppfpadvfmipqygyltlndgsqavgrssfycleyfpsqmlrtgnnfqfsyefenvpfhssyahsqsldrlmnplidqylyylsktingsgqnqqtlkfsvagpsnmavqgrnyipgpsyrqqrvsttvtqnnnsefawpgasswalngrnslmnpgpamashkegedrffplsgslifgkqgtgrdnvdadkvmitneeeikttnpvatesygqvatnhqsaqaqaqtgwvqnqgilpgmvwqdrdvylqgpiwakiphtdgnfhpsplmggfgmkhpppqilikntpvpadpptafnkdklnsfitqystgqvsveiewelqkenskrwnpeiqytsnyyksnnvefavntegvyseprpigtryltrnl
96.wt aav9衣壳的dna 序列是
97.atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaaccttagtgaaggaattcgcgagtggtgggctttgaaacctggagcccctcaacccaaggcaaatcaacaacatcaagacaacgctcgaggtcttgtgcttccgggttacaaataccttggacccggcaacggactcgacaagggggagccggtcaacgcagcagacgcggcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctcaaggccggagacaacccgtacctcaagtacaaccacgccgacgccgagttccaggagcggctcaaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaaaaagaggcttcttgaacctcttggtctggttgaggaagcggctaagacggctcctggaaagaagaggcctgtagagcagtctcctcaggaaccggactcctccgcgggtattggcaaatcgggtgcacagcccgctaaaaagagactcaatttcggtcagactggcgacacagagtcagtcccagaccctcaaccaatcggagaacctcccgcagccccctcaggtgtgggatctcttacaatggcttcaggtggtggcgcaccagtggcagacaataacgaaggtgccgatggagtgggtagttcctcgggaaattggcattgcgattcccaatggctgggggacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctgcccacctacaacaatcacctctacaagcaaatctccaacagcacatctggaggatcttcaaatgacaacgcctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcctaagcgactcaacttcaagctcttcaacattcaggtcaaagaggttacggacaacaatggagtcaagaccatcgccaataaccttaccagcacggtccaggtcttcacggactcagactatcagctcccgtacgtgctcgggtcggctcacgagggctgcctcccgccgttcccagcggacgttttcatgattcctcagtacgggtatctgacgcttaatgatggaagccaggccgtgggtcgttcgtccttttactgcctggaatatttcccgtcgcaaatgctaagaacgggtaacaacttccagttcagctacgagtttgagaacgtacctttccatagcagctacgctcacagccaaagcctggaccgactaatgaatccactcatcgaccaatacttgtactatctctcaaagactattaacggttctggacagaatcaacaaacgctaaaattcagtgtggccggacccagcaacatggctgtccagggaagaaactacatacctggacccagctaccgacaacaacgtgtctcaaccactgtgactcaaaacaacaacagcgaatttgcttggcctggagcttcttcttgggctctcaatggacgtaatagcttgatgaatcctggacctgctatggccagccacaaagaaggagaggaccgtttctttcctttgtctggatctttaatttttggcaaacaaggaactggaagagacaacgtggatgcggacaaagtcatgataaccaacgaagaagaaattaaaactactaacccggtagcaacggagtcctatggacaagtggccacaaaccaccagagtgcccaagcacaggcgcagaccggctgggttcaaaaccaaggaatacttccgggtatggtttggcaggacagagatgtgtacctgcaaggacccatttgggccaaaattcctcacacggacggcaactttcacccttctccgctgatgggagggtttggaatgaagcacccgcctcctcagatcctcatcaaaaacacacctgtacctgcggatcctccaacggccttcaacaaggacaagctgaactctttcatcacccagtattctactggccaagtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggaaaacagcaagcgctggaacccggagatccagtacacttccaactattacaagtctaataatgttgaatttgctgttaatactgaaggtgtatatagtgaaccccgccccattggcaccagatacctgactcgtaatctgtaa
98.在一个特定实施方式中，本发明提供了一种变体aav 9衣壳蛋白，其包含对应于
seq id no：43(aav9)的第583至595或596位氨基酸的替换序列；优选地，所述序列包含选自如表8中所示的seq id no：3
‑
42的氨基酸序列。
99.在一个特定实施方式中，本发明提供了一种变体aav 9衣壳蛋白，其包含对应于seq id no：43(aav9)的第583至595位氨基酸的替换序列；优选地，所述序列包含选自seq id no：29(aav 9
‑
lib31)、seq id no：14(aav 9
‑
lib 33)、seq id no：9(aav 9
‑
lib43)和seq id no：11(aav 9
‑
lib46)的氨基酸序列。
100.另一方面，本发明提供了一种包含编码上述变体aav衣壳蛋白的核苷酸序列的分离的多核苷酸或包含上述多核苷酸的载体。
101.本发明提供了一种分离的、遗传修饰的宿主细胞，其包含上述多核苷酸。
102.本发明提供了一种重组aav病毒粒子，其包含上述变体aav衣壳蛋白。
103.在一个特定实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，其包含
104.a)本发明中公开的重组腺相关病毒病毒粒子；和
105.b)可药用赋形剂。
106.另一方面，本发明提供了一种重组aav载体，其包含编码本发明的变体aav衣壳蛋白的多核苷酸、aav 5’反向末端重复序列(itr)、编码功能性基因产物的工程化核酸序列、指导所述基因产物在靶细胞中的表达的调控序列和aav 3’itr。
107.在一个特定实施方式中，所述调控序列还包含增强子、启动子、内含子和poly a中的至少一者。
108.另一方面，本发明还提供了一种将编码功能性基因产物的核酸载体递送到细胞和/或组织的方法，所述方法使用本发明的重组aav病毒粒子或重组aav载体。
109.在一个特定实施方式中，本发明还提供了本发明的重组aav病毒粒子或重组aav载体的用途，其用于制备将编码功能性基因产物的核酸载体递送到细胞和/或组织的产品。
110.另一方面，本发明还提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括向需要的对象给药有效量的本发明的重组aav病毒粒子，所述重组aav病毒粒子包含功能性基因产物。
111.在一个特定实施方式中，本发明还提供了本发明的重组aav病毒粒子或重组aav载体的用途，其用于制备在需要的对象中治疗疾病的产品；优选地，所述疾病选自肝病、中枢神经系统疾病和其他疾病。
112.在一个特定实施方式中，所述基因产物是多肽。
113.在一个特定实施方式中，所述多肽选自胱硫醚β
‑
合酶(cbs)、因子ix(fix)、因子viii(f8)、葡萄糖
‑6‑
磷酸酶催化亚基(g6pc)、葡萄糖
‑6‑
磷酸酶(g6pase)、β
‑
葡萄糖醛酸酶(gusb)、血色素沉着症蛋白(hfe)、艾杜糖醛酸2
‑
硫酸酯酶(ids)、α
‑1‑
艾杜糖醛酸酶(idua)、低密度脂蛋白受体(ldlr)、肌磷酸化酶(pygm)、α
‑
n
‑
乙酰葡糖胺糖苷酶(naglu)、n
‑
磺基葡萄糖胺磺基水解酶(sgsh)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(otc)、苯丙氨酸羟化酶(pah)、udp葡萄糖醛酸基转移酶1家族多肽a1(ugt1a1)；优选地，其中所述重组aav病毒粒子包含含有选自如表10中所示的seq id no：2
‑
3、6
‑
7、9
‑
11、13
‑
14、16、20
‑
22、24、25、32
‑
33、37、39、42，优选地选自seq id no：21(aav8
‑
lib20)、seq id no：25(aav8
‑
lib25)、seq id no：9(aav8
‑
lib43)和seq id no：37(aav8
‑
lib44)的氨基酸序列的变体aav8衣壳蛋白，并包含含有seq id no：11的氨基酸序列(aav9
‑
lib46)的变体aav9衣壳蛋白。
114.在一个特定实施方式中，所述多肽选自酸性α
‑
葡萄糖苷酶(gaa)、apali、芳香族l
‑
氨基酸脱羧酶(aadc)、天冬氨酸酰化酶(aspa)、battenin、蜡样脂褐质沉着症神经元蛋白2(cln2)、分化抗原簇86(cd86或b7
‑
2)、胱硫醚β
‑
合酶(cbs)、肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白、共济蛋白(fxn)、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)、谷氨酸脱羧酶1(gad1)、谷氨酸脱羧酶2(gad2)、也被称为β
‑
氨基己糖苷酶α的氨基己糖苷酶aα多肽(hexa)、也被称为β
‑
氨基己糖苷酶β的氨基己糖苷酶bβ多肽(hexb)、白介素12(il
‑
12)、甲基cpg结合蛋白2(mecp2)、肌微管素1(mtm1)、nadh泛醌氧化还原酶亚基4(nd4)、神经生长因子(ngf)、神经肽y(npy)、神经秩蛋白(nrtn)、棕榈酰基
‑
蛋白质硫酯酶1(ppt1)、肌聚糖α、β、γ、δ、ε或ζ(sgca、sgcb、sgcg、sgcd、sgce或sgcz)、与抗体fc融合的肿瘤坏死因子受体(tnfr:fc)、遍在蛋白
‑
蛋白质连接酶e3a(ube3a)、β
‑
半乳糖苷酶1(glb1)；优选地其中所述重组aav病毒粒子包含含有选自seq id no：9(aav9
‑
lib43)和seq id no：11(aav9
‑
lib46)的氨基酸序列的变体aav9衣壳蛋白。
115.在一个特定实施方式中，所述多肽选自腺嘌呤核苷酸转运体(ant
‑
1)、α
‑1‑
抗胰蛋白酶(aat)、水通道蛋白1(aqp1)、atp酶铜转运蛋白α(atp7a)、心肌atp酶ca 转运慢抽搐蛋白2(serca2)、c1酯酶抑制剂(c1ei)、环化核苷酸门控通道α3(cnga3)、环化核苷酸门控通道β3(cngb3)、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(cftr)、α
‑
半乳糖苷酶(aga)、葡萄糖脑苷脂酶(gc)、粒细胞
‑
巨噬细胞集落刺激因子(gm
‑
csf)、hiv
‑
1gag
‑
proδrt(tgaac09)、脂蛋白脂肪酶(lpl)、中链酰基辅酶a脱氢酶(mcad)、肌球蛋白7a(myo7a)、核多聚(a)结合蛋白1(pabpn1)、丙酰辅酶a羧化酶α多肽(pcca)、rab escort蛋白
‑
1(rep
‑
1)、视网膜色素上皮特异性蛋白65kda(rpe65)、视网膜劈裂蛋白1(rs1)、短链酰基辅酶a脱氢酶(scad)、极长链酰基辅酶a脱氢酶(vlcad)。
附图说明
116.图1示出了体内筛选策略的概要。
117.图2示出了筛选结果。a)肝脏的第1周筛选结果。b)脑的第1周筛选结果。c)各种不同组织的第4周筛选结果。起始文库的结果用蓝线标记。
118.图3示出了aav8
‑
vr viii变体的影响。a)用aav8和aav8
‑
vr viii变体转导的hek293t细胞中的萤光素酶表达。moi＝10,000，n＝3。b)在静脉内注射1x 10^10vg的对照aav8和aav8
‑
vr viii变体后3天，c57bl/6j小鼠中的体内萤光素酶表达。阴性对照，pbs注射的动物。在两个独立的生物学重复样中观察到相同的结果。c)在第3、7和14天，c57bl/6j动物或pbs对照中aav8和aav8
‑
vr viii变体的萤光素酶定量。n＝6。数据被报告为平均值
±
sem。d)在第3天，c57bl/6j动物或pbs对照中aav8和aav8
‑
vr viii变体的萤光素酶定量。e)在第7天，c57bl/6j动物或pbs对照中aav8和aav8
‑
vr viii变体的萤光素酶定量。f)在第14天，c57bl/6j动物或pbs对照中aav8和aav8
‑
vr viii变体的萤光素酶定量。
119.图4示出了在注射后第2周，收获肺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、淋巴结、右侧四头肌(lq)、左侧四头肌(lq)和脑，以检查每种组织中的载体基因组拷贝数，n＝6。对于aav8(a)、aav8
‑
lib20(b)、aav8
‑
lib25(c)、aav8
‑
lib43(d)、aav8
‑
lib44(e)、aav8
‑
lib45(f)来说，将不同组织中的绝对gcn一起作图。在两个独立的生物学重复样中观察到相同的结果。
120.图5示出了不同aav8 vr viii变体的肝脏gcn。数据被报告为平均值
±
sem。
121.图6示出了在注射后第2周，我们确定血清丙氨酸转氨酶(alt)水平。在对照(pbs和
aav8)与aav8
‑
vr viii变体之间没有注意到显著变化。
122.图7示出了aav9
‑
vr viii变体的影响。a)在静脉内注射1x10^11vg的对照aav9和aav9
‑
vr viii变体后7天，c57bl/6j小鼠中的体内萤光素酶表达。阴性对照，pbs注射的动物。b)在c57bl/6j动物或pbs对照中aav9和aav9
‑
vr viii变体的萤光素酶定量。数据被报告为平均值
±
sem。c)在c57bl/6j动物或pbs对照的头部中aav9 and aav9
‑
vr viii变体的萤光素酶表达和(d)定量。n＝6。数据被报告为平均值
±
sem.e)aav9和aav9
‑
vr viii变体的头部/身体比率。对于所有上述实验来说，在两个独立的生物学重复样中观察到相同的结果。
123.图8示出了在用aav9和aav9
‑
vr viii变体转导的hek293t细胞中的萤光素酶表达。moi＝10,000，n＝3。
124.图9示出了在注射后第2周，收获组织以检测载体基因组拷贝数，n＝6。对于肝脏(a)、脑(b)、心脏(c)和肺(d)来说，对每种组织中的绝对gcn进行作图。在两个独立的生物学重复样中观察到相同的结果。
125.图11示出了aav2
‑
vr viii变体的影响。a)在用aav2和aav2
‑
vr viii变体转导的hek293t细胞中的萤光素酶表达。moi＝10,000，n＝3。b)在静脉内注射1
×
10^10vg的对照aav2和aav2
‑
vr viii变体后3天，c57bl/6j小鼠中的体内萤光素酶表达。阴性对照，pbs注射的动物。在两个独立的生物学重复样中观察到相同的结果。c)在第3、7和14天，c57bl/6j动物或pbs对照中aav2和aav2
‑
vr viii变体的萤光素酶定量。n＝6。数据被报告为平均值
±
sem。
126.图12示出了aav2
‑
vr viii变体的影响。a)在静脉内注射1
×
10^10vg的对照aav2和aav2
‑
vr viii变体后7天，c57bl/6j小鼠中的体内萤光素酶表达。阴性对照，pbs注射的动物。b)在第7天，c57bl/6j动物或pbs对照中aav2和aav8
‑
vr viii变体的萤光素酶定量。c)静脉内注射1
×
10^10vg的对照aav2和aav2
‑
vr viii变体后14天，c57bl/6j小鼠中的体内萤光素酶表达。阴性对照，pbs注射的动物。d)在第14天，c57bl/6j动物或pbs对照中aav8和aav8
‑
vr viii变体的萤光素酶定量。在两个独立的生物学重复样中观察到相同的结果。
127.图13示出了猴血浆中的hfix表达。
128.详细描述
129.下面本公开的描述仅仅打算说明本公开的各种不同实施方式。就其本身而言，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开范围的限制。对于本领域技术人员来说，显然可以在不背离本公开的范围的情况下制造各种不同的等同物、改变和修改，并且应该理解，这些等同的实施方式应当被包括在本文中。本文中引用的包括出版物、专利和专利申请在内的所有参考文献，整体通过参考并入本文。
130.没有具体数目的指称在本文中用于表示一个或超过一个(即至少一个)指称物。例如，“多肽复合体”意味着一种多肽复合体或超过一种多肽复合体。
131.当在本文中使用时，术语“约”或“大约”是指数量、水平、值、数目、频率、百分率、维度、尺寸、量、重量或长度与参比数量、水平、值、数目、频率、百分率、维度、尺寸、量、重量或长度相比变动多达30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。在特定实施方式中，术语“约”或“大约”当在数值之前时，表示所述值加或减15％、10％、5％或1％的范围。
132.在整个本公开中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”应该被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或成组步骤或要素，但不排除任何其他步骤或要素或成组步骤或要
素。“由
……
构成”意味着包括并限于在短语“由
……
构成”中用
……
表示的要素。因此，短语“由
……
构成”表明所列出的要素是必需且强制性的，并且不可以存在其他要素。“基本上由
……
构成”意味着包括用
……
表示的任何要素，并限于不干扰或有助于本公开中指明的所列出的要素的活性或作用的其他要素。因此，短语“基本上由
……
构成”表明所列出的要素是必需且强制性的，但其他要素是可选的，并且取决于它们是否影响所列出的要素的活性或作用，可以存在或可以不存在。
133.药物组合物
134.本公开还提供了一种药物组合物，其包含本文中提供的多肽复合体或双特异性多肽复合体和可药用载体。
135.术语“可药用”表明所指定的载体、介质、稀释剂、赋形剂和/或盐总体与构成所述剂型的其他成分在化学和/或物理上相容，并且与其接受者在生理上相容。
[0136]“可药用载体”是指药物剂型中除了活性成分之外的其他成分，其对于对象来说具有可接受的生物活性并且无毒性。在本文公开的药物组合物中使用的可药用载体可以包括例如可药用液体、凝胶或固体载体、水性介质、非水性介质、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮/调配剂、多价螯合或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒性辅助物质、本领域中已知的其他组分或其各种不同组合。
[0137]
治疗方法
[0138]
还提供了治疗方法，其包括：向需要的对象给药治疗有效量的本文中提供的多肽复合体或双特异性多肽复合体，从而治疗或预防病症或障碍。在某些实施方式中，所述对象已被鉴定为患有可能对本文中提供的多肽复合体或双特异性多肽复合体做出响应的障碍或病症。
[0139]
当在本文中使用时，术语“对象”包括任何人类或非人类哺乳动物。术语“非人类哺乳动物”包括所有脊椎动物例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长动物、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非另有说明，否则术语“患者”或“对象”可互换使用。
[0140]
术语“治疗”和“治疗方法”是指治疗性治疗和预防性措施两者。需要治疗的个体可以包括已经患有特定医学障碍的个体以及最终可能获得所述障碍的个体。
[0141]
在某些实施方式中，所述病症和障碍包括肿瘤和癌症，例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肾细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、蕈样真菌病、梅克尔细胞癌和其他血液系统恶性肿瘤，例如经典霍奇金淋巴瘤(chl)、原发性纵隔大b细胞淋巴瘤、富含t细胞/组织细胞的b细胞淋巴瘤，ebv阳性和阴性ptld以及ebv相关弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、浆母细胞性淋巴瘤，结外nk/t细胞淋巴瘤、鼻咽癌和hhv8相关原发性弥漫性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、中枢神经系统(cns)的肿瘤例如原发性cns淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干神经胶质瘤。
实施例
[0142]
实施例1：设备和试剂
[0143]
表1.在本发明中使用的设备
[0144][0145][0146]
表2.本研究中使用的试剂和供应商
[0147]
[0148]
[0149][0150]
表3.本研究中使用的各种寡核苷酸
[0151]
[0152][0153]
表4.用于扩增paav
‑
rc9
‑
文库片段1的引物
[0154]
[0155][0156]
表5.用于扩增paav
‑
rc9
‑
文库片段2的引物
[0157]
[0158][0159]
实施例2：方法
[0160]
细胞培养
[0161]
hek293t细胞购自atcc(atcc,manassas,va)。hek293t细胞维持在含有dmem(gibco,grand island,ny)、10％fbs(corning,manassas,va)、1％anti
‑
anti(gibco,grand island,ny)的完全培养基中。将hek293t细胞在贴壁培养中使用15cm培养皿(corning,corning,ca)在37℃和5％co2下的加湿气氛中生长，并在用胰蛋白酶
‑
edta(gibco,grand island,ny)在温箱中处理2
‑
5min，清洗并重悬浮在新的完全培养基中后进行传代培养。
[0162]
aav质粒的构建
[0163]
质粒paav
‑
rc8含有来自于aav2的rep编码序列和来自于aav8的cap编码序列。我们在paav
‑
rc8质粒中产生了位于rep2基因上游的含有5’mlui和aav的天然启动子的片段，为此使用了下述正向引物：
[0164]5’‑
taagccaactagtggaaccggtgcggccgcacgcgtggagtttaagcccgagtgagcacgcagggtctccattttgaagcgggaggtttgaacgcgcagccgccatgccggggtt
‑3’
和
[0165]
反向引物：
[0166]5’‑
gaagataaccatcggcagccatttaattaaacctgatttaaatcatttattgttcaaag
‑3’
。
[0167]
为了替换野生型aav8的vr viii序列，我们在8型荚膜(cap8)基因的1756bp和1790bp中引入了ndei和xbai限制性位点，以便通过从质粒paav
‑
rc8高保真pcr扩增两个dna片段来产生cap8区。
[0168]
一个片段的产生使用了下述正向引物：
[0169]5’‑
ctttgaacaataaatgatttaaatcaggtttaattaaatggctgccgatggttatcttc
‑3’
，和
[0170]
反向引物：
[0171]5’‑
ttccaatttgaggagccgtgttttgctgctgcaacatatggttatctgccacgataccgtatt
‑3’
；
[0172]
另一个片段的产生使用了下述正向引物：
[0173]5’‑
acacggctcctcaaattggaatctagactgtcaacagccagggggccttacccggtatggtctg
‑3’
，和
[0174]
反向引物：
[0175]5’‑
gccaactccatcactaggggttcctgcggccgctcggtccgcacgtggttacctacaaaatgctagcttacagattacgggtgaggtaacg
‑3’
。
[0176]
将质粒pssaav
‑
cmv
‑
gfp
‑
mut用noti(neb,ipswich,ma)消化。将所述三个片段和线性化的载体(pssaav
‑
cmv
‑
gfp
‑
mut)用neb hifibuilder(neb,ipswich,ma)组装在一起。具有正确取向和序列的组装产物被称为pitr2
‑
rep2
‑
cap8
‑
itr2。
[0177]
然后我们合成了52个两侧带有与cap8基因相同的20nt交叠序列的vr viii寡核苷酸序列(genewiz)。使用这52个序列分别替换aav8衣壳骨架的vr viii，将它们进一步亚克
隆在含有所述修饰的衣壳序列和来自于aav2的rep和反向末端重复序列(itr)的一体化构建物中(图1a)。将质粒pitr2
‑
rep2
‑
cap8
‑
itr2用酶ndei(neb,ipswich,ma)和xbai(neb,ipswich,ma)消化以便线性化，产生载体骨架。为了替换野生型aav8 vr viii区，将每个vr viii寡核苷酸分别与线性化的pitr2
‑
rep2
‑
cap8
‑
mut
‑
itr2载体组装。具有正确的取向和序列的组装产物被称为pitr2
‑
rep2
‑
cap8
‑
library
‑
itr2。因此，我们产生了52种不同的pitr2
‑
rep2
‑
cap8
‑
library
‑
itr2质粒。
[0178]
为了产生重组paav
‑
rc8
‑
library质粒，使用neb hifi builder(neb,ipswich,ma)将来自于所选pitr2
‑
rep2
‑
cap8
‑
library
‑
itr2质粒的2.2kb的完整cap8
‑
library片段与来自于paav
‑
rc8的5.2kb的骨架组装在一起。简单来说，所述完整cap8
‑
library区通过质粒pitr2
‑
rep2
‑
cap8
‑
library
‑
itr2的高保真pcr扩增来产生，使用了正向引物5
’‑
gcatctttgaacaataaatgatttaaatcaggtatggctgccgatggttatct
‑3’
和反向引物5
’‑
gtttattgattaacaagcaattacagattacgggtgaggt
‑3’
。所述载体骨架通过质粒paav
‑
rc8的高保真pcr扩增来产生，使用了正向引物5
’‑
ttgcttgttaatcaataaaccg
‑3’
和反向引物5
’‑
acctgatttaaatcatttattgttcaaagatgc
‑3’
。具有正确的取向和序列的组装产物被称为paav
‑
rc8
‑
library。
[0179]
质粒paav
‑
rc9含有由genewiz合成的来自于aav2的rep编码序列和来自于aav9的cap编码序列。完整cap9
‑
library区通过从质粒paav
‑
rc9高保真pcr扩增两个dna片段来产生。一个片段使用表4中的引物集产生，另一个片段使用表5中的引物集产生。paav
‑
rc9的线性载体骨架也通过质粒paav
‑
rc9的高保真pcr扩增产生，使用了正向引物5
’‑
ttgcttgttaatcaataaaccg
‑3’
和反向引物5
’‑
acctgatttaaatcatttattgttcaaagatgc
‑3’
。使用nebhifi builder(neb,ipswich,ma)将所述两个dna片段和线性化的载体(paav
‑
rc9)组装在一起。具有正确的取向和序列的组装产物被称为paav
‑
rc9
‑
library。
[0180]
表6：带有52种独特vr viii dna序列的aav变体。参照aav8的vr viii的突变用红色标注。我们命名为aav8
‑
lib40的wt aav8 vrviii用蓝色标注。
[0181]
[0182]
[0183][0184]
aav衣壳文库包装
[0185]
aav衣壳文库的包装和纯化如以前所描述的来进行，并做出了一些修改。简单来说，将hek293t细胞用23.7μg各个pitr2
‑
rep2
‑
cap8
‑
library
‑
itr2质粒和38.7μg phelper(cell biolabs)共同转染用于分别包装。使用聚乙烯亚胺(pei，直链，mw 25000，polysciences,inc.,warrington,pa)作为转染试剂。在转染后72hrs使用细胞铲(fisher scientific,china)收获细胞，进行3轮冻融以回收细胞内部的aav变体。然后将细胞裂解液用全能核酸酶(emd millipore,denmark,germany)消化，并使用特异性针对rep基因的引物(正向：5
’‑
gcaagaccggatgttcaaat
‑3’
，反向：5
’‑
cctcaaccacgtgatccttt
‑3’
)通过sybr green qpcr(applied biosystems,woolston warrington,uk)进行滴定。然后将5
×
109vg的每种aav变体混合在一起。然后将所述混合物在快速密封聚丙烯管(beckman coulter,brea,ca)中在碘克沙醇梯度(sigma,st.louis,mo)上纯化，然后使用hitrap q hp(ge healthcare,piscataway,nj)通过离子交换层析进行纯化。使用具有150k截留分子量(mwco)的离心管式离心浓缩器(orbital biosciences,topsfield,ma)通过离心来浓缩洗脱液。在纯化后，再次使用用于rep基因的引物集通过qpcr对含有52种aav vr viii变体的混合物进行定量，并稀释成两部分。第一部分含有三个独立的等分试样，充当选择前的对照病毒混合物。第二部分被用于以每只动物2.5
×
10
11
vg的量尾静脉注射到c57bl/6j小鼠中，
用于体内选择。
[0186]
在包装raav
‑
萤光素酶和raav
‑
hfix载体时，将hek293t细胞用对于每个包装来说等摩尔量的下述载体共转染：i)paav
‑
rc8或所选的paav
‑
rc8
‑
library和paav
‑
rc9
‑
library质粒；ii)相应的paav
‑
cmv
‑
luciferase或paav
‑
ttr
‑
hfix；iii)phelper。质粒使用endofree质粒试剂盒(qiagen,hilder,germany)来制备。转染、病毒收获和纯化步骤与上文提到的aav vr viii变体的包装相同。所述raav
‑
luciferase载体的基因组滴度使用特异性针对cmv启动子的引物(正向：5
’‑
tcccatagtaacgccaatagg
‑3’
，反向：5
’‑
cttggcatatgatacacttgatg
‑3’
)通过qpcr来定量。所述raav
‑
hfix载体的基因组滴度使用特异性针对ttr启动子的引物(正向：5
’‑
tcccatagtaacgccaatagg
‑3’
，反向：5
’‑
cttggcatatgatacacttgatg
‑3’
)通过qpcr来定量。raav8
‑
和raav9
‑
luciferase载体的物理滴度如下所述来评估(数据未示出)。raav的纯度通过sds
‑
page银染来评估，具有～90％纯度的载体被用于我们的研究中(数据未示出)。
[0187]
靶向肝的变体的体内选择
[0188]
所有动物工作在由wuxi apptec(shanghai)动物护理和使用管理委员会批准的方案下，按照管理指南来进行。将6至8周龄的雄性c57bl/6j小鼠(shanghai slac laboratory animal co.,ltd.)用如上所述的aav vr viii变体的混合物尾静脉注射。在注射后第1、2和4周，在用异氟烷麻醉后通过颈椎脱位法将动物安乐死。对于第1和2周来说，收获肝脏和脑，并且对于第4周来说，收获肺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、淋巴结、四头肌和脑。然后使用dneasy血液和组织试剂盒(qiagen)按照制造商的方案提取总dna，然后通过下一代测序进行分析，以比较选择之后相比于选择之前的aav读出序列计数。
[0189]
表7：选出的用于进一步体外和体内验证的aav8 vr viii变体的名单。示出了变体名称和它们的用dna和aa表示的vr viii序列。参照aav8的vr viii的突变用红色标注。
[0190][0191]
表8.带有52种独特vr viii dna序列的aav变体。参照aav9的vr viii的突变用红色标注。我们命名为aav9
‑
lib38的wt aav9 vr viii用蓝色标注。
[0192]
[0193]
[0194][0195]
表9：选出的用于进一步体外和体内验证的aav9变体的名单。示出了变体名称和它们的用dna和aa表示的vr viii序列。参照aav9的vr viii的突变用红色标注。
[0196][0197][0198]
定量组织中的aav基因组读出序列的下一代测序
[0199]
使用引物集(正向：5
’‑
caaaatgctgccagagacaa
‑3’
和反向：5
’‑
gtccgtgtgaggaatcttgg
‑3’
)对来自于注射前对照病毒混合物的dna和从各种不同组织分离
的总dna进行pcr，以扩展vr viii区。将具有正确大小的pcr产物凝胶纯化(zymo research,irvine,ca)，然后通过nanodrop分光光度计定量。将这些产物在wuxi nextcode使用illumina hiseq x通过下一代测序进行分析。在所述分析期间，通过每个vr viii dna序列分离读出序列并且不允许错配。然后我们得到了在每种实验条件中各个vr viii的绝对读出序列计数。然后我们将所述数据转变成相对读出序列计数，以归一化不同时间点和不同组织的差异。
[0200]
通过elisa进行的aav粒子的滴定
[0201]
aav粒子浓度通过progen aav8滴定elisa试剂盒(progen biotechnik gmbh,heidelberg,germany)，针对在所述elisa试剂盒中制备的标准曲线来确定。简单来说，将重组腺相关病毒8参比标准品储用物(raav8
‑
rss，atcc，vr
‑
1816)和样品用即用型样品缓冲液稀释，以便可以在elisa的线性范围(7.81
×
106–
5.00
×
108个衣壳/ml)内测量它们。将raav8
‑
rss在1:2000至1:16000的范围内稀释，而将样品在1:2000至1:256000之间稀释。将100μl即用型样品缓冲液(空白)、标准品和样品的连续稀释液(两者均在即用型样品缓冲液中稀释)移取到微量滴定板条的孔中。提供用附着性铝箔密封的条板并在37℃温育1h。接下来，将所述板排空并用200μl即用型样品缓冲液清洗三次。将100μl生物素偶联物移取到孔中并用附着性铝箔密封条板。在37℃下温育1小时后，将所述板排空并清洗三次。然后向所述孔添加100μl链亲合素偶联物并在37℃温育1小时。如上所述重复清洗步骤，并将100μl底物移取到所述孔中。将板在室温温育15分钟，通过在每个孔中添加100μl终止溶液来终止显色反应。在30分钟内使用光度计在450nm波长处测量显色反应的强度。
[0202]
体外感染性
[0203]
在转染前16hrs将hek293t细胞接种在96孔细胞培养板(corning,wujiang,js)中。将细胞模拟感染或分别用raav
‑
vr viii变体以moi＝10,000感染，在无血清和抗生素的dmem中2hrs。在感染后48hrs，将所述细胞裂解，使用bright
‑
glo
tm
萤光素酶测定系统(promega,madison,wi)按照制造商的说明书检测萤光素酶表达。
[0204]
十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺
[0205]
对于十二烷基硫酸钠
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds
‑
page)分析来说，将样品在nupage还原试剂和nupage lds样品缓冲液(两者均来自于invitrogen,cartsbad,ca)中，在100℃变性10min，然后载样到nupage 4
–
12％bis
‑
tris小型凝胶(invitrogen,cartsbad,ca)上。在电泳后，使用快速银染试剂盒(beyotime,shanghai,china)将凝胶银染。使用白光箱和适合的成像系统观察凝胶。
[0206]
体内raav
‑
萤光素酶和血清alt检测
[0207]
通过尾静脉注射将6至8周龄的雄性c57bl/6j小鼠用适合量的raav
‑
luciferase载体注射。在病毒注射后第3天、第1周和第2周检测生物发光。在每次检测之前，小鼠通过腹膜内注射接受15mg/ml d
‑
萤光素(perkinelmer)。在d
‑
萤光素注射后10mins，所述小鼠接受使用异氟烷的麻醉。使用xenogen lumina ii小型动物体内成像系统(perkinelmer)来选择感兴趣的区域(roi)，定量并分析作为光子/秒/cm2/球面度(p/sec/cm2/sr)呈现的信号。在第2周的生物发光检测后，使用10％co2将动物安乐死，然后收集血清和组织用于血清丙氨酸转氨酶(alt)检测和基因组拷贝数检测。alt水平通过丙氨酸转氨酶活性测定试剂盒(sigma)按照制造商的方案来确定。
[0208]
体内raav
‑
hfix转导
[0209]
首先在6至8周龄雄性野生型c57bl/6j小鼠中，通过评估载体的尾静脉注射后血浆中的hfix水平来评估raav
‑
hfix基因转移效率的潜能。接下来，将从shanghai model organisms购买的在c57bl/6j背景下的6至8周龄雄性f9 ko小鼠用适合量的aav载体通过尾静脉注射进行注射，以评估效能。
[0210]
组织、血浆和血清收集
[0211]
在病毒注射后的适合时间，通过框后放血收集血液。对于最终取血来说，在co2安乐死后立即进行心脏穿刺以收集血液，然后使用pbs灌注以收获肝脏。将最大的肝叶用10％中性缓冲福尔马林(nbf)固定，用于病理学检查。收集其他肝叶的两个独立的取样，快速冷冻并维持在
‑
80℃下，用于基因组拷贝数检测。对于血清收集来说，将血液在4℃下放置2hrs。然后将血液以8000rpm离心15mins并吸出上清液。对于血浆收集来说，将血液以9:1的比例添加到3.8％柠檬酸钠中。然后将所述混合物以8000rpm离心5mins并吸出上清液。所述血清和血浆被维持在
‑
80℃下。
[0212]
hfix表达和活性的检测
[0213]
hfix表达水平通过酶联免疫吸附测定法(elisa)(affinity biologicals,ancaster,on,canada)，按照制造商的方案来确定。简单来说，将平底96孔板用针对人类因子ix的山羊抗体包被。使用血浆校准品的连续稀释液(0.0313
‑
1iu/ml)来制造标准品。将小鼠血浆在样品稀释缓冲液中1:200稀释，并向孔添加100μl样品和标准品。在室温温育1小时后，将板排空并用300μl稀释的清洗缓冲液清洗三次。然后将板在室温下与100μl辣根过氧化物酶(hrp)偶联的第二抗体溶液温育30分钟。在最后的清洗步骤后，使用四甲基联苯胺(tmb)底物测量hrp活性。在10分钟后使用终止溶液终止显色反应，并在30分钟内在450nm处用分光光度计读数。参比曲线是吸光值对因子ix浓度的对数
‑
对数图，并且可以从所述参比曲线读出血浆样品中的因子ix含量。
[0214]
小鼠中的hfix活性使用rox因子ix活性测定试剂盒(rossix,mo
¨
lndal,sweden)，按照制造商的方案在产色测定法中确定。简单来说，使用稀释剂缓冲液中的正常人类血浆制备范围为25％至200％活性(100％活性被定义为血浆中的1iu/ml因子ix)的标准品稀释液。将实验血浆样品在稀释剂缓冲液中1:320稀释，并向低结合性96孔微孔板添加25μl样品和标准品。向所述孔添加25μl试剂a(含有冻干的人类因子viii、人类因子x、牛因子v和血纤蛋白聚合抑制剂)，并在37℃下温育4分钟。然后向所述孔添加150μl试剂b(含有冻干的人类因子xia、人类因子ii、氯化钙和磷脂)。在37℃下8分钟后，通过添加50μl因子xa底物(z
‑
d
‑
arg
‑
gly
‑
arg
‑
pna)结束活化的因子x的生成，并在405nm处读取吸光值。将最大吸光值变化/分钟(δa405max/min)对因子ix活性在对数
‑
对数图中作图，并且可以使用参比曲线计算样品的因子ix活性。
[0215]
体内病毒基因组拷贝数
[0216]
使用sybr green(applied biosystems,woolston warrington,uk)的绝对qpcr被用于定量aav病毒基因组拷贝数。使用dneasy血液和组织试剂盒(qiagen,hilden,germany)，按照制造商的方案从各种不同组织提取总dna。使用nanodrop分光光度计确定总dna浓度，并将来自于每个样品的40ng dna作为模板用于qpcr。qpcr在所有组织样品和对照上进行，使用特异性针对cmv启动子的引物(正向：tcccatagtaacgccaatagg，反向：
cttggcatatgatacact tgatg)一式三份进行。使用具有2.89
×
101、2.89
×
102、2.89
×
103、2.89
×
104、2.89
×
105、2.89
×
106、2.89
×
107拷贝数(0.0002、0.002、0.02、0.2、2、20、200pg)的线性化pssaav
‑
cmv
‑
luci
‑
mut质粒产生用于计算拷贝数的标准曲线。
[0217]
实施例3：体内选择
[0218]
52种不同的vr viii序列(表6)相应的genbank id概述在表7中。使用这52个序列分别替换aav8衣壳骨架的vr viii，将它们进一步亚克隆在含有所述修饰的衣壳序列和来自于aav2的rep和反向末端重复序列(itr)的一体化构建物中。这些构建物被分别用于包装野生型样aav粒子，然后以等量的病毒基因组混合在一起，然后纯化。将所述纯化的aav变体文库分成两个部分。一个部分作为起始文库基线被用于ngs检测(n＝3)。另一个部分进行系统性递送，用于体内选择以分离靶向肝脏和脑的aav变体(图1)。值得注意的是，所述设计将包括wt aav8或aav8
‑
lib40在内的所有可用的独特vr viii序列包含在我们的筛选中(表6)。在筛选和选择过程中，我们使用aav8
‑
lib40作为我们的内部对照。
[0219]
在给药后第1周，收获肝脏和脑。与起始文库和aav8
‑
lib40相比，我们能够鉴定到在肝脏(图2a)和脑(图2b)中富集的几种变体。在给药后第4周，也收获肺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、淋巴结、四头肌(qa)和脑，以评估生物分布。我们能够鉴定到与其他组织相比优选地靶向肝脏或脑的变体(图2c，表10)。
[0220]
表10.显示出提高的肝脏靶向的变体，归一化到作为基线的wt aav8(100％)。
[0221]
[0222][0223]
尽管在纯化之前我们能够分别滴定所有aav vr viii变体用于混合相等的量和纯化，但我们未能在我们的起始文库和筛选两者中通过ngs检测到aav8
‑
lib26(图2a
‑
c)。这暗示aav8
‑
lib26中的突变可能不依从当前的aav纯化方法。除此之外，我们得出结论，我们的衣壳文库设计和筛选策略产生具有高存活力的aav病毒粒子，其促进了靶向肝脏和脑的变体的富集。
[0224]
为了进一步确认基因递送能力，将选出的vr viii序列(表8)亚克隆到重组aav衣壳质粒中，用于萤光素酶报告基因的包装。aav8
‑
lib25和aav8
‑
lib43在体外表现出明显更高的转入基因表达(图3a)。重要的是，我们发现大多数新的aav变体在体内转导中显示出非常显著的提高(图3b
‑
3e)。作为阴性对照，在我们的筛选中vr viii被下调的aav8
‑
lib45在体外(图3a)和体内(图3b和3c)均显示出显著降低的转导。这些结果在某种程度上验证了我们的筛选过程和结果。
[0225]
此外，当我们系统性表征它们的生物分布时，我们确认了这些变体维持肝脏靶向特性，正如由与其他组织相比肝脏中占优势的gcn所指示的(图4a
‑
e)。重要的是，aav8 vr viii变体与aav8相比肝脏基因组拷贝数明显更高(图5)，进一步确定了提高的靶向能力。另一方面，aav8
‑
lib45显示出明显更低的gcn，进一步确认了我们的筛选策略(图5)。
[0226]
作为基因疗法载体，最重要的是具有良好的安全特性。为此，我们检测了作为肝脏毒性的重要标志物的血清丙氨酸转氨酶(alt)水平。对于所有组来说，alt水平维持低于基
线(图6)。这些结果表明aav8vriiii变体可以充当用于肝脏的可选基因递送工具。
[0227]
由于我们已经鉴定到用于将基因递送到脑的有前途的vr viii序列，因此我们假设用脑富集性vr viii序列替换aav9的wt vr viii(图2b)将产生具有更高cns靶向能力的变体。为了试验这个假设，使用aav9
‑
vr viii衣壳(表9)包装带有萤光素酶报告基因的遗传负荷，用于评估转导效率。我们发现在体内，aav9
‑
lib46与wt aav9相比显示出明显更高的转入基因表达(图7a和7b)。有趣的是，aav9
‑
lib31、aav9
‑
lib33以及特别是aav9
‑
lib43显示出外周组织弃靶性，同时维持可比的cns基因递送(图7a)。为此目的，我们特别比较并定性研究了头部中的萤光素酶表达(图7c和7d)，并发现了转入基因表达的头部/身体比率的急剧变化(图7g)。
[0228]
然后，我们测试了我们的主要候选物aav9
‑
lib43和aav9
‑
lib46的体外转导。在感染hek293t细胞后，aav9
‑
lib43显示出显著降低的转入基因表达(图8)，并且aav9
‑
lib46显示出显著提高的转入基因表达(图8)。这些数据与它们在体内的全身表达相一致(图7a和7b)。
[0229]
接下来，我们剖析了aav9和aav9 vr viii变体的生物分布。由于公知aav9对肝脏、心脏和cns具有趋向性，我们观察到在肝脏中aav9
‑
lib31、aav9
‑
lib33和aav9
‑
lib43的gcn明显降低并且aav9
‑
lib46的gcn更高(图9a)，这与转入基因表达结果相一致(图8a)。aav9
‑
lib43和aav9
‑
lib46在脑中表现出明显提高的gcn(图9b)。尽管并不显著，但我们也在心脏和肺中观察到gcn提高(图9c和9d)。此外，在aav9 vr viii变体介导的基因递送后，没有检测到alt升高(图10)。这些结果表明，aav9 vriiii变体在系统性基因递送后可以充当用于cns的可选基因递送工具。
[0230]
实施例4：aav2 vr viii变体
[0231]
使用表11中列出的5个序列分别替换aav2衣壳骨架的vr viii(对应于wt aav2 yp_680426.1(genbank：nc_001401.2)的第582
‑
594位氨基酸)，将它们进一步亚克隆在含有所述修饰的衣壳序列和来自于aav2的rep和反向末端重复序列(itr)的一体化构建物中。这些构建物被分别用于包装野生型样aav粒子，然后以等量的病毒基因组混合在一起，然后纯化。将所述纯化的aav变体文库分成两个部分。一个部分作为起始文库基线被用于ngs检测(n＝3)。另一个部分进行系统性递送，用于体内选择以分离靶向肝脏和脑的aav变体。
[0232]
为了进一步验证基因递送能力，将选出的vr viii序列(表11)亚克隆在重组aav2衣壳质粒中，用于萤光素酶报告基因的包装。aav2
‑
lib20、aav2
‑
lib25、aav2
‑
lib43、aav2
‑
lib44、aav2
‑
lib45在体外表现出明显更低的转入基因表达(图11a)。重要的是，我们发现大多数新的aav变体在体内转导中显示出非常显著的降低(图11b
‑
11c和图12a
‑
d)。
[0233]
表11：被选出用于进一步体外和体内验证的aav2 vr viii变体的名单。示出了所述变体名称和它们的用dna和aa表示的vr viii序列。
[0234]
参照aav2的vr viii的突变用粗体标明。
[0235][0236][0237]
实施例5：使用用于包装遗传负荷的raav将核酸载体递送到细胞和/或组织，所述遗传负荷包含含有编码感兴趣的蛋白质或多肽的序列的异源核酸区
[0238]
所述感兴趣的蛋白质或多肽是在表12
‑
14中描述的蛋白质或多肽。
[0239]
将aav8
‑
hfix、aav8
‑
lib25
‑
hfix和aav8
‑
lib43
‑
hfix以5e12vg/kg的剂量注射到3
‑
4岁的雄性食蟹猴中，参与这些实验的猴经测试均具有<1:50的针对aav8的中和抗体滴度。在给药前和给药后第3天、第1周、第2周和第3周收获血液样品，通过elisa检测血浆中的hfix表达。结果显示aav8、aav
‑
lib25和aav8
‑
lib43都可以在猴中高效表达hfix，aav8
‑
lib25表达比aav8和aav8
‑
lib43更高的hfix(图13)。
[0240]
表12.示例性的感兴趣的蛋白质和多肽(肝病)
[0241]
[0242][0243]
表13.示例性的感兴趣的蛋白质和多肽(cns疾病)
[0244]
[0245]
[0246]
[0247][0248]
表14.示例性的感兴趣的蛋白质和多肽(其他疾病)
[0249]
[0250]
[0251][0252]
本发明的实施方式已在上文描述，但本发明不限于此，并且本领域技术人员可以理解，可以在本发明的主旨范围内做出修改和改变。所述修改和改变的方式将落于本发明的保护范围之内。