调控反刍动物瘤胃微生物发酵的植物源天然化合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及植物源天然化合物，本发明进一步涉及调控反刍动物瘤胃微生物发酵的植物源天然化合物及其在促进反刍动物瘤胃微生物发酵中的应用，属于植物源天然化合物及其应用领域。


背景技术：

2.反刍动物主要包括奶牛、肉牛、山羊和绵羊等，是畜产品肉和奶的重要来源，对于提升国民营养水平、保障身体健康具有重要意义。瘤胃是反刍动物四个胃之一，体积占90%以上，是最重要的胃，负责将纤维素、蛋白质等饲料消化成糖和氨基酸，为动物机体提供能量和氮源，是“吃草产奶（肉）”的核心转化工厂。瘤胃中栖息着大量微生物，包括细菌、真菌、原虫和古菌等，微生物发酵过程中将牧草、玉米、豆粕等饲料，消化分解成单糖、氨、氨基酸、挥发性脂肪酸等营养物质，所以瘤胃微生物发酵能力和效率是决定饲料转化效率、动物健康和生产性能的决定因素之一。
3.针对瘤胃微生物发酵的饲料调控剂比较多，包括天然植物源和化工合成类化合物，主要靶向不同发酵功能提供调控功能。比如，针对瘤胃微生物甲烷产生，开发了莫能菌素、丝兰皂苷提取物、植物精油等调控剂，抑制瘤胃甲烷产生，促进瘤胃发酵；针对瘤胃微生物产酸过多，开发了碳酸氢钠、莫能菌素等调控剂，抑制淀粉分解产酸；针对瘤胃微生物纤维分解效率低，开发了纤维素酶、半纤维素酶等调控剂，促进纤维分解利用；针对瘤胃微生物产氨过快，开发了莫能菌素、缩合单宁等调控剂，减缓了氨氮释放速度。
4.在瘤胃微生物发酵中，氨氮产生和产气量是两个重要功能，涉及能量与氮的同步释放与平衡利用，对提升瘤胃发酵功能具有重要意义。瘤胃氨氮由微生物分泌的酶催化产生，主要来源于含氮化合物比如氨基酸、肽、非蛋白氮等的分解，氨是瘤胃微生物蛋白合成的主要氮源，为动物机体提供60
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70%可代谢蛋白。但是，瘤胃微生物产氨活性偏强，导致氨氮释放速度快，降低了微生物对氨的利用效率，多余的氨随着粪便排出体外，既会造成氮的浪费，也会导致环境氮排放污染。因此，抑制瘤胃微生物产氨活性对于提供反刍动物氮利用率，减少氮向环境排放，提供生产性能均具有重要意义。产气量是评价瘤胃微生物发酵的重要指标，产气量升高代表微生物生长速度快、活力强、代谢旺盛、发酵水平高，对营养素尤其是能量和氮利用率高。
5.针对瘤胃微生物氨氮产生和产气量这些发酵指标，目前常用的调控剂包括化工合成类和天然植物源化合物。化工合成类化合物，比如莫能菌素，易在动物肉或奶中残留，对动物健康和人体健康有潜在风险，尤其是抗生素类化合物易产生耐药性。天然植物源化合物安全性更高一些，但目前开发的种类偏少，其中缩合单宁应用较多，但存在抗营养、抑制微生物发酵等问题，会干扰葡萄糖、蛋白质和维生素等营养物质的吸收和消化，能增加小肠粘膜细胞的通透性，导致更多物质进入肠道而产生危害作用。
6.来源于植物的天然化合物具有低毒性、高安全性、高生物利用度、多功能性等优点，且多数植物还属于动物在野生状态下的采食原料，更符合动物机体的利用规律，不会对
动物产生明显的毒副作用，不容易产生抗药性，且对生态环境友好。原小檗碱型天然植物源化合物，比如小檗碱、表小檗碱、黄连碱，主要来源于黄连、黄柏等植物，被添加到饲料中，仅限于抑菌、抗腹泻的用途。
7.鉴于此，开发新的原小檗碱型植物源天然化合物调控瘤胃微生物发酵，对于提高氮的利用效率，减少氮的排放，保证动物健康等具有重要的意义。


技术实现要素：

8.本发明的目的之一是提供调控反刍动物瘤胃微生物发酵的植物源天然化合物；本发明的目的之二是将所述的植物源天然化合物应用于调控反刍动物瘤胃微生物发酵。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：调控反刍动物瘤胃微生物发酵的原小檗碱型化合物，其结构式为式i所示：式i其中，r1、r2、r3、r4相同或各不相同，选自
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och3基团或
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oh基团；或r1 r2以及r3 r4均为
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och2o
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基团。
10.作为本发明优选的实施方案，r3 r4为
‑
och2o
‑
基团，r1、r2为
‑
och3基团或r1 r2为
‑
och2o
‑
基团。
11.作为本发明最优选的实施方案，式i化合物选自下式ⅱ或式ⅲ所示的化合物：式
ⅱꢀ
式ⅲ本发明中式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ所示化合物的酸加成的盐或水合物也包括在本发明之中；所述化合物的酸加成的盐可以是盐酸、醋酸、硫酸等酸加成无毒的盐，其它的盐也包括在本发明之中。
12.本发明进一步提供了式ⅰ、式ⅱ或式ⅲ所示化合物或其盐作为饲料添加剂促进反刍动物瘤胃微生物发酵中的应用；作为本发明一种优选的具体实施方案，所述促进反刍动物瘤胃微生物发酵包括减缓或抑制瘤胃微生物产氨活性、提高微生物产气量或提高瘤胃氮的利用效率。
13.本发明进一步提供了一种促进反刍动物瘤胃微生物发酵的组合物，包括权利要求
1
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3任何一项所述化合物或其盐以及制剂用的辅料或载体。
14.本发明还提供了一种非治疗目的的促进反刍动物瘤胃微生物发酵的方法，包括将式i所示的化合物或其盐施用于反刍动物；所述的促进反刍动物瘤胃微生物发酵包括减缓瘤胃微生物产氨活性、促进微生物产气量或提高瘤胃氮的利用效率。
15.作为本发明一种优选的具体实施方案，将式i所示的化合物施用于反刍动物的方法，包括：(1)将式i所示的化合物或其盐直接饲喂反刍动物，或者是将式i所示的化合物或其盐与其它的其它的促进反刍动物瘤胃微生物发酵的成分混合在一起饲喂反刍动物；或者(2)将式i所示的化合物或其盐添加到反刍动物的基础日粮中，按照常规的饲喂方式饲喂反刍动物；或者（3）将式i所示的化合物或其盐与微量元素以及维生素等混合在一起制备成预混物料饲喂反刍动物；或者（4）将式i所示的化合物或其盐与蛋白质以及能量饲料混合在一起制备成精料混合物料饲喂反刍动物。
16.为了实现更佳的减缓瘤胃微生物产氨活性或促进微生物产气量的效果，将式i所示的化合物或其盐施用于反刍动物至其在反刍动物瘤胃中的终浓度优选为0.67~5.25 μmol/l。
17.本发明从100种植物源天然化合物筛选得到了能够有效促进反刍动物瘤胃微生物发酵的结构式为式ⅰ所示的植物源天然化合物，这些化合物具有包括减缓或抑制瘤胃微生物产氨活性、提高微生物产气量或提高瘤胃氮的利用效率等活性。其中，式ⅱ和式ⅲ所示的化合物可以显著降低瘤胃中氨氮的生成，分别降低16.13
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22.15%、15.95
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29.8%；这两种化合物有效促进瘤胃微生物发酵，产气量分别增加25.1%、22.12%。
18.本发明进一步提供了一种非治疗目的的促进反刍动物瘤胃微生物发酵的方法，包括将所述化合物或其盐作为饲料添加剂施用于反刍动物，有效减缓瘤胃微生物产氨活性、促进微生物产气量。
19.本发明整体技术方案详述植物源天然化合物的筛选与鉴定本发明首先提取瘤胃微生物粗酶液。在此基础上测定100种植物源天然化合物对瘤胃微生物产氨活性的减缓作用。结果发现，100种天然化合物作用后的瘤胃微生物粗酶液的产氨活性中，有10种天然化合物能减缓产氨活性，其中式ⅱ和式ⅲ所示的化合物能分别减缓87.77%和83.51%的产氨活性，而其他原小檗碱类生物碱比如小檗碱、巴马汀、药根碱等均没有显著的抑制微生物产氨能力。
20.式ⅰ化合物减缓瘤胃微生物粗酶液的产氨活性的有效浓度测定本发明利用hepes缓冲液将式ⅱ和式ⅲ所示的化合物释成不同的浓度。以不添加化合物时粗酶液产氨活性为100%，计算不同浓度原小檗碱类生物碱作用后的产氨活性并进行非线性拟合。结果显示，随着化合物浓度的增加，瘤胃微生物粗酶液产氨活性降低，当式ⅱ化合物、式ⅲ化合物分别为0.67 μmol/l、2.45 μmol/l时，产氨活性为50%，以缓解瘤胃微生物产氨活性50%
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90%时的化合物浓度为有效浓度，表小檗、黄连碱的有效浓度范围分别为0.67
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1.31 μmol/l、2.45
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5.25 μmol/l。
21.式ⅰ化合物对瘤胃微生物发酵的影响
采集瘤胃液并制备厌氧培养基及厌氧稀释液，利用注射器将瘤胃液分装到装有厌氧培养基的hungate管中，每管3 ml，混合均匀后，用注射器吸取500 μl式ⅱ化合物、式ⅲ化合物溶液注入管中，混合均匀，室温反应10 min，用注射器注入500 μl反应缓冲液，混合均匀，以添加与化合物稀释液中等量的dmso作为对照，每组3个重复，将所有管放入39℃培养箱中培养，分别于0、1、2、6、12 h采集200 μl培养液，加入400 μl 25%偏磷酸，样品12000 rpm 4℃离心5 min，收集上清测定氨氮含量；于0、12 h测定培养管内气压。对测定的氨氮含量关于时间变化作图分析，根据公式计算产气量。结果显示，随着培养时间的延长，培养体系中氨氮的浓度逐渐升高，从培养第1 h起，添加式ⅱ化合物（表小檗碱）、式ⅲ化合物（黄连碱）的培养体系中氨氮浓度显著低于对照组（p<0.05）；在第12 h时，添加式ⅱ化合物、式ⅲ化合物的体系中产气量显著高于对照组（p<0.05）。ⅱ化合物、式ⅲ化合物可使瘤胃微生物体外发酵中氨氮的产生量分别降低16.13%
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22.15%、15.95%
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29.8%，使产气量分别增加25.1%、22.12%。
附图说明
22.图1 原小檗碱类化合物对瘤胃微生物产氨活性的影响。
23.图2 式ⅱ化合物（表小檗碱）和式ⅲ化合物（黄连碱）抑制瘤胃微生物产氨活性的ic50值。（a）表小檗碱抑制瘤胃微生物产氨活性的ic50值；（b）黄连碱抑制瘤胃微生物产氨活性的ic50值。
24.图3 式ⅱ化合物（表小檗碱）和式ⅲ化合物（黄连碱）对瘤胃体外发酵产气的影响。
25.图4 式ⅱ化合物（表小檗碱）和式ⅲ化合物（黄连碱）对瘤胃体外发酵氨氮生成的影响。
具体实施方式
26.以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
27.1、试验仪器酶标仪（thermo electron varioskan flash）生化震荡培养箱（hzq
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f100）2、主要试剂本试验中使用的植物源天然化合物购于上海陶素生化科技有限公司。
28.50 mmol/l hepes缓冲液：准确称取11.9 g hepes粉末，适量去离子水溶解后，调节ph至7.5，定容至1 l50 mmol/l反应缓冲液：准确称取3 g 氮，用hepes缓冲液溶解，定容至1 l0.2 g/l nh4cl标准溶液：准确称取0.2 g nh4cl固体，去离子水溶解后定容至1l酒石酸钾钠溶液：准确称取50 g 酒石酸钾钠固体，100 ml去离子水溶解后加热煮沸，待溶液冷却后用去离子水定容至100 ml表小檗碱溶液：10 mg 表小檗碱中加入298 μl dmso配制成100 mmol/l 表小檗碱
母液黄连碱溶液：10 mg 黄连碱中加入312 μl dmso配制成100 mmol/l 黄连碱母液实施例1调控反刍动物瘤胃微生物发酵的植物源天然化合物的筛选与鉴定步骤一：提取瘤胃微生物粗酶液。挑选3头瘘管荷斯坦奶牛，采集瘤胃内容物100 ml，通过4层无菌纱布过滤，将滤液（瘤胃液）分装到50 ml无菌离心管中，离心（300 g，5 min，4℃），收集上清液到新的离心管中，离心（12000 g，10 min，4℃），弃上清，用25 ml hepes缓冲液重悬沉淀，离心（12000 g，10 min，4℃），弃上清，用25ml hepes缓冲液重悬沉淀，超声波细胞粉碎机冰上破碎（150 w，超声5 s，停5 s，超声10 min），离心（12000 g，10 min，4℃），收集上清，即得到瘤胃微生物粗酶液。
29.步骤二：测定100种植物源天然化合物对瘤胃微生物产氨活性的减缓作用。取40 μl瘤胃微生物粗酶液于96孔板中，加入40 μl天然化合物溶液（终浓度10 μmol/l），于室温反应10 min，再加入100 μl反应缓冲液（终浓度28 mmol/l），37℃孵育30 min，加入10 μl酒石酸钾钠溶液，混合均匀后加入10 μl纳氏试剂，混合均匀后于室温反应10 min，利用酶标仪测定420 nm处吸光值，对照组以hepes缓冲液替代非蛋白氮缓冲液。瘤胃微生物剩余活性计算公式为：瘤胃微生物产氨活性（%）=（试验组od值
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试验阴性对照组od值）/（粗酶液组od值
‑
粗酶液阴性对照组od值）
×
100%步骤三：制备nh4cl标准工作曲线。用去离子水将0.2 g/l nh4cl标准溶液稀释为20 μg/ml，再根据表1进行梯度稀释加入10 μl酒石酸钾钠溶液，混合均匀后加入10 μl纳氏试剂，混合均匀后于室温反应10 min，利用酶标仪测定420 nm处吸光值。
30.步骤四：结果分析。100种天然化合物作用后的瘤胃微生物粗酶液的产氨活性结果显示，有10种天然化合物能减缓产氨活性，其中，表小檗碱和黄连碱能分别减缓87.77%和83.51%的产氨活性，而其他原小檗碱类生物碱比如小檗碱、巴马汀、药根碱等均没有显著的抑制微生物产氨能力。
31.实施例2原小檗碱类生物碱减缓瘤胃微生物粗酶液的产氨活性的有效浓度测定步骤一：配制相关溶液。利用hepes缓冲液将表小檗碱、黄连碱稀释成不同的的浓度，表小檗碱稀释为0、0.0625、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5 mmol/l，黄连碱稀释为0、0.125、0.5、1、1.5、2、2.5、4、5 mmol/l。
32.步骤二：不同原小檗碱类生物碱浓度减缓瘤胃微生物粗酶液的产氨活性的测定。瘤胃微生物粗酶液测定体系及方法同实施例1。
33.步骤三：瘤胃微生物粗酶液产氨活性的计算。以不添加化合物时粗酶液产氨活性为100%，计算不同浓度原小檗碱类生物碱作用后的产氨活性并进行非线性拟合。
34.结果显示，随着化合物浓度的增加，瘤胃微生物粗酶液产氨活性降低，当表小檗
碱、黄连碱分别为0.67 μmol/l、2.45 μmol/l时，产氨活性为50%，以缓解瘤胃微生物产氨活性50%
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90%时的化合物浓度为有效浓度，表小檗、黄连碱的有效浓度范围分别为0.67
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1.31 μmol/l、2.45
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5.25 μmol/l。
35.实施例3 原小檗碱类生物碱对瘤胃微生物发酵的影响步骤一：瘤胃液采集。瘤胃液的采集同实施例1的步骤三，经过纱布过滤后，使用20 ml 无菌注射器注入经厌氧、灭菌处理的血清瓶中，冰上保存步骤二：厌氧培养基及厌氧稀释液制备。厌氧培养基配制见表2，厌氧稀释液配制见表6。向培养基中通入co2以除氧，并调节ph至6.8，转入厌氧培养箱中进行分装，每支hungate管6 ml，灭菌（121℃，15 min）。
36.步骤三：溶液配制。在厌氧培养箱中，利用厌氧稀释液对表小檗碱母液、黄连碱母液进行稀释（浓度为0.19 mmol/l），利用厌氧稀释液配制浓度为0.4 mol/l的非蛋白氮缓冲液，放置1 h，0.22 μm滤膜过滤。
37.步骤四：原小檗碱类生物碱对瘤胃微生物发酵的影响。利用注射器将瘤胃液分装到装有厌氧培养基的hungate管中，每管3 ml，混合均匀后，用注射器吸取500 μl化合物溶液注入管中（化合物终浓度为20 μmol/l），混合均匀，室温反应10 min，用注射器注入500 μl反应缓冲液（终浓度为20 mmol/l），混合均匀，以添加与化合物稀释液中等量的dmso作为对照，每组3个重复，将所有管放入39℃培养箱中培养，分别于0、1、2、6、12 h采集200 μl培养液，加入400 μl 25%偏磷酸，样品12000 rpm 4℃离心5 min，收集上清测定氨氮含量；于0、12 h测定培养管内气压。
38.步骤五：结果分析。对测定的氨氮含量关于时间变化作图分析，根据公式计算产气量，其中gp表示产气量（ml），p表示测定的hungate管内气压（kpa），v表示hungate管内气体体积（ml），101.3表示标准大气压（kpa）。
39.测定结果显示，随着培养时间的延长，培养体系中氨氮的浓度逐渐升高，从培养第1 h起，添加表小檗碱、黄连碱的培养体系中氨氮浓度显著低于对照组（p<0.05）；在第12 h时，添加表小檗碱、黄连碱的体系中产气量显著高于对照组（p<0.05）。表小檗碱、黄连碱可使瘤胃微生物体外发酵中氨氮的产生量分别降低16.13%
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22.15%、15.95%
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29.8%，使产气量分别增加25.1%、22.12%。