人前列腺癌LNCaP细胞裸鼠皮下移植模型的构建方法与流程

人前列腺癌lncap细胞裸鼠皮下移植模型的构建方法
技术领域
1.本发明涉及动物模型技术领域，具体涉及一种人前列腺癌lncap细胞裸鼠皮下移植模型的构建方法。


背景技术：

2.前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤，在美国前列腺癌占癌症相关死亡率的第二位。新近的研究资料表明，在我国随着人口老龄化、饮食及生活习惯的改变，前列腺癌的标准发病率和死亡率也迅速上升。多数前列腺癌在诊断时为雄激素依赖状态，手术、药物及放射治疗等方法均较为有效。然而，前列腺癌一旦获得雄激素非依赖的生长方式，现有的治疗方法变得难以奏效，5年生存率也仅为30％，且这一数据自1973年以来并没有明显提升。寻找新的治疗策略如肿瘤靶向药物研发来提高患者的生存率，显得尤为必要。在这个过程中，前列腺癌动物模型是研究前列腺癌发生发展及诊断治疗中必不可少的条件，它能够在药物研发向临床之间的转化起到桥梁作用。pc
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3、du145和lncap细胞是人前列腺癌细胞的3种经典细胞，其中lncap细胞唯一一种高表达雄激素受体(androgen receptor，ar)的肿瘤细胞。ar在前列腺癌的发展和侵袭中起到重要作用，lncap细胞裸鼠移植模型能够很好地模拟前列腺癌从雄激素依赖状态向雄激素非依赖状态转化的临床病理生理过程，因而lncap细胞动物模型被认为是接近于人前列腺癌发生发展的动物模型。
3.由于裸鼠皮下移植模型具有成瘤简单、肿瘤容易观察及瘤内给药方便等优点，该成瘤方法常常用于动物实验研究。然而，现有前列腺癌lncap细胞的裸鼠皮下移植模型的前列腺癌细胞移植的成瘤周期较长。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种人前列腺癌lncap细胞裸鼠皮下移植模型的构建方法，解决现有前列腺癌lncap细胞的裸鼠皮下移植模型的前列腺癌细胞移植的成瘤周期较长。
6.(二)技术方案
7.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
8.本发明提供一种人前列腺癌lncap细胞裸鼠皮下移植模型的构建方法，包括以下步骤：
9.s1、对lncap细胞和基质胶进行处理，得到lncap细胞注射液；
10.s2、通过皮试针抽lncap细胞注射液，抽入空气，形成混合物，于雄性裸鼠的右侧前肢腋窝注射混合物。
11.优选的，所述lncap细胞注射液为含液体基质胶的lncap细胞悬液，所述液体基质胶和所述lncap细胞悬液的体积相等。
12.优选的，所述对lncap细胞和基质胶进行处理，得到lncap细胞注射液，包括：
13.s101、提前将基质胶从
‑
20℃放入4℃的冰箱，使其成为液态；
14.s102、从t25细胞培养瓶内取出lncap细胞，然后将t25细胞培养瓶内陈旧的培养液倒入废液缸内，利用磷酸盐缓冲液对取出的lncap细胞进行一次漂洗，加入胰酶，放入培养箱内，于3min后取出；
15.s103、每个t25细胞培养瓶内加入2ml胎牛血清的dmem/f12培养基，再把lncap细胞放入t25细胞培养瓶内，吹打4～5次后将消化下来的lncap细胞吸入15ml离心管内；
16.s104、将15ml离心管在转速1000rmp的条件下离心3min；
17.s105、弃上清，再用磷酸盐缓冲液将细胞漂洗2次；
18.s106、冰上将15ml离磷酸盐缓冲液心管内的细胞悬液充分吹打后，调整细胞浓度为5
×
106个/ml，在lncap细胞悬液内加入等体积的基质胶，轻轻吹打混匀，得到lncap细胞注射液。
19.优选的，所述s102到s106在消毒后的超净台上操作。
20.优选的，所述s102取出的lncap细胞处于对数生长期。
21.优选的，所述混合物包括0.2mllncap细胞注射液和0.2ml空气。
22.优选的，所述方法还包括：
23.每三天观察裸鼠肿瘤初始形成时间，依据以下标准判断移植瘤初始形成：肉眼见到隆起于裸鼠皮肤表面的硬节、直径3mm，且随后的观察逐渐增大为肿瘤形成。
24.优选的，所述方法还包括：
25.皮下移植瘤形成后，用游标卡尺测量移植瘤的最大长径和最大短径，再计算皮下移植瘤体积，计算公式为：体积＝π/6
×
移植瘤最大长径
×
移植瘤最大短径
×
移植瘤最大短径。
26.(三)有益效果
27.本发明提供了一种人前列腺癌lncap细胞裸鼠皮下移植模型的构建方法。与现有技术相比，具备以下有益效果：
28.本发明考虑皮下氧气环境的新型前列腺癌lncap细胞裸鼠皮下移植模型，实现缩短成瘤周期，同时有效提升移植瘤的生长速度和lncap细胞裸鼠皮下移植模型的成瘤率，为前列腺疾病诊治的基础实验研究打下基础。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为本发明实施例一种人前列腺癌lncap细胞裸鼠皮下移植模型的构建方法的流程图；
31.图2为对比实验一中lncap细胞裸鼠皮下移植模型肿瘤初始形成时间示意图；
32.图3为对比实验一中lncap细胞裸鼠皮下移植瘤时间生长曲线示意图；
33.图4为对比实验二中裸鼠体重变化示意图。
saline，pbs)对取出的lncap细胞进行一次漂洗，加入0.25％胰酶，放入培养箱内，于3min后取出；
50.s103、每个t25细胞培养瓶内加入2ml含10％胎牛血清的dmem/f12培养基，再把lncap细胞放入t25细胞培养瓶内，吹打4～5次后将消化下来的lncap细胞吸入15ml离心管内；
51.s104、将15ml离心管置于离心机内离心，在转速1000rmp的条件下离心3min；
52.s105、弃上清，再用pbs将细胞漂洗2次；
53.s106、冰上将15ml离磷酸盐缓冲液心管内的细胞悬液充分吹打后，调整细胞浓度为5
×
106个/ml，用移液枪在lncap细胞悬液内加入等体积的基质胶，轻轻吹打混匀，得到lncap细胞注射液。
54.在本发明实施例中，步骤s2、通过皮试针抽lncap细胞注射液，抽入空气，形成混合物，于裸鼠右侧前肢腋窝注射混合物，包括：
55.取出适应性培养一周后的雄性裸鼠，一人左手指和食指紧捏裸鼠颈背部皮肤，并用小指夹住裸鼠尾部，右手用含75％的酒精棉球擦拭裸鼠右侧前肢腋窝处皮肤进行接种前消毒。另一助手先抽入0.2mllncap细胞注射液，再抽入0.2ml空气，利用1ml皮试针将得到的混合物注入裸鼠前肢腋窝下。
56.在按照上述操作进行人前列腺癌lncap细胞移植后，每三天观察各种裸鼠肿瘤初始形成时间，为了与裸鼠皮下尚未完全吸收的细胞悬液相鉴别，依据以下标准判断移植瘤初始形成：肉眼见到隆起于裸鼠皮肤表面的硬节、直径3mm，且随后的观察逐渐增大为肿瘤形成。皮下移植瘤形成后，用游标卡尺测量移植瘤的最大长径和最大短径，再计算皮下移植瘤体积，计算公式为：体积＝π/6
×
移植瘤最大长径
×
移植瘤最大短径
×
移植瘤最大短径。
57.对比实验一：
58.首先选择一批已经适应性喂养一周的雄性balbc裸鼠，将其随机分为四组，每组12只。
59.在第一组裸鼠的前肢腋窝下注射0.2ml的lncap细胞悬液；在第二组裸鼠的前肢腋窝下注射0.2ml的lncap和基质胶悬液；在第三组裸鼠的前肢腋窝下分别注射0.2ml的lncap细胞悬液和0.2ml空气；对第四组裸鼠执行本发明实施例提出的操作。
60.在按照上述操作进行人前列腺癌lncap细胞移植后，每三天观察各种裸鼠肿瘤初始形成时间，为了与裸鼠皮下尚未完全吸收的细胞悬液相鉴别，依据以下标准判断移植瘤初始形成：肉眼见到隆起于裸鼠皮肤表面的硬节、直径3mm，且随后的观察逐渐增大为肿瘤形成。皮下移植瘤形成后，用游标卡尺测量移植瘤的最大长径和最大短径，再计算皮下移植瘤体积，计算公式为：体积＝π/6
×
移植瘤最大长径
×
移植瘤最大短径
×
移植瘤最大短径。
61.lncap细胞皮下成瘤后观察至90天。
62.按照美国机构动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee)的建议，裸鼠出现明显消瘦、2天内体重减少超过实验前体重的20％、伴有独处、蜷缩、皮肤皱缩、活动量明显降低终止实验，采用颈椎脱臼法将裸鼠处死。实验结果见表1、图2和图3。
63.表1各组皮下移植瘤裸鼠成瘤数及初始成瘤时间比较
[0064][0065][0066]
与lncap 基质胶组比较，bp<0.05
[0067]
由表1和图1
‑
2可知，按照本发明实施例设计动物模型，不仅肿瘤形成时间较早，而且成瘤率较高。
[0068]
对比实验二、
[0069]
(1)选择一批5周龄雄性balbc裸鼠，随机分为三组，每组12只，适应性喂养一周。
[0070]
(2)取出适应性培养一周后的裸鼠，一人左手拇指和食指紧捏balbc裸鼠颈背部皮肤，并用小指夹住裸鼠尾部，右手用含75％的酒精棉球擦拭裸鼠右侧前肢腋窝处皮肤进行接种前消毒。
[0071]
(3)对第一组裸鼠进行如下操作：由助手用1ml皮试针先抽入0.2mllncap细胞注射液，再抽入0.2ml空气，将0.4mllncap细胞注射液 空气注入裸鼠前肢腋窝下，注射完毕用酒精棉球轻压皮下注射点30s。
[0072]
(4)第二组裸鼠进行如下操作：在减压阀出气口接通事先消毒好的一根橡胶管，调整减压阀后见指针摆动至低速气流后，用止血钳夹闭橡胶管远端，并防止橡胶管爆开。助手用1ml皮试针先抽入0.2mllncap细胞注射液，再从橡胶管内抽入0.2ml含40％氧气浓度的混合气体，将lncap 基质胶 40％氧气的混合物注入裸鼠前肢腋窝下完成lncap 基质胶 40％氧气组皮下成瘤。
[0073]
(5)第三组裸鼠进行如下操作：助手用1ml皮试针先抽入0.2mllncap细胞注射液，再从橡胶管内抽入0.2ml含60％氧气浓度的混合气体，将lncap 基质胶 60％氧气的混合物注入裸鼠前肢腋窝下完成lncap 基质胶 60％氧气组皮下成瘤。
[0074]
(6)皮下接种后每3天观察裸鼠的一般情况，观察内容包括有无精神萎靡、独处以及体重减轻等变化；皮下移植瘤形成后，用游标卡尺测量肿瘤最大长径及最大短径，按照体积＝π/6
×
移植瘤最大长径
×
移植瘤最大短径
×
移植瘤最大短径计算皮下移植瘤体积。
[0075]
相关实验结果见表2
‑
3和图4。
[0076]
表2皮下移植瘤裸鼠体重变化(g克)
[0077][0078]
注：各组之间裸鼠体重比较差异未见统计学意义，p>0.05
[0079]
表3皮下移植瘤模型成瘤率及初始成瘤时间比较
[0080] 成瘤数成瘤率初始成瘤时间(天)平均成瘤时间(天)第一组436.36％31,33,36,5037.5第二组541.67％40,44,57,62,6253第三组325％44,50,6752.67
[0081]
由上述结果可知，本发明设计的动物模型具有较快的瘤生长速度。
[0082]
综上所述，与现有技术相比，具备以下有益效果：
[0083]
本发明实施例考虑皮下氧气环境的新型前列腺癌lncap细胞裸鼠皮下移植模型，实现缩短成瘤周期，同时有效提升移植瘤的生长速度和lncap细胞裸鼠皮下移植模型的成瘤率，为前列腺疾病诊治的基础实验研究打下基础。
[0084]
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0085]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。