含有氘代天然支链氨基酸的磁共振成像药物和使用所述药物的诊断方法与流程

1.本发明涉及医学，即用于磁共振成像的方法。
现有技术
2.疾病的非侵入性诊断，包括早期诊断，是医学保健的一个重点优先领域。用于诊断疾病的信息方法之一是磁共振成像(mri)。
3.临床实践中使用的大多数类型的mri都是基于记录人体水中所含质子(1h核)的磁共振信号。1hmri提供了高度的解剖细节。同时，从临床实践中了解到，mri并不总是提供关于疾病性质的明确数据。特别是，在肿瘤学中，对于正确区分恶性肿瘤与非危及生命的良性形成、炎症病灶等，仍然具有挑战性[参见，例如:baltzer,p.a.t.等人.am.j.roentenology,2010,194,1658
‑
1663；shahid,h.等人.appl.radiol.2016,45,7
‑
13.]。在这方面，肿瘤疾病的早期诊断也很困难，因为假阳性结果的风险很高。
[0004]
使1hmri提供更多信息的主要方法是使用造影剂来改变其环境中水质子的弛豫时间[当前化学的主题，造影剂i、磁共振成像(topic sin current chemistry,contrast agents i,magnetic resonance imaging.krause,w.(ed.),springer,2002]。已知多种造影剂可以用于mri诊断，包括市售的钆配合物和以及稳定的磁性纳米粒子的水悬浮液和除了增强图像的对比度外，这些物质还可以评估灌注。
[0005]
一种替代使用造影剂的1hmri的方法是记录来自其它原子核的信号，特别是，处于临床试验的不同阶段，使用同位素
31
p、
13
c、
19
f、
23
na等方法。
[0006]
氘(2h)是氢的天然非放射性同位素，在生物体中的含量为氢总量的0.0156％。
[0007]
文件us5042488表明，在体内(大鼠肝脏中)注射d2o和1
‑
氘代葡萄糖后记录氘信号的可能性。
[0008]
文件us20030211036a1提出了一种通过与顺磁造影剂类比，使用同位素标记的化合物(例如d2o)测量选定的组织切片中的灌注的方法。
[0009]
文件us20100322865a1描述了使用代谢水前体来估计代谢率。1,2,3,4,5,6,6氘代葡萄糖作为hod的代谢前体的一个例子。在所述发明的框架内，仅记录了代谢水氘和脂肪酸脂肪链的nmr信号，没有氘代葡萄糖的nmr信号。
[0010]
来自[washburn等人,nucl.med.1978,19,77
‑
83]的研究，已知外消旋1
‑
14
c
‑
缬氨酸以及1
‑
11
c
‑
缬氨酸主要在动物的胰腺中累积。同时，从现有技术中没有同位素标记的缬氨酸衍生物能用于疾病的非侵入性诊断的应用。
[0011]
14
c
‑
亮氨酸在生化科学研究中被广泛用作蛋白质合成速率的指标(亮氨酸包含在给定组织中合成的所有蛋白质中)。这种应用通常需要对目标组织进行侵入式采样。
[0012]
缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸属于支链氨基酸(bcaa)组。该组成员具有一定的生化相似性，因为它们可以通过相同的转运蛋白穿透细胞膜，并且其代谢的初始阶段由相同的
酶(支链氨基酸的转氨酶和脱羧酶)催化。
[0013]
尽管1hmri技术在临床上得到广泛应用，但仍然需要开发新的、更有效的mri诊断方法。


技术实现要素：

[0014]
本发明的目的是开发一种通过mri和/或mr波谱诊断疾病的新的有效诊断药物和涉及使用特定药物的诊断方法。
[0015]
本发明的技术成果是发明一种新的有效诊断药物，通过磁共振成像和/或氘磁共振波谱，用于伴随细胞营养吸收水平的局部改变(增加或减少)的疾病和病理过程的非侵入性诊断，特别是肿瘤疾病。
[0016]
这一技术成果是通过开发与核磁共振方法(mri或mr波谱)基本物理限制相容的诊断药物来实现的。众所周知，氘核的旋磁比比氕小6.5倍。因此，氘信号的检测灵敏度约为氕信号检测灵敏度的0.01(即1％)[生物核磁共振(biological magnetic resonance),卷11,invivospectroscopy.berlinerl.j.,reuben,j.(eds.),springer,1992]。可以通过对几次相同扫描的信号进行平均来记录弱信号。然而，这样的平均需要增加扫描时间，并且信噪比非线性地增加(按比例，其中n是扫描次数；例如，如果扫描需要10分钟，并且信号噪声比应增加10倍，扫描时间将需要增加100倍，即最多16小时)。那时，活生物体中的扫描持续时间受到诊断药物的药代动力学和临床实践中的实际适用性(检查不应超过1
‑
2小时)以及患者在整个扫描期中需要保持不动的限制。磁共振信号的强度还取决于磁场的强度。由于磁场强度不超过7t的mr断层扫描仪目前已获准用于临床，因此只有在7t提供足够信号强度的诊断药物才有实际应用价值。
[0017]
因此，本发明的诊断药物中的氘代化合物应具有这样一组物理化学和生物学特性，以确保氘的选择性累积和其在靶组织中的浓度维持足够用于信号记录的时间。组织中氘代化合物的浓度越低，平均信号所需的时间就越长，因此，氘代化合物在组织中的时间就越长，从而保持选择性分布。另一方面，增加诊断药物的剂量并不是一个普遍的解决办法，因为它的排泄会加速(特别是通过超过肾脏的再吸收能力)，毒性风险增加，在各种组织中累积的选择性降低，而且剂量受溶解度的限制。
[0018]
对于包括氨基酸在内的大多数化合物，没有关于病理情况下组织中可达到的最大无毒浓度的数据。因此，开发符合上述标准的诊断药物需要实验证据证明其在2hmri和/或活体mr光谱中的适用性。
[0019]
本发明的技术成果也是开发了一种新的有效且信息丰富的方法，通过磁共振成像和/或氘磁共振光谱，用于诊断伴随细胞营养吸收水平局部改变(增加或减少)的疾病和病理过程，尤其是肿瘤疾病，，包括引入本发明的诊断药物，其能够在靶组织和器官中累积(尤其是在肿瘤组织中)，浓度足以记录活体内信息丰富的氘断层成像或2h
‑
nmr谱。本发明实施中的附加技术结果是能够获得关于扫描区域不同点的灌注水平的信息、关于肿瘤的结构、其边界、关于肿瘤的恶性或良性的信息。另一个附加技术结果是评估扫描区域内代谢过程的局部速率的可能性，这反过来使评估代谢活动和/或细胞增殖水平成为可能，肿瘤生长速率是一个额外的参数，可提高诊断的可靠性和有效性。
[0020]
本发明的方法的另一个特点是，其在没有电离辐射有害影响的情况下进行(典型
的，例如，ct、pet、spect成像)，这反过来增加了检查的安全性，使得能够进行更频繁的重复检查，尤其是，使该方法对儿科具有吸引力。本发明旨在获得类似于正电子发射断层扫描或单光子发射计算机断层扫描方法的诊断信息(病理组织中药物累积的水平或速率偏离正常值或在相同组织/相同器官的周围部分中获得的值)，同时也消除了与放射性药物电离辐射相关的风险。此外，与pet放射性药物不同，本发明氘代药物的生产不限于小批量短寿命同位素的合成和物流(logistics)。
[0021]
通过开发包含天然支链氨基酸的氘代衍生物和/或药学上可接受的盐或其混合物的诊断药物，以通过磁共振成像和/或氘磁共振光谱诊断疾病，从而实现指定的技术结果。
[0022]
因此本发明的第一方面是诊断药物，其包含至少一种选自下组的化合物：天然支链氨基酸的氘代衍生物和/或天然支链氨基酸的氘代衍生物的药学上可接受的盐，用于通过磁共振成像和/或氘磁共振光谱诊断疾病或病理过程。
[0023]
在本发明的一些实施例中，诊断药物另外包含至少一种药学上可接受的赋形剂。在一些特定情况下，药学上可接受的赋形剂是载体、填料和/或稀释剂。
[0024]
在本发明的一些实施例中，天然支链氨基酸的氘代衍生物和/或其药学上可接受的盐，除了与碳原子键合的氘原子，包含部分或完全取代与氧和/或氮原子键合的可移动氢原子的氘原子。
[0025]
在本发明的一些实施例中，诊断药物包含：
[0026]
‑
一种天然支链氨基酸的氘代衍生物，该氨基酸含有在一个以上位置结合到碳原子的氘原子，或其药学上可接受的盐；或
[0027]
‑
天然支链氨基酸的氘代衍生物和/或其药学上可接受的盐的混合物，且所述氘代衍生物含有结构上不等价位置的氘原子。
[0028]
在本发明的一些实施例中，天然支链氨基酸的氘代衍生物为氘代缬氨酸或氘代亮氨酸或氘代异亮氨酸。
[0029]
在本发明的一些特定实施例中，氘代缬氨酸为缬氨酸
‑
4,4,4
‑
d3、缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6、缬氨酸
‑
3,4,4,4,4',4',4'
‑
d7、缬氨酸
‑
2,4,4,4,4',4',4'
‑
d7、缬氨酸
‑
2,3,4,4,4,4',4',4'
‑
d8。
[0030]
在一些具体实施例中，氘代亮氨酸是亮氨酸
‑
5,5,5
‑
d3、亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d6、亮氨酸
‑
4,5,5,5,5',5',5'
‑
d7、亮氨酸
‑
3,3,5,5,5,5',5',5'
‑
d8、亮氨酸
‑
3,3,4,5,5,5,5',5',5'
‑
d9、亮氨酸
‑
2,5,5,5,5',5',5'
‑
d7、亮氨酸
‑
2,3,3,5,5,5,5',5',5'
‑
d9、亮氨酸
‑
2,4,5,5,5,5',5',5'
‑
d8、亮氨酸
‑
2,3,3,4,5,5,5,5',5',5'
‑
d
10
.
[0031]
戊
‑
戊
‑
戊
‑
戊
‑
戊
‑
戊
‑
戊
‑
在本发明的一些具体实施方案中，氘代异亮氨酸是2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊酸、2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
5,5,5
‑
d3酸、2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
4,4,5,5,5
‑
d5酸、2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
2,5,5,5
‑
d4酸，2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
2,3,5,5,5
‑
d5酸、2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
3,4,4,5,5,5
‑
d6酸、2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
2,3,4,4,5,5,5
‑
d7酸，2
‑
氨基
‑3‑
甲基戊
‑
5,5,5
‑
d3酸。
[0032]
在本发明的一些实施例中，氘代衍生物全部或主要由一种对映体表示。在本发明的一些具体实施例中，氘代衍生物全部或主要由具有2s构型的对映体表示。
[0033]
在本发明的一些实施例中，诊断药物包含选自氘代天然支链氨基酸衍生物和/或氘代天然支链氨基酸衍生物的药学上可接受的盐的至少两种不同化合物的混合物。在本发
明的一些特定实施例中，诊断药物包含选自缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6、缬氨酸
‑
2,4,4,4,4',4',4'
‑
d7、亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d6、亮氨酸
‑
3,3
‑
d2的至少两种化合物的混合物。
[0034]
在本发明的特定实施例中，诊断药物可包含支链氨基酸代谢抑制剂，尤其是支链氨基酸转氨酶抑制剂。例如，选自加巴喷丁(a.goldlustetal.epilepsyres.1995,22(1),1
‑
11)，苯并咪唑(h.dengetal.acsmed.chem.lett.2016,7(4),379
‑
384)，但不限于此。
[0035]
本发明的另一方面是用于诊断受试者中的疾病或病理过程的方法，包括以下步骤：
[0036]
‑
向受试者施用本发明的诊断药物；
[0037]
‑
在给予诊断药物后，在足以使其在靶组织中累积的时间后进行磁共振成像和/或氘磁共振波谱，以分别获得断层图(氘断层图)和/或核磁共振波谱(光谱)；
[0038]
‑
根据观察到的氘核信号强度，反映诊断药物的累积水平，诊断是否存在疾病。
[0039]
在本发明的优选实施例中，所诊断的疾病或病理过程伴随着细胞对营养素吸收水平的局部改变(增加或减少)。
[0040]
在本发明的一些实施例中，病理过程是炎症过程、感染过程、伴随主动再生的过程、与器官和组织缺血相关的疾病、移植物排斥反应、自身免疫疾病。在本发明的一些其他实施例中，该疾病是肿瘤疾病。在本发明的一些特定实施例中，肿瘤疾病是实体瘤或肿瘤转移，包括淋巴结转移。
[0041]
在本发明的一些实施例中，通过比较正在接受检查的受试者中氘核的信号强度与在健康受试者中观察到的目标组织或器官中的典型信号强度来诊断是否存在疾病。在本发明的一些其它实施例中，根据额外的医学检查结果，基于与正常和异常组织相对应的区域中氘核的信号强度的比较来诊断疾病是否存在。在本发明的一些实施例中，基于上述比较的组合来诊断疾病是否存在。
[0042]
在本发明的一些实施方案中，进行至少一种额外的医学检查，选自对除氘核之外的核的磁共振成像、超声检查、计算机断层扫描、射线照相、触诊、活检、针对肿瘤标志物的生物流体分析、放射性核素诊断和/或目视观察。在本发明的一些实施例中，如上所述的额外的医学检查在使用磁共振成像和/或氘磁共振波谱诊断疾病或病理过程之前进行。在本发明的一些其他具体实施例中，如上所述的额外的医学检查在使用磁共振成像和/或氘磁共振波谱诊断疾病或病理过程之后进行。
[0043]
在本发明的一些特定实施例中，基于接受检查的受试者的氘断层图像与受试者的氕磁共振成像结果获得的图像的比较来诊断疾病或病理过程是否存在。
[0044]
在本发明的一些实施例中，在氘断层图像上诊断药物累积增加的区域的空间分布用于得出关于肿瘤的空间结构的结论。
[0045]
在本发明的具体实施方案中，使用诊断药物的累积增加的区域中的氘断层照片和/或nmr光谱(波谱)上的氘信号强度来得出关于肿瘤的恶性或良性的结论。
[0046]
在本发明的一些具体实施例中，使用氘断层图像上的氘信号强度的变化速率和/或其施用后的nmr光谱(波谱)来得出关于扫描区域不同点处的灌注水平的结论。
[0047]
用于诊断与本发明有关的受试者中的疾病或病理过程的方法的具体实施例还包括本发明关于上述诊断药物的所有实施例。
[0048]
在用于诊断受试者的疾病或病理过程的方法的一些实施例中，要施用的诊断药物
包括
[0049]
‑
一种天然支链氨基酸的氘代衍生物，含有在一个以上位置结合到碳原子的氘原子，或其药学上可接受的盐；或
[0050]
‑
天然支链氨基酸的氘代衍生物和/或其药学上可接受的盐的混合物，其中所述氘代衍生物含有在结构上不等价位置的氘原子。
[0051]
同时，根据目标区域内氘代衍生物结构上不等价位置的氘核信号强度的比较，评估天然支链侧氨基酸的局部代谢速率，这允许更准确的诊断，特别是，评估肿瘤的生长速度或恶性程度。
[0052]
在本发明上述实施例的一些特定情况下，天然支链氨基酸的氘代衍生物为：
[0053]
‑
各种氘代缬氨酸衍生物的混合物；或
[0054]
‑
各种氘代亮氨酸衍生物的混合物；或
[0055]
‑
各种氘代异亮氨酸衍生物的混合物；或
[0056]
‑
缬氨酸、亮氨酸和/或异亮氨酸的各种氘代衍生物的混合物。
[0057]
在本发明的一些实施例中，诊断药物是按照口服的方式给药于受试者的。在本发明的一些其他实施例中，将诊断药物以非肠道方式给药于受试者。
[0058]
附图的简要说明
[0059]
图1.a)含有缬氨酸
‑
4,4,4,4”,4',4'
‑
d6的样品的氘断层图(左侧)和2h光谱(右侧)；b)亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d6样品的氘断层图(左侧)和2h光谱(右侧)。
[0060]
图2.注射20mg缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6后患有4t1乳腺癌的小鼠的断层图像：
[0061]
a)注射后不同时间点获得的2h断层图像(表面线圈用虚线表示)；b)2h断层图像(左侧)、2h和1h断层图像的叠加(中间)、1h断层图像(右侧)。
[0062]
图3.注射25mg亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d
6 40分钟后患有4t1乳腺癌的小鼠的断层图像。
[0063]
图4.在给药后4t1乳腺癌小鼠的断层图像：a)30mgl
‑
丙氨酸
‑
3,3,3
‑
d3；b)10mgl
‑
苯丙氨酸
–
β,β,2,3,4,5,6
‑
d7。
[0064]
定义和术语
[0065]
为了更好地理解本发明，以下是本发明说明书中使用的一些术语。
[0066]
为了描述本发明的目的，术语“包括”和“含有”被解释为意味着“包括，此外”。这些术语不应被解释为“仅由
……
组成”。
[0067]
术语“受试者”包括所有哺乳动物物种，优选人。
[0068]
本文中的术语“氘代衍生物”是指在至少一个位置含有与碳结合的氘的量超过其天然含量的化合物。在本发明的特定实施例中，至少在一个位置上的氘含量超过10％，在其他特定实施例中为
‑
90％。“至少两种不同的氘代衍生物的混合物”是指在不同位置含有氘的化合物的混合物，或在相同位置含有不同量的氘的化合物的混合物。本文件中的符号“d”(“d”)表示以超过其天然含量的比例由同位素2h表示的氢原子。
[0069]
氘代支链氨基酸衍生物包括缬氨酸
‑
4,4,4
‑
d3，缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6,缬氨酸
‑
3,4,4,4,4',4',4'
‑
d7,缬氨酸
‑
2,4,4,4,4',4',4'
‑
d7,缬氨酸
‑
2,3,4,4,4,4',4',4'
‑
d8,亮氨酸
‑
5,5,5
‑
d3,亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d6,亮氨酸
‑
4,5,5,5,5',5',5'
‑
d7,亮氨酸
‑
3,3,5,5,5,5',5',5'
‑
d8,亮氨酸
‑
3,3,4,5,5,5,5',5',5'
‑
d9,亮氨酸
‑
2,5,5,5,5',5',5'
‑
d7,亮氨酸
‑
2,3,3,5,5,5,5',5',5'
‑
d9,亮氨酸
‑
2,4,5,5,5,5',5',5'
‑
d8,亮氨酸
‑
2,3,3,4,5,5,5,5',5',5'
‑
d
10
,2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊酸,2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
5,5,5
‑
d3,2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
4,4,5,5,5
‑
d5酸,2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
2,5,5,5
‑
d4酸,2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
2,3,5,5,5
‑
d5酸,2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
3,4,4,5,5,5
‑
d6酸,2
‑
氨基
‑3‑
(cd3)戊
‑
2,3,4,4,5,5,5
‑
d7酸，2
‑
氨基
‑3‑
甲基戊
‑
5,5,5
‑
d3酸，但不限于此。
[0070]
本文件中的术语“体素”指扫描区域的最小体积元素，其对应于氘信号强度的特定值或特定局部光谱。
[0071]“结构上不等价”在本文中定义为天然支链氨基酸结构中的任意两个位置，在下图中用不同符号表示。
[0072][0073]
此外，一个支链氨基酸结构中的任何位置相对于另一支链氨基酸结构中的任何位置(尤其是，缬氨酸结构中的任何位置相对于亮氨酸结构中的任何位置)都被认为在结构上是不等价的。例如，结构上不等价是：a)l
‑
缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6中的位置4和4'；b)l
‑
缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6中的位置4和l
‑
缬氨酸
‑
3,4,4,4,4',4',4'
‑
d7的位置3；c)l
‑
缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6的位置4和缬氨酸
‑
4,5,5,5,5',5',5'
‑
d7的位置4。
[0074]
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指适合用于与人和动物组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应等，并且满足合理的风险收益比的那些盐。胺、羧酸、膦酸盐和其他类型化合物的药学上可接受的盐在医学中是众所周知的。盐可以在本发明化合物的分离或纯化过程中原位制备，也可以通过本发明化合物的游离酸或游离碱分别与合适的碱或酸反应而单独制备。药学上可接受的无毒酸盐的实例是氨基与无机酸如盐酸、磷酸或有机酸如乙酸、草酸、马来酸、富马酸、酒石酸、琥珀酸、抗坏血酸、柠檬酸、丁酸、乳酸、葡萄糖酸形成的盐，或通过本领域中使用的其他方法获得，例如，使用离子交换。典型的碱金属和碱土金属盐包含钠、钾、钙、镁等。此外，如果需要，药学上可接受的盐可以包含使用抗衡离子如卤化物、氢氧化物、羧酸盐、硫酸盐、磷酸盐等获得的无毒铵、季铵和胺阳离子。
[0075]
本发明的诊断药物可以包括一种或多种适用于特定剂型的任何药学上可接受的赋形剂，特别是任何载体、稀释剂和/或填充剂，这样可以与构成本发明的本质的化合物一起给药于患者的身体。其不会破坏该化合物，并且在给药时是无毒的。药学上可接受的赋形剂的非限制性具体实例包括氯化钠、葡萄糖、甜味剂、食用香料、色素等。
具体实施方案
[0076]
使用2hmri或mr波谱成功诊断疾病的基础是特定氘代化合物在各种组织中选择性累积的能力。同时，从核磁共振方法的基本物理限制(回旋磁比、氘核的弛豫参数)的角度出发，产生足够强度的信号。在这种情况下，氘信号的强度：
[0077]
a)与组织中达到的氘浓度成正比(取决于剂量、膜传输动力学、组织的浓缩能力)，
[0078]
b)与扫描时间的平方根成正比(该时间受氘代化合物的清除率和/或代谢率以及患者在整个扫描过程中保持不动的需要限制)，
[0079]
c)取决于弛豫时间t1(确定最大平均速率，从而确定每单位时间接收的总信号强度；对于不同的化合物，其差异为几倍：参见.生物磁共振(biological magnetic resonance),卷11,in vivo spectroscopy.berlinerl.j.,reuben,j.(eds.),springer,1992).
[0080]
每种化合物都有独特的药代动力学参数(特别是化合物的浓度及其在血液、各种器官和组织中的变化速率)。在这种情况下，药代动力学以不明显的方式取决于使用的剂量(特别是，特定化合物的肾脏再吸收能力过大可能导致其加速排泄)。此时，剂量受到该化合物毒性和溶解性的限制。作者进行的实验以及对现有技术的参考表明，自由扩散的氘代化合物(如d2o)不会在受试者的各种器官和组织中表现出选择性累积。
[0081]
作者发现本发明的氘代天然支链氨基酸衍生物：
[0082]
能够在动物组织中选择性累积，其浓度足以用于体内各种器官和组织通过2hmri或mr波谱的可视化，包括癌症肿瘤；
[0083]
‑
具有允许使用无毒剂量的药代动力学特性，同时成功记录2hmri和/或2hnmr光谱；
[0084]
‑
当浓度足以成功记录2hmri和/或2hnmr时，其特征是排泄和代谢相当缓慢，符合氘断层成像和mr光谱法的时间限制。
[0085]
反过来，这允许通过氘磁共振成像，有效诊断伴随细胞营养吸收水平的局部改变(增加或减少)的疾病和病理过程，包括确定肿瘤疾病的存在和定位。同时，我们的实验证明，其他氨基酸，特别是甘氨酸
‑
d2、l
‑
丙氨酸
‑
3,3,3
‑
d3和l
‑
苯丙氨酸
‑
β,β,2,3,4,5,6
‑
d7不具有合适的物理化学和生物学特性，因此不能用于2hmri或mr波谱诊断疾病。
[0086]
缬氨酸和亮氨酸(
14
c、
13
c、3h)的同位素标记衍生物先前用于通过分析从各种生物组织匀浆中分离的蛋白质部分来确定蛋白质合成速率(参见:attaix等人,biochim.biophys.acta1986,882,389
‑
397；goto等人,chem.soc.bull,1977,25(7),1574
‑
1581)。然而，这些研究缺乏数据表明在与体内2hmri或nmr记录兼容的病理学组织中，获得未结合在蛋白质中的缬氨酸或亮氨酸，以及其低分子量的代谢物的的浓度是可能的。根据goto等人的数据，也可以得出结论，在给药后10分钟内，肝脏和胰腺中累积的大部分
14
c缬氨酸包含在蛋白质成分中。
[0087]
来自研究[washburn等人,nucl.med.1978,19,77
‑
83]已知剂量高达5mg/kg的外消旋1
‑
14
c标记缬氨酸会在动物胰腺中累积。在这种情况下，仅在0.021mg/kg剂量的情况下，可以根据所提供的数据计算出不同组织中
14
c同位素的绝对浓度，这比实施2hmri所需的剂量低约500倍。同时，也没有文献数据表明，在剂量约为0.05
‑
1g/kg时，动物组织中缬氨酸可达到的最大浓度。从我们的数据(表1)可以看出，缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6的甲基基团中的氘在动物器官中的分布不同于观察到的1
‑
14
c
‑
缬氨酸的放射性标记。观察到的分布差异是由于两个因素:
[0088]
1)本发明缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6的剂量比1
‑
14
c
‑
缬氨酸的最大研究剂量高100倍以上。靶组织中的累积效率取决于动物或人类细胞中胞内和胞外氨基酸的浓度的比率。从现有技术已知，该比率取决于细胞外浓度。因此，对于2
‑
氨基异丁酸和小鼠胸腺细胞，随着细胞外浓度从10
‑6增加到>10
‑2mmol/l，该比率从100:1下降到1:1[helmreich,e.,
kipnis,dm1962,237,8,2582
‑
2589]。因此，根据现有技术，随着剂量增加两个数量级(即，当从1
‑
14
c
‑
缬氨酸传递到缬氨酸
‑
d6)，会预期各种组织中，累积选择性和对比度水平将急剧下降。此外，体内高剂量氨基酸(例如，本发明的氘代缬氨酸)的给药导致各种器官和组织中缬氨酸浓度的不成比例增加(表1)。
[0089]
2)由于1
‑
14
c
‑
缬氨酸的放射性衰变而观察到的信号是来自游离缬氨酸、包含在蛋白质中的缬氨酸和其他含有
14
c同位素的缬氨酸代谢物(例如，1
‑
14
c
‑
酮异戊酸)的信号的叠加。同样的研究表明，
14
c同位素标记以[
14
c]
‑
co2的形式被迅速清除(以co2的形式消除，在60分钟内达到28％)。另一方面，本发明的诊断药物中氘甲基的观察信号包括异丁烷酸(在1
‑
14
c
‑
缬氨酸的情况下不可见的脱羧产物)的信号，同时不包含蛋白质的贡献(蛋白质的弛豫参数与2hmri中的成像不兼容)。因此，本发明的诊断药物和1
‑
14
c
‑
缬氨酸提供了关于各种化合物在体内分布的信息。
[0090]
由于在实施本发明的方法期间，蛋白质中的缬氨酸
‑
d6残基对2h信号没有贡献，基于缬氨酸
‑
d6的诊断药物允许在不掺入蛋白质的情况下选择性地可视化游离缬氨酸及其低分子量代谢物信号。
[0091]
放射性标记的亮氨酸衍生物先前已用于评估蛋白质合成速率(例如1
‑
11
c
‑
亮氨酸：p.j.hellyer等人neuroimage,2017,155,209
‑
216)。与缬氨酸的情况一样，当合成过程中亮氨酸包含在蛋白质成分中时，mri中亮氨酸的弛豫时间会发生显著变化，这使得有可能选择性地跟踪游离亮氨酸及其低分子量代谢物的信号(在基于放射性标记的方法的情况下不可能)
[0092]
天然支链氨基酸的氘代衍生物的一个显著特征是能够在mri或mr光谱中同时观察到多个氘信号，使用一种衍生物或含有在几个结构上不等价位置上同时含有的氘原子的衍生物的混合物，例如缬氨酸
‑
2,4,4,4,4',4',4'
‑
d7。值得注意的是，在支链氨基酸的逐级代谢过程中，结构上的不等价位置顺序地改变了相应氘原子的化学位移，并且选择性地获得了将水中的氢替换为氘的能力。与基于放射性同位素的方法不同，除了氘代衍生物的累积水平外，这还允许根据药物氘信号强度的差异获得支链氨基酸局部代谢的信息。在此情况下，支链氨基酸的α位置与不同位置的氘原子核磁共振信号的强度比反映了研究中扫描区域的体素在转氨速率(如表1所示)和随后支链氨基酸分解代谢方面的差异。支链氨基酸的分解代谢是分阶段进行的：首先是α位置被氧化(在这种情况下，a位置的氘原子在氘代衍生物中丢失)，然后相应的酮酸被脱羧，之后，对应于缬氨酸3
‑
4位置和亮氨酸或异亮氨酸3
‑
5位置的片段的逐步氧化过程(在这种情况下，氘原子在氘代衍生物的相应位置丢失)。已知支链氨基酸被细胞用于蛋白质合成，也是重要的能量来源。因此，支链氨基酸代谢的局部速率增加可能表明局部扩撒速率增加，特别是肿瘤或其某些部分的生长或恶性。使用支链氨基酸代谢的此类附加诊断信息使得本发明的诊断方法更加可靠。支链氨基酸氘代衍生物不同位置的氘原子核磁共振信号的强度比，可以每次扫描测量一次，也可以多次扫描测量一次。
[0093]
单一诊断产品中两种不同的氘代支链氨基酸衍生物的重量比可以在1:1至1:10的范围内，但不限于此。
[0094]
从现有技术可知，不同的氨基酸在动物和人体细胞中具有不同的累积动力学，并且在平衡状态下达到的浓度梯度也相差数十倍[johnstone,r.m.,scholefield,p.g.,
adv.cancerres.1965,9,143
‑
226]。体内氨基酸的行为因全身水平的体内平衡和定向运输而进一步复杂化。特别是，众所周知，肌肉释放的过量丙氨酸会被肝脏主动吸收；在生理浓度下，谷氨酰胺会被多种类型的癌性肿瘤主动吸收。由于氘断层扫描或光谱学涉及的给药剂量比生理剂量高几倍，不同的器官和组织对各种氨基酸具有不同的累积动力学和能力，如果没有直接实验，就不可能预测特定氨基酸的选择性累积的存在。
[0095]
本发明诊断药物的氘代组分(支链氨基酸衍生物)的一个重要特性是对在体内的氘替换氕的代谢交换具有足够的抵抗力。这种交换降低了氘标记的浓度，同时增加了由于快速扩散而均匀分布在全身的重水(doh)背景信号。该过程导致图像对比度降低，并且还阻止通过与自然doh信号强度比较对氘代成分浓度进行定量评估。我们的研究表明，某些氘代天然氨基酸，特别是甘氨酸
‑
2,2
‑
d2和l
‑
丙氨酸
‑
3,3,3
‑
d3，不能用于获得与本发明相关的具有诊断意义的图像，因为它们在体内很快失去氘。
[0096]
由于体内氘含量低(氢原子的0.015％)，2hmri的背景信号比1hmri低几个数量级。因此，即使在低浓度的诊断药物下，其信号也不会叠加在天然背景成分的信号上。由于存在大量天然低分子量化合物的背景信号，其强度可与非氘代诊断药物的最大可实现信号强度相媲美，因此难以开发基于1hmri的使用非氘代诊断药物的类似方法。
[0097]
诊断药物的有效性还取决于氘代衍生物结构中足够数量的氘原子。因此，包含含有一个或多个cd3基团的天然支链氨基酸的氘代衍生物的诊断药物是本发明的优选实施例。此类群体的存在允许使用较低剂量的诊断药物进行诊断，从而将副作用降至最低。
[0098]
本发明的方法使得诊断，尤其是伴随实体瘤(原发性和转移性)的形成和/或淋巴结转移的肿瘤疾病的是否存在，成为可能。可以用氘代诊断药物诊断的肿瘤疾病包括：乳腺癌、肺癌、前列腺癌、黑色素瘤、脑癌(包括从其他肿瘤的转移)、肾癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、非霍奇金淋巴瘤、肝癌、肉瘤，但不限于此。除肿瘤疾病外，本发明的方法还可用于诊断具有高代谢活性或细胞增殖特征的其他疾病：例如，在移植器官和细胞排斥的情况下，在自身免疫、炎症或感染性疾病中，在伴有主动再生的肝损伤中。还可以诊断由于各种器官(例如心脏、大脑、肾脏)的血液供应紊乱(缺血)而导致的疾病。通过2hmri或mr光谱观察到，血液供应的破坏会导致这些器官中氨基酸(包括支链氨基酸)的吸收率和累积水平的降低。
[0099]
本发明的方法基于氘代诊断药物的使用和以氘频率记录断层图和/或核磁共振谱。作者不知道使用氘代天然支链氨基酸对疾病进行mri诊断。
[0100]
众所周知，在许多情况下，1hmri本身的诊断准确性不足。这同样适用于基于灌注参数测量的mri方法(例如，动态对比增强mri)。与灌注方法相反，本发明的诊断方法提供了关于细胞中膜转运速率和支链氨基酸累积水平的数据，典型地，用于pet或spect，且在实施1hmri的传统方法中是不可用的。因此，本发明的方法提供更准确的诊断信息。特别地，在肿瘤疾病的情况下，本发明的方法可以评估靶组织的代谢活性，并因此推断肿瘤是恶性的还是良性的，并评估其侵袭性。本发明的诊断药物的信号可观察至少3小时(见图2)。在长达3小时的重复扫描过程中，癌症肿瘤和各种内脏(肝、脾、胰、肾)信号强度的变化率反映了这些组织和器官的灌注和代谢活动水平，可以通过用于基于氘断层扫描和/或mr光谱进行更准确的诊断。
[0101]
在实施例的特定情况下，利用诊断药物的氘信号的空间分布来推断肿瘤的空间结
构。
[0102]
在本发明的其他具体实施例中，诊断药物含量增加的区域中氘信号的强度用于得出关于肿瘤恶性程度/侵袭性的结论。恶性肿瘤的特点是代谢更加活跃，膜转运活性增加。因此，在恶性程度较高的肿瘤中，氘的信号强度会更高。
[0103]
在本发明的其他具体实施例中，通过诊断药物的氘信号强度的变化率来评估靶区中的灌注。在灌注程度较高的区域，氘信号随时间的变化率(从肿瘤组织中开始累积到完全消除)较高。
[0104]
以对诊断有效的量使用本发明的诊断药物。在这种情况下，有效量是指当最有可能发生预期效果时给患者服用的化合物(天然支链氨基酸的氘代衍生物和/或其药学上可接受的盐)的量
‑
可能通过磁共振成像和/或氘磁共振光谱实施本发明诊断方法。由于氘mri方法的基本限制，氘代支链氨基酸衍生物和/或其药学上可接受的盐的量不能超低，并且使用剂量超过10mg/kg，例如0.1
‑
1.5g/kg。特别是，在计算不同物种哺乳动物的药物剂量时，通常使用的不是重量，而是身体的表面积，其非线性依赖于重量。所需的确切剂量可能因受试者而异，具体取决于哺乳动物种类、年龄、体重和患者的一般状况、疾病的严重程度以及给药方法。
[0105]
从现有技术中还知道，同一化合物的半衰期在不同物种之间可能不同(通常，较大物种的半衰期更长)，因此，不同哺乳动物给药和扫描之间的最佳时间可能显著不同。给药和扫描之间的最佳时间取决于疾病的性质和受检者身体的部位。除其他外，氘信号的记录可以持续到诊断药物的给药结束，并且只要氘信号存在于扫描区域中，就可以继续或重复。
[0106]
本发明的诊断药物可通过对诊断有效的任何给药途径给予患者，例如，可通过口服、肠外、局部等给药。
[0107]
在本发明的一个实施例中，诊断过程包括mri，并按如下方式实施：
[0108]
a)在本发明的一些实施例中，进行氕(1h)mri。1hmri的记录首先允许对氘信号进行解剖分配，其次，识别疑似病理的区域，特别是恶性肿瘤(在其他实施例中，2hmri的区域可以通过其他方式确定，特别是通过超声波、计算机断层扫描、射线照相术、触诊、活组织检查、生物液体肿瘤标记物分析、放射性核素诊断和/或目视观察)；
[0109]
b)给予诊断药物；
[0110]
c)在足以使诊断药物在受试者的靶组织中累积的时间之后，以诊断药物氘核的进动频率记录断层图；
[0111]
d)对获得的氘断层图进行分析，以发现具有异常高或低强度的区域，从而对应于诊断药物的选择性累积。特别是，可以比较1h和2h的断层图像：如果1h和2h的异常区域重合，可以说病理学的可能性更大。
[0112]
在本发明的另一个实施例中，诊断过程包括进行氘mr波谱，并如下进行：
[0113]
a)进行1hmri，然后识别出疑似病理的区域，尤其是恶性肿瘤(在本发明的其他实施例中，2hmri区域的确定可以通过其他方法进行，尤其是通过超声检查、计算机断层扫描、射线照相、触诊、活组织检查、肿瘤标志物生物液体分析、放射性核素诊断和/或目视观察)；
[0114]
b)给予诊断药物；
[0115]
c)在足以使诊断药物在受试者的靶组织中与可疑病理区域对应的体素中累积(例如，根据1hmri的结果)的时间之后，记录氘光谱(特别是，使用局部光谱的方法)；任选地，记
录相邻的体素的光谱以比较信号强度；
[0116]
d)比较疑似病理区域对应的体素中的信号强度，特别是，与：(i)给定器官或组织的典型值(应在健康受试者中提前确定)和/或(ii)与相同器官或组织且1hmri无异常的对应的相邻体素中的信号强度进行比较。信号强度的增加或降低表明诊断药物的选择性累积，因此，存在病理，尤其是恶性肿瘤。
[0117]
本发明的上述两个实施例中的步骤“a)、b)、c)”的顺序可以更改为“b)、a)、c)”或“b)、c)、a)”。还可以并行记录信号1h和2h(即，同时进行阶段“a)”和“c)”。
[0118]
在本发明的特定实施例中，在识别具有可疑恶性形成的区域后，选择位于可疑区域内和外的单个体素(具体而言，可以选择位于穿过可疑区域边界的同一条线上的一系列相邻体素)。记录选定体素的2h或局部2h光谱的积分信号与其强度的后续比较，可以快速且更高灵敏度地检测诊断药物累积的区域。
[0119]
mri图像和mr光谱可在任何配备有记录氘信号设备的mri扫描仪上获得。
[0120]
天然支链氨基酸氘代衍生物的一个显著特征是，这些氨基酸是人体和动物身体的天然营养素和成分。这使得它们作为诊断药物与非天然氨基酸相比更安全。本发明作者进行的检查表明，动物对诊断药物具有良好的耐受性，在配备有记录氘信号设备的任何mri扫描仪上以指定剂量使用时，没有明显的副作用。现有技术已知支链氨基酸在高剂量(ld50>5g/kg)给药时是安全的。考虑到氘代支链氨基酸衍生物的有效分解代谢，同时以doh的形式释放氘(在极高剂量下无毒，可替换体内高达10
‑
30％的水，且其也以约1x10
‑2mol/l的浓度存在于体内的水中)，我们认为引入多个氘原子不会产生相应副作用。
[0121]
在特定实施方式中，诊断药物可包含支链氨基酸代谢抑制剂，尤其是支链氨基酸转氨酶抑制剂。bcat；即是抑制剂的一个例子：hu,l.y.等人.bioorg.med.chem.lett.2006,16,9,2337
‑
2340)。抑制支链氨基酸的代谢允许更长时间的断层扫描检查和/或降低诊断药物的剂量和/或增加灵敏度，并因此提高本发明诊断方法的可靠性。使用支链氨基酸的个别转氨酶亚型的选择性抑制剂作为诊断药物的一部分，可用于可视化扫描区域不同部位个别亚型的活性。
[0122]
本发明的方法在没有电离辐射有害影响的情况下进行(典型的，例如，ct、pet、spect)，这反过来增加了检查的安全性，使得能够进行更频繁的重复研究，特别是，使该方法对儿科具有吸引力。
[0123]
基于1hmri和/或其他诊断方法的结果证明，本发明的诊断方法可用于，尤其是各种定位的恶性肿瘤、转移性病变的早期诊断、对治疗的肿瘤反应的评估和关于治疗有效性的结论。
[0124]
本发明的方法扩展了非侵入性诊断的现有可能性，并允许有效诊断肿瘤疾病。
[0125]
氘代支链氨基酸衍生物的药学上可接受的盐具有用于本发明诊断药物所需的所有性质。
[0126]
本发明的实施例
[0127]
实施例中给出的可靠数据证实了使用本发明时技术结果客观体现的可能性，这些数据包含在根据本领域应用的方法进行研究过程中获得的实验数据。附图说明了本发明的本质。
[0128]
应当理解，申请材料中给出的这些和所有实施例都不是限制性的，仅用于说明本
发明。
[0129]
本文件中给出的实施例用于说明所开发方法的操作原理，并且不限制使用的剂量范围，以及服用诊断药物和记录氘信号之间的时间范围，因为，根据所用设备的灵敏度和其他参数、诊断的疾病和受试者(人类或实验动物)的性质，药物累积所需的剂量和时间可能有所不同。具体而言，从现有技术可知，同一化合物的半衰期可在不同动物物种之间变化，并且当从一种动物变化到另一种动物或人类时，剂量往往与体表面积成比例，而不是与体重成比例。氘信号的记录也可以在诊断药物给药结束之前进行。此外，用于记录波谱和断层图的上述参数(包括信号累积时间)是本发明特定实施例的一部分，并且可以根据所使用的设备和特定诊断任务而变化。
[0130]
缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6的合成
[0131]
缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6由文献(y.n.belokon等人,tetrahedron:asymmetry1998,9,4249
‑
4252)中描述的镍(ii)络合物(s)
‑
bpb
‑
ni
‑
gly合成，根据其给出的方法：
[0132][0133]
在氩气气流下，10g(0.02mol)络合物1与12ml干燥的二甲基甲酰胺(dmf)的混合溶液冷却至0℃。然后，向溶液中加入1g(0.025mol)细磨的naoh并剧烈搅拌5分钟。然后，在0℃下,将2ml(2.62g，0.021mol)异丙基溴
‑
d6滴加到该溶液中并搅拌30分钟，然后将温度升至室温并再搅拌1.5小时。反应完成后，再次冷却溶液，然后向其中滴加乙酸溶液(1.5ml冰冷的ch3cooh溶于20ml水中)。在添加乙酸溶液期间，析出络合物2。滤出所得沉淀物，用水洗涤并干燥。得到红色粉末状的配合物2(10.5g,0.019mol,97％)。
[0134]1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.24(d,j＝8.6hz,1h),8.01(d,j＝7.4hz,2h),7.56
‑
7.40(m,4h),7.32(t,j＝7.6hz,2h),7.20
–
7.09(m,2h),6.91(d,j＝7.6hz,1h),6.68
‑
6.60(m,2h),4.47(d,j＝12.8hz,1h),3.82(d,j＝3.2hz,1h),3.62(d,j＝12.6hz,1h),3.54
‑
3.42(m,2h),3.38
‑
3.28(m,1h),2.88
‑
2.75(m,1h),2.61
–
2.42(m,1h),2.12
‑
2.01(m,2h),1.79
‑
1.72(m,1h).
[0135]
将12ml 12m hcl和18ml水加入到含有10.5g(0.019mol)络合物2的17ml甲醇溶液中，然后将混合物在回流下煮沸至沸腾30分钟。然后蒸发反应混合物。过滤形成的手性配体沉淀物，用水洗涤数次，然后干燥。配体为白色粉末，产率为81％(6.82g)。收集的水层用25％氨水溶液中和，溶液中残留的手性配体用二氯甲烷(3x30ml)萃取，然后通过纸过滤器过滤水层。用离子交换色谱法纯化缬氨酸
‑
d6。为此，将水溶液添加至h

形式的ku
‑
2离子交换
树脂(13x3cm)中。首先，用水(300ml)冲洗树脂柱，然后用5％氨溶液(200ml)冲洗缬氨酸
‑
d6。将所得溶液蒸发至干燥，产物从水和乙醇的混合物中重结晶。缬氨酸
‑
d6为白色粉末(1.37g，62％)。
[0136]1h
‑
nmr(400mhz,d2о):δ＝3.49(d,j＝4.4hz,1h),2.16
‑
2.10(m,1h).
[0137]
13
c
‑
nmr(101mhz,d2o)δ＝174.3,60.3,28.6,17.6
‑
15.0(m).
[0138]
缬氨酸
‑
2,4,4,4,4”,4”,4'
‑
d7的合成(与缬氨酸
‑
4,4,4,4”,4”,4'
‑
d6混合)
[0139]
将20当量甲醇
‑
d1和5mol％三乙胺加入到10g(0.02mol)配合物1的50ml二氯甲烷中的溶液中，并在室温下搅拌18小时。所得复合物1
‑
d无需纯化即可用于下一阶段。
[0140]1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3):δ＝8.30(d,j＝8.6hz,1h),8.09(d,j＝7.3hz,2h),7.62
–
7.49(m,3h),7.44(t,j＝7.5hz,2h),7.32(t,j＝7.4hz,1h),7.23(t,j＝7.3hz,1h),7.12(d,j＝6.8hz,1h),7.05
–
6.95(m,1h),6.82(d,j＝7.6hz,1h),6.72(t,j＝7.4hz,1h),4.50(d,j＝12.6hz,1h),3.73
–
3.64(m,2h),3.49(dd,j＝10.7,5.4hz,1h),3.44
–
3.30(m,1h),2.64
–
2.53(m,1h),2.52
–
2.36(m,1h),2.22
–
2.03(m,2h).
[0141]
在氩气气流下将5g(0.01mol)络合物1
‑
d的6ml无水二甲基甲酰胺(dmf)溶液冷却至0℃。然后，向溶液中加入0.5g(0.0125mol)细磨的naoh并剧烈搅拌5分钟。然后在0℃下将1ml(1.31g，0.01mol)异丙基溴
‑
d6加入溶液中并搅拌30分钟，然后将温度升至室温并再搅拌1.5小时。反应完成后(tlc分析)，再次冷却溶液；滴加乙酸溶液(1.5毫升冰冷的ch3cooh溶于20ml水中)。当加入乙酸溶液时，产生的2
‑
d络合物沉淀出来。
[0142]
将3ml浓hcl溶液(12m溶液)和5ml水加入2g(0.004mol)2
‑
d络合物的5ml甲醇溶液中，然后将混合物在回流下煮沸至沸腾30分钟。然后蒸发反应混合物。用水洗涤形成的沉淀，过滤出手性配体并用水洗涤数次。收集的水层用25％氨溶液中和，溶液中残留的配体3用二氯甲烷(3x10ml)萃取，然后将水层通过滤纸过滤，并添加到h

形式的ku
‑
2离子交换树脂中(13x3cm)。首先用水(300ml)洗涤树脂柱，然后用5％氨溶液(200ml)从柱上洗涤缬氨酸
‑
d6/d7。通过硅胶液相色谱法(洗脱液：二氯甲烷
‑
甲醇
‑
水)从甘氨酸杂质中纯化缬氨酸
‑
d6/d7。产量：172mg(35％)。
[0143]1h
‑
nmr(400mhz,d2о):δ＝3.49(d,j＝4.4hz,1h),2.16
‑
2.10(m,1h).
[0144]
基于质谱分析，对应于d5、d6和d7的同位素形式的峰的比率为6.1:49.5:44.4。d5型是甲基不完全氘代的产物。考虑到
13
c同位素的贡献和α位的同等氘代程度，无论甲基的氘代程度如何，最终产物中α
‑
氘代形式的缬氨酸的总摩尔分数为49％。
[0145]
亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d6的合成
[0146]
1)异丁醇
‑
d6[0147]
将4.19g镁倒入双颈烧瓶中，连接回流冷凝器并安装到喷水泵上以抽空烧瓶。烧瓶用热空气加热几分钟。将烧瓶冷却至室温后，加入20mlthf和碘晶体，用氩气吹扫，并在室温下搅拌～10分钟。将氯化钙管连接到冰箱，缓慢加入溶有异丙基溴
‑
d6(22.5g，0.17mol)的68毫升thf的溶液(约2.5小时)。混合物加热并变成灰色。加入全部异丙基溴后，将反应混合物在50
‑
60℃下加热2小时。然后将反应混合物冷却至室温并分批加入干燥且精细研磨的多聚甲醛(5.22g，0.17mol；提前在磷酸酐上真空干燥两天)。将反应混合物在50℃下搅拌3小时，然后在室温下放置过夜。在旋转蒸发器上将溶剂蒸发至干燥。将干燥的残余物溶解在75ml二氯甲烷中，并用20％硫酸溶液缓慢酸化至弱酸性介质。分离有机层，水层用25ml二氯
甲烷萃取3次。合并的有机萃取液用苏打溶液洗涤并用硫酸钠干燥。过滤后，有机相用回流冷凝器分馏，分别收集沸点范围为85
–
100℃和100
–
115℃的馏分。第一个馏分由thf和产品组成，比例为2.5:1。第二个馏份包含少量的thf混合物。总产率：70％。1нnmr谱(600mhz,cdcl3,ppm):δ＝3.37(2h,d,3j＝6.5hz,ch2),1.94(1h,brs,ch).
[0148]
2)异丁基溴
‑
d6[0149]
将异丁醇
‑
d6(4.9g，0.06mol)冷却至
‑
10℃，并缓慢滴加pbr3(10.3g，0.038mol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。从反应混合物中蒸馏出异丁基溴
‑
d6，收集在65
–
90℃下沸腾的馏分。蒸馏物用水清洗并在沸石上干燥。收率：6.6g(73％)。1нnmr谱(600mhz,cdcl3,ppm):δ＝3.30(2h,d,3j＝6.1hz,ch2),1.93
–
1.95(1h,m,ch).
[0150]
3)亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d6[0151]
亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d6的制备类似于缬氨酸
‑
d6，方法是用等量的异丁基溴
‑
d6取代异丙基溴
‑
d6。再结晶后的最终产品收率为50％。
[0152]1h
‑
nmr(600mhz,d2o,内标：甲醇):δ＝1.64
‑
1.76(3h,m),3.71(1h,dd,3j＝6.0,8.4hz,ch
‑
).
[0153]
13
c
‑
nmr(101mhz,d2o,内标：甲醇)δ＝20.4(cd3),24.31,40.33,54.08,176.24.
[0154]
在下面的实施例中，使用具有7.05t恒定场的bruker biospecbc70/30usr断层扫描仪，配备调谐到1h(发射/接收)和2h(发射)的鸟笼线圈，以及直径为5cm的表面接收线圈。
[0155]
使用flash(快速低角度拍摄)脉冲序列记录氘断层图像。激发频率由2hnmr谱测定，并在仪器上用：sfo1≈46.17452mhz，矩形激发脉冲2560hz宽，11.2db功率，偏转角fa＝30
°
，重复时间tr＝11.8ms，回波时间te＝4.07ms，扫描区域10cm x 10cm，扫描矩阵50x50，切片厚度3cm，带宽12500hz，总扫描时间9分34秒(1024次累积)。
[0156]
实施例1.记录含氘代缬氨酸稀溶液样品的氘断层图和2hnmr光谱。
[0157]
为了证明记录氘代缬氨酸稀释溶液的氘断层图像的基本可能性，进行了以下实验。
[0158]
装有溶在蒸馏水中的5ml缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6或亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d6(5mg)溶液的玻璃小瓶，被放置在断层扫描仪磁铁的中心。将直径为5cm的表面线圈水平放置在小瓶正上方。
[0159]
图1a显示了缬氨酸
‑
4,4,4,4',4',4'
‑
d6样品的氘断层图(左侧)和2h光谱(右侧)。
[0160]
图1b显示了亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d6样品的氘断层图(左侧)和2h光谱(右侧)。
[0161]
实施例2.采用含有缬氨酸
‑
4,4,4,4”,4”,4'
‑
d6的诊断药物，使用氘断层扫描，可视化小鼠体内的4t1乳腺癌。
[0162]
在本实施例中，采用移植有4t1乳腺癌的balb/c小鼠进行实验(实验前12天在左前爪下注射5
·
105细胞/60μl)。向体重为20g的动物腹腔注射20mg缬氨酸
‑
d6的0.5ml水溶液。注射后10分钟内，用异氟醚固定动物，并将其放置在断层摄影机的加热床上。如图2虚线所示，将表面2h接收线圈从背侧固定在动物身体前部上方。
[0163]
图2显示，随着时间的推移，氘代缬氨酸衍生物在肿瘤组织中累积，在给药后约90分钟观察到氘信号的最大强度。从给出的数据可以看出，氘信号持续了几十分钟；因此，缬氨酸
‑
d6具有良好的药代动力学，可用于2hmri和mr波谱分析。
[0164]
从上述结果可以看出，基于氘代缬氨酸衍生物的诊断药物，可通过2hmri和/或mr
波谱方法用于包括肿瘤在内的疾病的非侵入性诊断。
[0165]
实施例3.采用含亮氨酸
‑
d6的诊断药物，使用氘断层扫描可视化小鼠体内4t1乳腺癌
[0166]
在本例中，在移植有4t1乳腺癌的balb/c小鼠上进行实验(实验前12天在左前爪下注射5
·
105细胞/60μl)。向体重为20g的动物腹腔内注射25mg亮氨酸
‑
5,5,5,5',5',5'
‑
d6的0.8ml水溶液。注射后10分钟内，用异氟醚固定动物，并将其放置在断层扫描仪的加热床上。接收2h线圈的表面位于动物身体前部的背侧。图3显示了给药40分钟后得到的图像。
[0167]
从上述结果可以看出，基于氘代亮氨酸衍生物的诊断药物可通过2hmri和/或mr波谱用于包括肿瘤在内的疾病的非侵入性诊断。
[0168]
实施例4.采用含l
‑
丙氨酸
‑
3,3,3
‑
d3和l
‑
苯丙氨酸
‑
β,β,2,3,4,5,6
‑
d7的诊断药物，使用氘断层扫描可视化小鼠体内4t1乳腺癌。
[0169]
在本例中，在移植有4t1乳腺癌的balb/c小鼠上进行实验(实验前12天在左前爪下注射5x105细胞/60μl)。
[0170]
向体重为20g的动物腹腔注射溶液：
[0171]
a)30mg l
‑
丙氨酸
‑
3,3,3
‑
d3的0.5ml水溶液；或
[0172]
b)10mg l
‑
苯丙氨酸
‑
β,β,2,3,4,5,6
‑
d7的1.0ml水溶液(由于苯丙氨酸的低溶解度，相当于氘的较低剂量的苯丙氨酸，因此，不可能在不损害受试者健康的情况下引入更大体积的诊断药物)。
[0173]
在注射后10分钟内，用异氟醚固定动物并放置在断层扫描仪中的加热床上。接收2h线圈的表面位于动物身体前部的背侧，如图4中的虚线所示。
[0174]
图4显示丙氨酸和苯丙氨酸的氘代衍生物不会在肿瘤组织中累积，并且在各种器官中也没有表现出累积选择性。
[0175]
实施例5.以与氘断层扫描相容的剂量给予诊断药物后，测定患有4t1乳腺癌的小鼠组织中缬氨酸4,4,4,4',4',4'
‑
d6的含量。
[0176]
在本例中，对移植了4t1乳腺癌的balb/c小鼠进行了实验(实验前12天在左前爪下注射5x105细胞/60μl)。将20mg l
‑
缬氨酸
‑
d6(s
‑
缬氨酸
‑
d6)的0.5ml水溶液，向体重20g的动物进行腹膜内注射。给药后，将动物关在单独的笼子里，可以获取食物和水。给药一段时间后，将动物脱颈椎处死。迅速取出动物器官和组织的样本，并在液氮中冷冻。冷冻样品在瓷研钵中研磨，同时用液氮冷却。将称重的部分(50
‑
200mg)所得粉末快速加入加热至98℃的0.4％盐酸(0.6
‑
1.0ml)中。所得悬浮液在98℃下保持15分钟并偶尔摇动。加入内标(3
‑
o
‑
(cd3)
‑
葡萄糖溶液)后，将混合物振荡并离心，直至固体部分完全分离。通过2hnmr分析溶液。
[0177]
表1.
[0178][0179]
*根据washburn等人(1978)：健康大鼠每1g相应组织中dl
‑1‑
14
c
‑‑
缬氨酸(0.021mg/kg)的给药剂量百分比。
[0180]
表1中的数据表明，l
‑
缬氨酸
‑
d6在动物不同组织中的选择性累积浓度范围适合用于2hmri或mr波谱。特别是，与注射诊断药物1小时后的肾脏、心脏、大脑、骨骼肌和脂肪组织相比，肿瘤组织中l
‑
缬氨酸
‑
d6的累积增加。
[0181]
同样从表1可以得出结论，不同器官中同位素标记的相对浓度存在显著差异：l
‑
缬氨酸
‑
d6(1.25g/kg)的情况为2h，dl
‑1‑
14
c
‑‑
缬氨酸(0.021mg/kg)的情况为
14
c。根据washburn等人(1978)，表1所示，与约0.5μmol/g的游离缬氨酸生理浓度相比，引入dl
‑1‑
14
c
‑
缬氨酸(0.021mg/kg)，大鼠肝脏和肾脏中,缬氨酸的绝对浓度增加不超过0.3nmol/g[rivera,s.等人.biochem.j.1988,249,443
‑
449]。在我们的缬氨酸
‑
d6实验中，如表1所示，得到了超过动物组织中游离缬氨酸的生理浓度10倍的浓度。
[0182]
实施例6.在以与氘断层扫描相容的剂给予诊断药物后，氘代缬氨酸衍生物混合物在患有4t1乳腺癌的小鼠组织中的分布和代谢的研究。
[0183]
在本实施例中，使用了l
‑
缬氨酸
‑
d6/d7，其在α
‑
位和4、4'位置处部分氘代。(s
‑
缬氨酸
‑
d6/d7)。初始诊断药物中α
‑
氘代类型的缬氨酸的总摩尔分数为49％。
[0184]
实验在移植了4t1乳腺癌的balb/c小鼠上进行(实验前12天在左前爪下注射5
×
105个细胞/60μl)。给体重20g的动物腹膜内注射20mgα
‑
位部分氘代的缬氨酸的0.5ml水溶液。给药后，将动物关在单独的笼子里，可以获取食物和水。给药60分钟后，将动物脱颈椎处死。动物器官和组织的样本被迅速取出并在液氮中冷冻。冷冻样品在瓷研钵中研磨，同时用液氮冷却。将称量的部分(约50mg)所得粉末快速加入加热至98℃的0.4％盐酸(1.0ml)中。将所得悬浮液在98℃下保持15分钟并偶尔摇动，然后离心。溶液用3倍体积的乙腈稀释，15分钟后离心，用9倍体积的水稀释，再次离心。缬氨酸的同位素d5、d6和d7的比例通过lc
‑
ms/ms测定。
[0185]
α氘代缬氨酸的总摩尔分数是：在肿瘤中
‑
12％，在大脑中
‑
5％，在血液中
‑
12％，在
肾脏中
‑
17％，在脾脏中
‑
13％，在肝脏中，骨骼中肌肉和脂肪组织
‑
11％。因此，当肿瘤中的氘浓度达到2hmri可接受的浓度时，氘会从缬氨酸的α位大量损失，这可能是组织转氨酶作用的结果。因此，当肿瘤中的氘浓度达到2hmri可接受的浓度时，肿瘤中缬氨酸α位置的氘会显著减少，这可能是组织转氨酶作用的结果。不同组织中α
‑
位的氘减少的差异表明膜转运和转氨率的速率存在差异，它可以作为评估受试者不同组织切片的代谢状态以及得出是否存在病理学的结论时使用的附加信息。该结果表明，采用含有多种缬氨酸氘代衍生物的混合物或具有几个非等价位置的氘的缬氨酸衍生物作为诊断药物的可能性。
[0186]
尽管已经参考所公开的实施例描述了本发明，但是对于本领域专家来说，应当清楚的是，提供详细描述的特定实验仅仅是为了说明本发明，并且不应当被解释为以任何方式限制本发明的范围。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可以进行各种修改。