一种利用氧化石墨烯-羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氧化还原酶的方法与流程

一种利用氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氧化还原酶的方法
技术领域
1.本发明涉及固定化氧化还原酶的方法，属于酶固定化领域。


背景技术：

2.氧化还原酶是一类能催化两分子间发生氧化还原作用的酶的总称，包括多种重要的酶类。其中，氨基酸脱氢酶(aadh)可催化可逆的氨基酸氧化脱氨和酮酸还原胺化反应。对于非天然底物的还原胺化反应，选择底物2
‑
氧代
‑4‑
苯基丁酸乙酯(eopb)在含铵盐体系中(提供nh
4
受体)进行还原胺化高选择性生成l
‑
高苯丙氨酸(lhpa)。利用aadh可合成非天然氨基酸l
‑
高苯丙氨酸(lhpa)，以便更广泛地应用在药物、新型生物材料和化妆品等领域。
3.由于游离的氨基酸脱氢酶稳定性差，采用固定化的方法可进行改善。固定化酶的性能取决于固定化酶所使用的载体材料的性质和固定化方法。酶的固定化材料包括无机、有机聚合物、凝胶以及生物材料等。目前的氨基酸脱氢酶等氧化还原酶的固定技术，还存在固定化酶稳定性差，重复利用活性低等问题。因此，还有必要对固定化载体和方法进行进一步研究。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种利用氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氧化还原酶的方法。氧化还原酶均可采用此方法，如氨基酸脱氢酶等。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
6.一种利用氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氧化还原酶的方法，在浓度为0.1～50mg/ml的羊毛角蛋白溶液中加入氧化还原酶，并使所述氧化还原酶的终浓度为0.1～100mg/ml，0～50℃混匀后，加入金属离子(mg
2
、zn
2
、ni
2
、mn
2
、cu
2
等)并使其终浓度为0.8～40mm进行配位，随后加入氧化石墨烯溶液并使其终浓度为0.01～100mg/ml，0～50℃混匀，即得氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氧化还原酶。
7.进一步地，所述氧化还原酶包括氨基酸脱氢酶。
8.优选地，所述氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，带有his
‑
tag标签。
9.进一步地，所述羊毛角蛋白采用尿素/硫化钠/十二烷基硫酸钠(sds)工艺溶解羊毛制备得到；其中，羊毛、尿素、九水合硫化钠与十二烷基硫酸钠的质量比为4～20：22～50：5～20：1.4～2，溶解温度为25～65℃，反应时间2～20h。
10.优选地，所述羊毛角蛋白溶液的浓度优选为0.1～0.16mg/ml，羊毛角蛋白溶液浓度为0.14～0.16mg/ml时固定化酶酶活最高。
11.氧化石墨烯(graphene oxide，go)是石墨烯(graphene)的一种重要的衍生物，具有良好的生物相容性，在生物医药、药物缓释、包装材料等领域有广阔的应用前景。go具有和石墨烯相似的二维片层结构，通过控制化学氧化时间可以调控氧化程度。不同氧化程度的go在碳骨架的二维平面上以及边缘带有不同数量的
‑
oh、
‑
cooh和
‑
o
‑
等含氧基团，具有不
同的疏水性能，因此具有良好的生物相容性。
12.羊毛角蛋白(wool keratin，wk)的大分子链中含有大量的肽键结构，这是蛋白质类物质的大分子链结构中所具有的基本骨架结构。除此以外，大分子链表面还有大量的氨基和羧基等官能团。羊毛角蛋白由无规卷曲、α－螺旋和β－折叠平行多肽构象一起组成的极致密的结构。
13.本发明经研究发现，羊毛角蛋白与氧化石墨烯和氨基酸脱氢酶的相互作用可以形成复合材料，具有良好的生物相容性，有利于酶固定化。
14.在一个具体的实施例中，所述方法包括以下步骤：
15.1)粗酶液制备：将可表达带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的重组表达菌株接种到含有卡那霉素的lb培养基中培养，培养一段时间后加入乳糖诱导剂iptg；培养所得菌液，离心获取细胞，配制成细胞悬液；超声破碎并离心，收集上清液即为含有带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的粗酶液；
16.其中，构建可表达带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的重组表达菌株的方法：氨基酸脱氢酶的基因序列如seq id no.1所示；用ndei和xhol分别双酶切上述氨基酸脱氢酶基因和pet28a质粒，连接转化，得到pet28a
‑
aadh质粒；将上述质粒转化至e.coli bl21(de3)，得到可表达带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的重组表达菌株e.coli bl21(de3)/pet28a。
17.将该可表达带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的重组表达菌株e.coli bl21(de3)/pet28a接种到含有卡那霉素的lb培养基中培养，培养一段时间后加入乳糖诱导剂iptg。所述的接种量为1～3％，所述的lb培养基的组成为：胰蛋白胨5.0～15.0g/l，酵母浸膏1.0～10.0g/l，nacl 0.0～15.0g/l，调节ph 7.0～7.5，接种前添加卡那霉素使其终浓度为50～150μg/ml；所述培养条件为36～38℃，150～250rpm培养1.5～6h后加入诱导剂iptg，使其终浓度为5～15mg/ml，继续在25～30℃，150～250rpm下培养2～12h。培养所得菌液，在冷冻离心机中离心(优选为4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲液(ph 7～7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次。用磷酸缓冲液(ph 6.5～8.0)配制成浓度为50～150g/l的细胞悬液。
18.将制备的细胞悬液置于冰浴中，超声细胞破碎仪探头置于液面下1厘米，功率200w，超声3秒，间隔6秒，超声20～60次。然后4℃、12000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的粗酶液。
19.2)纯酶的制备：采用镍柱对步骤1)得到的粗酶液进行纯化并除盐；采用的纯化柱为能够特异性纯化带有his
‑
tagged标签的蛋白质的histrap hp柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐，除盐后获得的液体即为带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的纯酶溶液。
20.3)羊毛角蛋白溶液的制备：首先，称取6克九水合硫化钠，24克脲素和1.44克十二烷基硫酸钠，混合后加入到反应瓶中，加入超纯水使溶液体积达到50ml，将反应瓶放入超声清洗机中超声使固体物质完全溶解。称取5克羊毛加入到蓝口瓶中，使羊毛完全浸没于溶液中，随后将蓝口瓶放入60℃恒温干燥箱中，保温8个小时使其完全溶解。此时的角蛋白溶液不仅含有角蛋白，还有之前加入的化学试剂，可以使用透析的方法通过去离子水将这些化学试剂除去。将初步溶解得到的羊毛角蛋白溶液两两配平放入离心机中，以9000转/分钟的转速离心，离心后过滤后得到淡黄色的角蛋白澄清溶液，接着选用截留分子量为3500da的
透析袋对角蛋白进行透析，每隔2小时更换一次去离子水，透析时间为3天，这样角蛋白溶液中的化学试剂就可以被去除，最后得到提纯后的羊毛角蛋白溶液；
21.4)氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位固定化氨基酸脱氢酶的制备：在步骤3)得到的羊毛角蛋白溶液取其稀释液加入到步骤2)得到的带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶，并使带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的终浓度为0.1～100mg/ml，0～50℃恒温振荡器中振荡，羊毛角蛋白与氨基酸脱氢酶结合完成后加入0.8～40mm金属离子(mg
2
、zn
2
、ni
2
、mn
2
、cu
2
等)进行配位，金属离子螯合后加入配制好的氧化石墨烯溶液(0.01～100mg/ml)混匀，4℃恒温振荡器中振荡，即得氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氨基酸脱氢酶。
22.5)酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含10μl，4mm nadh、160μl，ph 8～12浓度范围为50～200mm的氯化铵
‑
氨水作为氨基供体、10μl，40mm的底物溶液和20μl酶液，所述底物包括2
‑
氧代
‑
基丁酸乙酯、苯丙酮酸或α
‑
酮戊二酸，340nm波长下测定酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗或生成1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
23.本发明同时提供了利用上述方法制备得到的氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氧化还原酶。
24.以如seq id no.1所示的氨基酸脱氢酶为例，利用氧化石墨烯和羊毛角蛋白作为固定载体固定化氨基酸脱氢酶，可以提高氨基酸脱氢酶的温度稳定性与重复使用次数。利用上述方法制备得到的固定化氨基酸脱氢酶的最适ph为9，最适温度为60～70℃；该固定化氨基酸脱氢酶对乙酸和环己烷的耐受性较好。
25.本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。
26.本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。
27.本发明的有益效果如下：
28.片层结构的氧化石墨烯是一种优良的固定化载体，表面缺少环氧基、羰基、羧基等功能性基团，负载面积大。在固定化过程中，氧化石墨烯固定化氨基酸脱氢酶主要为疏水作用。羊毛角蛋白由无规卷曲、α－螺旋和β－折叠平行多肽构象一起组成的极致密的结构，由于蛋白质具有有效的螯合和功能化基团(氨基、羧基和硫醇基等)，与氧化石墨烯有很强的结合能力。利用羊毛角蛋白(wk)与氧化石墨烯和氨基酸脱氢酶的相互作用，并调控固定化酶体系的温度、ph，可控制酶与go和wk之间的疏水作用和氢键作用力，实现酶的可控固定化，增强固定化酶效果。同时，引入了金属离子进行了配位，不仅增强了稳定性，且该方法对酶分子的结构干扰较少，可较好的保持酶活性。本发明的优点在于工艺简单、制备条件温和、固定化率高。所得固定化酶的ph稳定性和重复使用稳定性明显增强，同时具有较高的酶活性回收率。
附图说明
29.图1为实施例1中不同浓度的角蛋白对固定化酶(金属离子cu
2
)的负载量及酶活的影响。
30.图2为实施例1中固定化酶(金属离子cu
2
)与游离氨基酸脱氢酶不同ph的活性比
较。
31.图3为实施例2中固定化酶(金属离子cu
2
)的电镜图。
32.图4为实施例2中固定化酶(金属离子cu
2
)的酶活回收率。
33.图5为实施例5中固定化酶(金属离子mg
2
)的图片
具体实施方式
34.下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
35.实施例1
36.(1)粗酶液的制备：
37.构建可表达带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的重组表达菌株：氨基酸脱氢酶(ntaadh)的基因序列如seq id no.1所示。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收ntaadh基因片段，用ndei和xhoi酶切酶进行双酶切，回收酶切产物，与同样双酶切的pet
‑
28a质粒(带有his
‑
tag标签)进行连接，连接好的质粒转化到大肠杆菌bl21(de3)，得到pet28a
‑
ntaadh质粒。将上述质粒转化至e.coli bl21(de3)，得到可表达带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的重组表达菌株e.coli bl21(de3)/pet28a。
38.重组大肠杆菌e.coli bl21(de3)/pet28a的培养：以1％的接种量，将菌种接入200ml lb培养基中。lb培养基的组成为10.0g/l胰蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，10g/l nacl。培养条件为：起始ph 7.0，装液量体积分数为10％，培养温度37℃，摇床转速200rpm，培养时间6小时。加入诱导剂iptg，使其终浓度为10mg/ml，继续在25℃、200rpm条件下培养12小时。
39.培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用磷酸缓冲液(ph＝7～7.4)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，用磷酸缓冲液(ph 7～7.4)配制成浓度为50～150g/l的细胞悬液。
40.将制备的细胞悬液置于冰浴中，利用超声破碎仪对细胞液进行处理，细胞破碎仪探头置于液面下1cm，破碎条件为超声3秒，间隔6秒，超声60次，功率200w。然后4℃、12,000rpm离心15min去除不溶性细胞碎片，上清即为含有带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的粗酶液。
41.(2)氨基酸脱氢酶纯酶制备：采用ge公司的his trap镍柱(histrap
tm hp，5ml)对步骤(1)得到的粗酶液进行分离纯化，并用pall公司的10k的超滤离心管进行超滤除盐。所述的纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有his
‑
tagged标签的蛋白质的histrap hp柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱的部分并利用超滤离心管进行除盐；除盐后获得的液体即为纯化的带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的纯酶溶液。
42.(3)羊毛角蛋白溶液的制备：首先，称取6克九水合硫化钠，24克脲素和1.44克十二烷基硫酸钠，混合后加入到反应瓶中，加入超纯水使溶液体积达到50ml，将反应瓶放入超声清洗机中超声使固体物质完全溶解。称取5克羊毛加入到蓝口瓶中，使羊毛完全浸没于溶液中，随后将蓝口瓶放入25℃恒温干燥箱中，保温20个小时使其完全溶解。此时的角蛋白溶液不仅含有角蛋白，还有之前加入的化学试剂，可以使用透析的方法通过去离子水将这些化学试剂除去。将初步溶解得到的羊毛角蛋白溶液两两配平放入离心机中，以9000转/分钟的转速离心，离心后过滤后得到淡黄色的角蛋白澄清溶液，接着选用截留分子量为3500da的透析袋对角蛋白进行透析，每隔2小时更换一次去离子水，透析时间为3天，这样角蛋白溶液
中的化学试剂就可以被去除，最后得到提纯后的羊毛角蛋白溶液。
43.(4)氧化石墨烯和羊毛角蛋白固定化氨基酸脱氢酶的制备：在步骤3)得到的羊毛角蛋白溶液分别稀释到终浓度为0.30mg/ml、0.25mg/ml、0.20mg/ml、0.15mg/ml、0.10mg/ml取其稀释液加入到步骤2)得到的带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶，并使带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的终浓度为0.1～10mg/ml，4℃恒温振荡器中振荡10min，羊毛角蛋白与氨基酸脱氢酶结合完成后加入10mm金属离子cu
2
进行配位30min，金属离子螯合后加入配制好的氧化石墨烯溶液(0.1mg/ml)混匀，4℃恒温振荡器中振荡4h，即得氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氨基酸脱氢酶go
‑
wk
‑
cu
2
‑
ntaadh。当羊毛角蛋白溶液浓度小于0.20mg/ml时氧化石墨烯和羊毛角蛋白固定化酶负载能力为100％，并且得到在羊毛角蛋白溶液浓度为0.15mg/ml时固定化酶酶活最高，如说明书附图1所示。
44.(5)酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含10μl，4mm nadh、160μl，0.2mol/l氯化铵
‑
氨水缓冲溶液(ph 9.5)、10μl，40mm的2
‑
氧代
‑
基丁酸乙酯溶液和20μl酶液，20℃下，340nm波长下测定l
‑
高苯丙氨酸的酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
45.氨基酸脱氢酶酶活测定体系为不同ph的缓冲溶液(缓冲液ph包括7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0)，考察不同ph体系下对游离的氨基酸脱氢酶和固定化后的氨基酸脱氢酶作用。结果如说明书附图2所示。
46.实施例2
47.(1)～(3)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(3)。
48.(4)氧化石墨烯和羊毛角蛋白固定化氨基酸脱氢酶的制备：在步骤3)得到的羊毛角蛋白溶液分别稀释到终浓度为0.15mg/ml取其稀释液加入到步骤2)得到的带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶，并使带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的终浓度为0.1～10mg/ml，4℃恒温振荡器中振荡10min，羊毛角蛋白与氨基酸脱氢酶结合完成后加入10mm金属离子cu
2
进行配位30min，金属离子螯合后加入配制好的氧化石墨烯溶液(0.1mg/ml)混匀，4℃恒温振荡器中振荡4h，即得氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氨基酸脱氢酶go
‑
wk
‑
cu
2
‑
ntaadh。电镜图如附图3所示。
49.(5)酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含10μl，4mm nadh、160μl，0.2mol/l氯化铵
‑
氨水缓冲溶液(ph 9.5)、10μl，40mm的2
‑
氧代
‑
基丁酸乙酯溶液和20μl酶液，20℃下，340nm波长下测定催化制备l
‑
高苯丙氨酸的酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。固定化酶活力值是游离酶的1.26倍，如说明书附图4所示。
50.实施例3
51.(1)～(3)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(3)。
52.(4)氧化石墨烯和羊毛角蛋白固定化氨基酸脱氢酶的制备：在步骤3)得到的羊毛角蛋白溶液分别稀释到终浓度为0.15mg/ml取其稀释液加入到步骤2)得到的带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶，并使带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的终浓度为0.1～10mg/ml，4℃恒温振荡器中振荡10min，羊毛角蛋白与氨基酸脱氢酶结合完成后加入10mm金属离子mn
2
进行配位30min，金属离子螯合后加入配制好的氧化石墨烯溶液(0.1mg/ml)混匀，4℃恒温振荡器中振荡4h，即得氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氨基酸脱氢酶
go
‑
wk
‑
mn
2
‑
ntaadh。
53.(5)酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含10μl，4mm nadh、160μl，0.2mol/l氯化铵
‑
氨水缓冲溶液(ph 9.5)、10μl，40mm的α
‑
酮戊二酸溶液和20μl酶液，20℃下，340nm波长下测定催化制备l
‑
谷氨酸的酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。
54.氨基酸脱氢酶酶活测定体系为不同温度下的缓冲溶液(缓冲液温度包括30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃)，考察不同温度体系下对游离的氨基酸脱氢酶和固定化后的氨基酸脱氢酶作用，固定化酶与游离酶都在70℃达到最大酶活，固定化酶酶活力约为游离酶的1.25倍。
55.(6)固定化酶温度温度稳定性的测定：将游离酶与固定化酶go
‑
wk
‑
mn
2
‑
ntaadh在60℃水浴恒温2h，在这个过程中每隔30min测定一次酶活。相对于游离酶，固定化酶的温度稳定性明显提高，以固定化酶的初始酶活为100％，在60℃恒温水浴2h后得到固定化酶go
‑
wk
‑
mn
2
‑
ntaadh，其相对酶活为70.26％。
56.实施例4
57.(1)～(3)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(3)。
58.(4)氧化石墨烯和羊毛角蛋白固定化氨基酸脱氢酶的制备：在步骤3)得到的羊毛角蛋白溶液分别稀释到终浓度为0.15mg/ml取其稀释液加入到步骤2)得到的带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶，并使带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的终浓度为0.1～10mg/ml，4℃恒温振荡器中振荡10min，羊毛角蛋白与氨基酸脱氢酶结合完成后加入10mm金属离子ni
2
进行配位30min，金属离子螯合后加入配制好的氧化石墨烯溶液(0.1mg/ml)混匀，4℃恒温振荡器中振荡4h，即得氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氨基酸脱氢酶go
‑
wk
‑
ni
2
‑
ntaadh。
59.(5)酶活力的检测方法：氨基酸脱氢酶的活性测定反应体系包含10μl，4mm nadh、112μl，0.2mol/l氯化铵
‑
氨水缓冲溶液(ph 9.5)、48μl有机溶剂(甲醇methanol、乙醇ethanol、乙酸acetic acid、乙腈acetonitrile、丙酮acetone、异丙醇isopropanol、环己烷cyclohexane、二甲亚砜dmso、叔戊醇2
‑
methyl
‑2‑
butanol)，10μl，40mm的苯丙酮酸溶液和20μl酶液，20℃下，340nm波长下测定催化制备l
‑
苯丙氨酸的酶活。酶活力定义为在上述条件下，每分钟氧化消耗(或生成)1μmol nadh所需要的酶量为一个酶活力单位。固定化酶在10％的有机溶剂环己烷cyclohexane下酶活最高，酶活约为游离酶的2倍。
60.实施例5
61.(1)～(3)实验步骤如实施例1的步骤(1)～(3)。
62.(4)氧化石墨烯和羊毛角蛋白固定化氨基酸脱氢酶的制备：在步骤3)得到的羊毛角蛋白溶液分别稀释到终浓度为0.15mg/ml取其稀释液加入到步骤2)得到的带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶，并使带his
‑
tag标签的氨基酸脱氢酶的终浓度为0.1～10mg/ml，4℃恒温振荡器中振荡10min，羊毛角蛋白与氨基酸脱氢酶结合完成后加入10mm金属离子mg
2
进行配位30min，金属离子螯合后加入配制好的氧化石墨烯溶液(0.1mg/ml)混匀，4℃恒温振荡器中振荡4h，即得氧化石墨烯
‑
羊毛角蛋白与金属离子配位复合材料固定化氨基酸脱氢酶go
‑
wk
‑
mg
2
‑
ntaadh。马尔文粒度仪测得游离酶ntaadh的zeta potential(mv):
‑
3.67，go
‑
wk
‑
mg
2
‑
nt的zeta potential(mv):
‑
8.04，测定时的固定化酶状态如图5所示。重复利用5次
后固定化酶酶活仍能保持73.46％的活性。
63.以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。