circ_0000173作为卵巢癌预后、治疗标志物的应用的制作方法

1.本发明涉及分子检测技术领域,尤其涉及circrna检测和治疗卵巢癌的方法。


背景技术：

2.卵巢癌为女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，近年来其发病率趋于稳定，但死亡率仍呈上升趋势，是妇科恶性肿瘤死亡的主要原因，居女性肿瘤相关死亡原因的第五位。卵巢癌发病隐匿，早期通常无明显症状，且缺乏有效的筛查和早期诊断措施，待确诊时70％的患者已处于晚期。就世界范围而言，女性一生中发生卵巢癌的风险比为1.4～1.5％，而卵巢癌的死亡风险比约为1％。针对卵巢癌组织异质性以及高通量测序的研究表明，卵巢肿瘤中大多为上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,eoc)。虽然进行肿瘤细胞减灭术的基础上辅以铂类和紫杉醇为主的化疗，以及近年来免疫疗法和腹腔热灌注化疗等新疗法的尝试，但其临床缓解的平均时间为两年，五年生存率仅在30％左右。卵巢癌高死亡率的原因主要包括早期筛检指标较少、早期诊断困难，同时伴随高转移和复发，此外，卵巢癌在手术治疗过程中难以完全清除病灶，致使术后复发率高、预后差。因此，探究新的卵巢癌发病机制、寻找潜在的诊治靶标和肿瘤标志物，是目前卵巢癌基础和临床研究领域亟待解决的重点和难点。
3.近年来，表观遗传学在卵巢癌领域的研究进展十分迅速。表观遗传能从染色质、dna、蛋白质和rna水平调节基因的表达，主要包括dna甲基化、组蛋白修饰、核小体重构和非编码rna调节等
7.，其中rna在表观遗传调控过程中起着关键作用，不仅可以作为从dna到蛋白质的信息传递中间体，且其本身也具有各种生物学功能。环状rna(circular rna,circrna )是近年来备受关注的一种具有闭合环状结构的一种新型非编码rna，其表达水平高、稳定且分布广泛。circrna根据其组成和循环机制的不同主要分为3个类别：外显子circrna、内含子circrna和外显子
‑
内含子circrna。
4.circrna由前体mrna(pre
‑
mrna)产生，并由rna聚合酶ii转录，该结构使得circrna缺乏5’多聚a尾，此特征使得成熟的circrna结构稳定、序列保守、高度丰富，并在特殊条件下动态表达在特定组织内部。因此circrna可以抵抗核酸外切酶的降解，而circrna表达丰富，在各个物种间较为保守，且其表达具有组织及发育时序的特异性。circrna因具备以下分子标志物特点：选择性高表达，常与线性rna(hostgene)的表达量相当，在增生慢的细胞及器官中表达量高；高度稳定，闭合环状的结构可抵抗rnase的降解；在不同的物种间相对保守；特异性表达，circrna的表达具有组织及发育时序的特异性；便于检测，不仅肿瘤组织中表达，还可以通过血清、尿液检测。目前的研究已证实功能性circrna可以以多种方式影响肿瘤的发生发展，如内源性竞争抑制microrna、与circrna结合蛋白相互作用、调节转录或剪接。在妇科恶性肿瘤领域，已有数篇关于circrna靶向蛋白质分子或circrna
‑
mirna—mrna网络在女性生殖系统肿瘤发生发展作用中的报道，如circrna_0049116(circmuc16)在卵巢癌中通过结合atg13蛋白，上调atg13在卵巢癌细胞中的表达，增强其自噬，从而促进卵巢癌细胞的增殖和转移
22.，而circrna_0132980(circslc26a4)可通过竞争结合mir
‑
1287
‑
5p，上调hoxa7，进而促进宫颈癌的进展。上述研究提示circrna在女性生殖系统肿瘤研究中的巨大潜力。尽管如此，人们对circrna的产生及生物学功能认识还非常有限，关于circrna对妇科常见恶性肿瘤尤其是恶性度和病死率极高的卵巢癌的发生、发展中的作用及相关机制不甚了解。
5.已知pkm2既是催化糖酵解的限速酶，又是调控肿瘤有氧糖酵解的关键酶。肿瘤细胞高表达低催化活性的pkm2赋予了肿瘤细胞特异的糖代谢的表型，为肿瘤细胞提供了大量的atp、合成核酸的中间体、氨基酸及脂类。在肿瘤细胞中，pkm2取代了其他丙酮酸激酶正常表型(pkml、pkl和pkr)，导致葡萄糖摄取提高，糖代谢物累积和代谢重编程(从糖有氧氧化为主变成糖无氧氧化为主)，为癌细胞的生长和存活提供了有利且必要的条件。肿瘤细胞的快速增殖和侵袭中会出现营养物质相对缺乏的条件，肿瘤细胞以特殊的方式获取和利用各种营养物质，除了需要糖、脂类，还包括乳酸、酮体、乙酸、支链氨基酸等非传统的代谢原料的摄取与利用。pkm2除了促进肿瘤细胞有氧糖酵解这一代谢途径外，也可通过非代谢调控途径发挥促肿瘤作用，它的作用近年倍受肿瘤领域研究的关注。
6.截止到目前，并未有现有技术提示了具体的circrna与pkm2的关系以及二者是否能够用于具体的肿瘤诊断和预后的相关研究，本发明要解决的技术问题是通过研究发现具体的circrna及其与pkm2的关系，并将其应用于具体肿瘤的诊断。


技术实现要素：

7.在本发明中,我们发现并鉴定了一个新环状rna circrna_0000173,通过ncbi
‑
sra数据库分析，1)与对照正常组织相比，在卵巢癌组织中表达上调；2)同时,circrna_0000173的高表达可预测预后不良；3)从功能上分析,circrna_0000173表达降低能够抑制了卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮
‑
间充质转化；4)重要的是,circrna_0000173可通靶向性结合pkm2蛋白，在细胞实验中,我们证实circrna_0000173通过结合pkm2蛋白在肿瘤发生和转移中发挥了促进作用。综上所述,我们的发明可以提供一个新的诊断生物标志物和一个强有力的卵巢癌治疗靶点。
8.本发明为进一步验证circ_0000173作为环状rna的确定性，通过使用northern blot并且切胶进行sanger测序，证实了其碱基序列为反向成环；而针对rna扩增产物的凝胶电泳中，我们发现mrna经circ_0000173引物扩增相应的特异条带，而在基因组dna中未发现该条带。荧光原位杂交(fish)定位分析表明，circ_0000173在卵巢癌细胞的细胞浆与细胞核中存在广泛表达)。
9.此外，本发明探究了circrna_0000173对卵巢癌细胞进展的情况。以circrna_0000173高表达的a2780细胞系构建circrna_0000173敲降模型，对circrna_0000173低表达的skov3细胞系构建circrna_0000173过表达模型。我们通过edu细胞增殖法检测卵巢癌细胞的增殖水平，结果发现，敲降circrna_0000173可抑制细胞增殖，而上调circrna_0000173则促进增殖。克隆形成实验结果表明，敲降circrna_0000173抑制细胞集落形成，而上调circrna_0000173则促进集落形成。transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力，敲降circrna_0000173的卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力下降，而上调circrna_0000173则促进细胞的迁移和侵袭。
10.本发明进一步对circrna_0000173调控卵巢癌细胞进展的生物学机制进行了探
究，对circ_0000173进行体外转录后标记链霉亲和素磁珠，将此标记的circ_0000173与a2780细胞来源的蛋白裂解液孵育，然后进行sds
‑
page凝胶的考马斯亮蓝染色和wb检测(图4a)。进一步研究发现，通过catrapid软件对circrna_0000173与pkm2间核酸与氨基酸结合能力进行评分，发现circrna_0000173的序列中，76
‑
142碱基与pkm2有高度结合的评分(图4b)。利用gsea软件对circrna_0000173与pkm2结合后的差异基因分组进行基因功能预测分析，提示circrna_0000173与pkm2结合后显著上调上皮
‑
间质转化(emt)通路。
11.本发明对circrna_0000173结合pkm2对卵巢癌的进展研究，western blot和transwell实验检测circrna_0000173结合pkm2上调β
‑
catenin后的肿瘤进展的标记分子，结果发现与emt相关的上皮标记e
‑
cadherin受circrna_0000173/pkm2/β
‑
catenin影响下调，而间质标志物vimentin、n
‑
cadherin上调，circrna_0000173/pkm2/β
‑
catenin作用后可促进卵巢癌的迁移和侵袭能力。利用tcga卵巢数据集进行生存分析，pkm2高表达组患者预后显著差于pkm2低表达组患者。
12.作为一类关键的非编码蛋白的rna，circrnas对肿瘤的发生和发展非常重要。然而，与lncrnas和micrornas相比较，参与卵巢癌发生发展的circrnas研究相对较少。在本发明中，我们发现并验证了一种新的circrna分子circrna_0000173在卵巢癌组织中上调表达，circrna_0000173的高表达可以预测卵巢癌预后不良。此外对circrna_0000173的抑制可以有效的抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化。circrna_0000173与pkm2蛋白特异性结合，通过pkm2信号进而影响肿瘤的进展。我们的发明描述了circrna_0000173在卵巢癌中的作用，并在激励上发现了它可能出现与pkm2形成的调控轴。如上所述，在肿瘤治疗中针对pkm2的及其影响的代谢重编程临床与基础研究也正进入重要的阶段。因此针对circrna_0000173的沉默能够抑制pkm2蛋白，进而抑制卵巢癌的发生发展，可能在未来的卵巢癌作为一种新的治疗方法。
13.本发明首先提供一种，环状rna circrna_0000173在制备诊断卵巢癌试剂中的应用。在一个具体的实施例中，所述的circrna_0000173的序列如seq id no:1所示。
14.本发明的另外一个方面，提供特异性检测环状rna circrna_0000173的试剂在制备诊断卵巢癌中的应用；在一个具体的实施例中，其中所述的特异性检测环状rna circrna_0000173的试剂为核酸扩增引物、原位杂交探针；优选的，所述的特异性检测试剂为pcr扩增引物，其序列为seq id no:2
‑
3所示。
15.本发明的另外一个方面是提供环状rna circrna_0000173在制备预后卵巢癌试剂中的应用，优选的，其中circrna_0000173的序列如seq id no:1所示。
16.本发明的另外一个方面是提供特异性检测环状rna circrna_0000173的试剂在制备诊断卵巢癌中的应用；在一个具体的实施例中，其中所述的特异性检测环状rna circrna_0000173的试剂为核酸扩增引物、原位杂交探针；优选的，所述的特异性检测试剂为pcr扩增引物，其序列为seq id no:2
‑
3所示。
17.本发明的另外一个方面是提供环状rna circrna_0000173的抑制剂在制备治疗卵巢癌试剂中的应用。在一个具体的实施例中，所述的抑制是干扰rna或crispr/cas9系统编辑降低circrna_0000173的表达。在另外一个具体的实施例中，其中所述的干扰rna的序列为seq id no:5
‑
6所示。
18.f:5
’‑
gaaagauccauggagagaaga
‑3’
(seq id no:5)
19.f:5
’‑
uucucuccauggaucuuucgg
‑3’
(seq id no:6)
附图说明
20.图1a～b：circrna_0000173在卵巢癌与对照样本中的差异表达分析；c:15对配对卵巢癌与正常组织的circrna_0000173表达水平；d：circrna_0000173在卵巢上皮肿瘤细胞系中的表达水平。*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。
21.图2a～b:circrna_0000173核酸片段的northern blot分析和sanger测序；c：circrna_0000173在mrna和gdna的凝胶成像分析；d：circrna_0000173在a2780细胞中表达定位与水平的荧光原位杂交分析。*:p<0.05,**:p<0.01。
22.图3a～b：以edu法检测卵巢癌细胞的增殖能力；c～d:克隆形成试验检测卵巢癌细胞的集落形成能力；e:transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移情况；f:transwell
‑
matrigel实验检测卵巢癌细胞的侵袭能力。*:p<0.05,**:p<0.01。
23.图4a：circrna_0000173体外转录rna pulldown蛋白sds
‑
page电泳；b：catrapid分析circrna_0000173与pkm2的结合能力与区域；c：gsea分析circrna_0000173结合pkm2后对卵巢癌转移emt作用的基因功能预测。
24.图5a～b：western blot检测circrna_0000173与pkm2影响emt标记蛋白表达水平；c～d:transwell检测circrna_0000173与pkm2影响迁移、侵袭能力。e:tcga卵巢癌患者pkm2高低表达组的生存分析。*:p<0.05,**:p<0.01。
25.具体实施方法
26.详细说明
27.1)circrna：circrna分子呈封闭环状结构，不受rna外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，近年的研究表明，circrna分子富含microrna(mirna)结合位点，在细胞中起到mirna海绵(mirna sponge)的作用，升高靶基因的表达水平；这一作用机制被称为竞争性内源rna(cerna)机制。此外，研究表明circrna分子可以与蛋白质结合，参与蛋白质的表达作用。一些研究还表明，circrna可以参与编码肽链参与生物学作用。circrna通过与疾病关联的mirna和(或)蛋白质相互作用，在疾病中发挥着重要的调控作用。
28.2)敲降：又叫敲减，即knock
‑
down，是指通过降解具有同源序列靶基因的mrna，达到阻止基因表达的作用。利用双链小rna高效、特异性降解细胞内同源mrna，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。
29.3)过表达：是指利用基因表达载体将含有目的基因的表达盒转入进目的细胞，利用细胞自身具有的基因表达的相关工具酶使得载体中表达盒的目的基因表达，且结果是使得获得的细胞表达的目的基因的量高于出发细胞。常见的过表达的载体包括了病毒、质粒等载体，页包括了将目的基因通过基因编辑的方式克隆进细胞的基因组；其中病毒载体包括但不限于腺病毒、腺相关病毒的各个血清型，治疗载体包括但不限于pcdna系列、plcdh
‑
cir系列、pbk系列等。
30.本发明具体实施方案中，大致方法如下：
31.实施例1.差异表达circrna及其验证
32.1、生物信息学分析
33.为了确定卵巢癌中不同表达的circrna,本发明通过对公共数据库中卵巢癌与癌
旁和输卵管上皮对照的全转录组原始数据，基于python
‑
sam的find_circ软件和r语言deseq包进行环状rna表达差异分析。
34.在ncbi中收集卵巢癌组织与对照组织的全转录组测序样本，下载原始测序sra文件，转为fastq序列文件。利用hisat2、bowtie2软件参考人类参考基因组hg19进行序列比对。比对结果基于python
‑
sam的find_circ软件分析成环rna片段，根据环状rna对应的染色体位置及alias对分析到的环状rna进行标注。r语言deseq包进行环状rna表达差异分析。通过分析，我们发现环状rna hsa_circ_0000173在卵巢癌中显著高表达(fold change＝2.541，p value＝0.0132)(图1a,b)。hsa_circ_0000173的核酸碱基序列为：
35.gtgagaaattctttgatattgatagtgggaggaaggcacctctacattcaccacccagccagcactataccattgtttttaacaccttcgtgctgatgcagctcttcaatgaaatcaactcccgaaagatccatggagagaagaacgtcttttcaggcatctaccgcaacattatcttctgctctgtagtcttgggcacattcatctgccag(seq id no:1)。
36.2、组织样本验证
37.获取卵巢癌手术切除组织新鲜样本，共15对卵巢癌与对照组织，检测circ_0000173表达水平，提取组织rna，使用primescript ii逆转录试剂盒(takara)将总rna反转录为cdna。使用sybr
‑
master混合物(cwbio，中国)在bio
‑
rad cfx96实时荧光定量pcr系统上进行定量rt
‑
pcr(qrt
‑
pcr)反应。将相对基因表达水平相对于β
‑
actin蛋白标准化，并使用2
‑
δδct
方法进行表达量计算和统计分析。circrna_0000173设计引物如下：
38.f:5
’‑
cccgaaagatccatggagaga
‑3’
(seq id no:2)；
39.r:5
’‑
ggctgggtggtgaatgtaga
‑3’
(seq id no:3)。
40.结果发现卵巢癌组织显著高于匹配正常组织(图1c)。
41.3、卵巢癌细胞培养
42.本发明检测了卵巢癌上皮细胞系中circ_0000173的表达水平，卵巢癌细胞系skov3、ovcar3和es
‑
2从购自atcc，按照atcc推荐的说明进行培养细胞。a2780细胞系购自协和医科大学基础医学细胞中心，按照说明书推荐条件进行培养。使用短串联重复序列(str)表征标记，且检测细胞系不含支原体。
43.使用primescript ii逆转录试剂盒(takara)将总rna反转录为cdna。使用sybr
‑
master mix试剂盒(cwbio，中国)在bio
‑
rad cfx96实时荧光定量pcr系统上进行定量rt
‑
pcr(qrt
‑
pcr)反应。将相对基因表达水平相对于β
‑
actin蛋白标准化，并使用2
δδct
方法进行表达量计算和统计分析。结果发现，circ_0000173在a2780中高表达，而在skov3中低表达(图1d)，故后续实验中，我们以a2780细胞为敲降细胞模型，skov3细胞作为过表达细胞模型。
44.4.northern blot
45.circrna_0000173序列设计特异性探针，由丰晖生物(fenghbio)合成的。circrna的纯化和富集是通过rnase r处理，然后进行polyadenylation和poly(a) rna去除，然后用5％甲醛溶液进行交联并以1％琼脂糖凝胶中进行电泳，然后转移至带电的硝化纤维素膜(merck)，进行紫外线交联和显影。circrna_0000173的分析参考dna maker(生工)，对circrna_0000173核酸分子进行分析(图2a)。
46.5.pcr扩增与琼脂糖凝胶电泳
47.实验证实了其碱基序列为反向成环；提取卵巢癌细胞系skov3的rna和基因组dna(gdna)，使用含有gel
‑
red核酸染料的2％琼脂糖凝胶电泳，使用tbe冲液。研究cdna和gdna pcr产物。通过在100v电泳50分钟分离dna。我们发现mrna经circ_0000173引物扩增相应的特异条带，而在基因组dna中未发现该条带。并利用sanger测序对扩增序列的碱基进行验证检测(图2b,2c)。
48.6.rna荧光原位杂交
49.用rna
‑
fish检测a2780细胞中circrna_0000173的亚细胞分布。在室温条件下,将细胞在4％的多聚甲醛中固定30min,乙醇梯度脱水(70％,80％,95％,100％)。然后样本37℃过夜孵育地高辛标记的rna
‑
fish探针,显色结合fitc孵育2h。反义rna探针作为阴性对照。结果用共聚焦显微镜检测的。rna
‑
fish探针的序列如下:ttcatctgccaggtgagaaattct(seq id no:4)(circrna_0000173)。荧光原位杂交(fish)定位分析表明，circ_0000173在卵巢癌细胞的细胞浆与细胞核中存在广泛表达(图2d)。
50.实施例2circ_0000173对卵巢癌细胞系的影响
51.1、高表达和低表达的细胞系构建
52.通过吉凯基因合成了circrna_0000173序列，并将其克隆到真核表达载体pcdna3.1和慢病毒表达载体plcdh
‑
cir中。circrna_0000173的sirna从吉凯基因购买。f:5
’‑
gaaagauccauggagagaaga
‑3’
(seq id no:5)f:5
’‑
uucucuccauggaucuuucgg
‑3’
(seq id no:6)。circrna_0000173的验证的shrna序列，合成并克隆到plcdh
‑
cir shrna的克隆和表达慢病毒载体。
53.以circrna_0000173组成型高表达的a2780细胞系构建circrna_0000173敲降模型，对circrna_0000173组成型低表达的skov3细胞系构建circrna_0000173过表达模型。
54.2、细胞增殖实验
55.我们通过edu细胞增殖法检测卵巢癌细胞的增殖水平。使用edu
‑
594体外试剂盒(碧云天)检测细胞增殖。卵巢癌细胞系完全培养基的条件中加入edu检测试剂，浓度为20μm。将细胞用4％多聚甲醛固定，试剂盒中azide594和hoechst33342显色和染色。
56.结果发现，敲降circrna_0000173可抑制卵巢癌细胞增殖，而上调circrna_0000173则促进增殖(图3a,3b)。
57.3、克隆形成实验
58.对于克隆形成测定，将1000个卵巢癌细胞接种到6孔板的每个孔中，并在含有10％fbs的培养基中保持10天。然后用4％多聚甲醛(pfa)对平板克隆进行固定，用1％的结晶紫溶液进行10min染色，洗净和干燥后放在倒置显微镜下拍照并计算多于50多个细胞的菌落。
59.克隆形成实验结果表明，敲降circrna_0000173抑制细胞集落形成，而上调circrna_0000173则促进集落形成(图3c,3d)。
60.5、transwell迁移和侵袭分析
61.transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。对于入侵检测，悬浮1
×
105个细胞于250μl的无血清培养基中于24孔transwell上室内(8um；corning)。对于迁移试验,悬浮2
×
105细胞于未经过预处理的24孔板上室中。这两种方法的下室中都加入含10％fbs的新鲜培养基。24h后,被入侵或迁移的细胞用4％的结晶紫染色，每个处理样品设置3个生物学重复且每个重复拍摄3张照片。
62.结果显示，敲降circrna_0000173的卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力下降，而上调circrna_0000173则促进细胞的迁移和侵袭(图3e,3f)。
63.实施例3circrna_0000173调控卵巢癌细胞进展的生物学机制
64.1、rna体外转录和rna
‑
pulldown实验
65.使用磁珠结合rna下拉蛋白的rna
‑
pulldown试剂盒(ribobio)。根据制造商的说明，将circrna_0000173序列生物素rna标记，根据制造商的说明书利用t7 rna聚合酶(ribobio)体外转录该序列混合和。生物素化的circrna_0000173与链霉亲和素连接的磁珠(invitrogen)孵育，然后与全细胞蛋白裂解液4℃孵育过夜。用洗脱液清洗并离心得到蛋白质沉淀，并在蛋白裂解缓冲液中稀释。获得的蛋白质在sds
‑
page凝胶上进行考马斯亮蓝染色和western印迹分析。
66.2、蛋白表达western blot检测
67.在6％
‑
12％的sds
‑
page凝胶上分离蛋白质，然后将其转移到硝酸纤维素膜上(merck)。用5％脱脂牛奶封闭后，将膜与小鼠抗pkm2 mcab(1：1000，sigma
‑
aldrich)、小鼠抗β
‑
actinmcab(1：10000，ptg)。使用ecl特超敏发光成像体系(4a biotech)对蛋白条带进行可视化检测。
68.结果表明，circrna_0000173核酸能够结合下拉的蛋白pkm2(60kda)，wb显示circrna_0000173相较于反义链，结合的蛋白中pkm2显著表达(图4a)。
69.3、circrna_0000173与pkm2结合及作用的预测分析
70.rna与蛋白结合预测工具catrapid分析circrna_0000173与pkm2的结合能力与区域。同时利用基因集功能富集分析工具gsea(gene set enrichment analysis)分析circrna_0000173结合pkm2后对卵巢癌转移emt作用的基因功能预测(图4b)。
71.结果显示circrna_0000173能够与pkm2蛋白结合，结合后的pkm2在卵巢癌细胞系中的表达能够参与肿瘤细胞的上皮
‑
间充质转化(emt)的信号通路上调(参见图4c)。
72.实施例4靶向干扰circrna_0000173和pkm2对巢癌细胞进展的抑制作用
73.1、circrna_0000173稳定表达细胞系对pkm2表达进行处理
74.pkm2的质粒以及sirna从吉凯基因购买，qpcr、wb在模式细胞系hek
‑
293中验证pkm2质粒与pkm 2
‑
sirna的有效性。利用已经构建完成的circrna_0000173稳定高表达和低表达细胞系分别进行pkm2的sirna和质粒上调表达转染处理。
75.2、蛋白表达western blot检测
76.在6％
‑
12％的sds
‑
page凝胶上分离蛋白质，然后将其转移到硝酸纤维素膜上(merck)。用5％脱脂牛奶封闭后，将膜与小鼠抗pkm2 mcab(1：1000，sigma
‑
aldrich)，e
‑
cadherin(1：1000，cst)、vimentin(1：1000，cst)、n
‑
cadherin(1：1000，cst)、小鼠抗β
‑
actinmcab(1：10000，ptg)。使用ecl特超敏发光成像体系(4a biotech)对蛋白条带进行可视化检测。
77.结果提示敲降circrna_0000173的卵巢癌细胞的上皮
‑
间质转化(emt)显著降低，而过表达pkm2后emt效应标志物得到回复。同时，上调circrna_0000173则促进细胞emt效应标志蛋白表达水平，而对pkm2进行沉默后，则会抑制emt标志蛋白表达(图5a,5b)。
78.3、transwell迁移和侵袭分析
79.transwell实验检测卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。对于入侵检测，悬浮1
×
105个
细胞于250μl的无血清培养基中于24孔transwell上室内(8um corning)。对于迁移试验,悬浮2
×
105细胞于未经过预处理的24孔板上室中。这两种方法的下室中都加入含10％fbs的新鲜培养基。24h后,被入侵或迁移的细胞用4％的结晶紫染色，每个处理样品设置3个生物学重复且每个重复拍摄3张照片。
80.结果显示：敲降circrna_0000173的卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力下降，而上调circrna_0000173则促进细胞的迁移和侵袭(图5c,5d)。
81.4、pkm2的生存分析
82.circrna_0000173的作用蛋白pkm2在卵巢癌中的临床意义通过tcga数据库的rna测序数据表达水平进行评估。将tcga卵巢癌患者的数据与pkm2表达水平联系起来，pkm2的表达量高和低由中值定义，生存资料由kaplan
‑
meier生存曲线和対秩数曲线进行统计分析。
83.结果表明在tcga的全部卵巢癌患者中，pkm2高表达的患者生存情况显著差于pkm2低表达的患者，p＝0.022(图5e)。
84.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的均在本发明的范围之内。