近红外荧光标记脂肪酸及其制备方法与流程

1.本发明属于有机合成技术领域，具体涉及近红外荧光标记脂肪酸及其制备方法。


背景技术：

2.由于我们国家年龄老龄化的趋势，平均每3秒就有一位阿尔兹海默症患者产生，日趋严重地危害着社会的稳定。目前，fda批准的用于治疗阿尔兹海默病患者药物只有5种，它们对阿尔兹海默症几乎没有治疗的效果，只有延缓的作用。由于阿尔兹海默症(ad)早期准确诊断以及病况监测手段缺失，治疗药物研究进展更进一步受到阻碍。因此，对初期ad进行及时准确诊断是目前人类预防和治疗ad的关键所在。淀粉样蛋白(β
‑
amyloid proteins，aβ)增高是ad发病的主要原因之一，因此开发高效灵敏aβ探针有利于ad的早期诊断和治疗。1959年，vassar和culli利用荧光染料硫黄素t(thioflavin t，简称tht)首次成功标记了aβ，为ad早期诊断奠定了基础。在此基础上，各种标记aβ的探针相继问世，有半导体量子点、碳量子点、有机荧光染料(如tht衍生物)等。但由于重金属潜在的毒性和“blinking”现象，半导体量子点在生物应用中有一定局限性；低量子产率以及易聚集等问题导致碳量子点在ad早期诊断应用中存在较大困扰；tht衍生物尽管与aβ具有很高的亲和力，但短波长信号易受生物体自身干扰，并且光稳定性不高，使其诊断的可靠性大大降低。近红外荧光能够有效穿透生物组织，避免生物自发光的干扰，在药物筛选以及疾病检测中呈现出巨大优势，因此，研究开发新型高量子产率、光稳定性好的近红外aβ荧光探针对ad早期诊断具有重要的科学意义和应用价值。另外，由于血脑屏障的存在，荧光探针很难进入中枢神经系统完成成像功能，所以开发能穿越血脑屏障诊断剂对ad的诊断治疗具有重要意义。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的在于提供一种近红外长波长、高灵敏度、高选择性的阿尔兹海默症早期诊断荧光探针，可以有效解决背景技术中的问题。
4.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.近红外荧光标记脂肪酸，其分子结构式为：
[0006][0007]
式中bdp的羟基与脂肪酸的羧基通过酯化反应结合在一起，所述脂肪酸为la或dha；
[0008]
其反应路线如下式所示：
[0009][0010]
r
‑
cooh:
[0011][0012]
所述r为
[0013]
近红外荧光标记脂肪酸的制备方法，包括如下步骤：
[0014]
(1)将甲基吡咯、苯甲醛、和三乙胺按照摩尔比2～2.5:1～1.3:0.01～0.3混合溶解到二氯甲烷中，室温，搅拌3h～24h，冰浴中缓慢滴加1～1.3当量的络合剂，搅拌10～30分钟，加入1～1.3当量的催化剂a，二氯甲烷萃取，无水na2so4干燥，25℃～60℃真空旋蒸除去溶剂，采用层析柱分离提纯，得到橙黄色固体产物x1；
[0015]
(2)将x1、对
‑
乙羟基苯甲醛、催化剂b按照1:1～1.3:0.01～0.3溶于甲苯和哌啶1:0.1～1(v/v)的混合溶液中，置于装有dean
‑
stark装置的圆底烧瓶中，140℃
‑
150℃加热回流，直到所有溶剂都被dean
‑
stark装置收集，再向反应介质中加入1:0.1(v/v)甲苯和哌啶，重复2～4次，tlc跟踪至原料反应完全后，柱层析分离提纯，减压除去溶剂后，得到黑色固体产物bdp；
[0016]
(3)将la或dha、dcc/dmap按照1:0.1～0.5(m:m)溶解到氯仿中，再加入bdp，25℃～90℃搅拌3～6h，25℃～60℃真空旋蒸除去溶剂，采用层析柱分离提纯，得到黑色固体产物bdp
‑
r。
[0017]
进一步地，所述步骤(1)中催化剂a为2,3
‑
二甲基
‑
5,6
‑
二氰基苯醌作催化剂，所述络合剂为三氟化硼乙醚。
[0018]
优选地，所述步骤(2)中催化剂b为对甲苯磺酰胺。
[0019]
进一步地，所述步骤(3)中bdp和la或bdp和dha的摩尔比均为1:1～1.3。
[0020]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0021]
一、本发明采用近红外荧光探针与la或dha通过酯化反应结合，其中近红外荧光特性有利于区别生物组织自身荧光信号，并对阿尔兹海默症早期生物标志物β
‑
淀粉样蛋白寡聚体有效识别结合呈现荧光，近红外荧光标记la或dha后协同作用使得该近红外荧光探针能跨越血脑屏障，到达中枢神经系统，更加有效达到阿尔兹默症早期诊断预防的目的；
[0022]
二、亚油酸和dha是对人体非常重要的物质，参与脑细胞的形成和发育，维持神经细胞的正常生理活动；la和dha是人体不能合成的必需的脂肪酸，有助于大脑细胞的修复生长，对于人体的修复起到积极作用；
[0023]
三、化合物制备过程条件温和，步骤简单，有很好的潜在应用价值。
附图说明
[0024]
图1是本发明得到的近红外荧光标记la的核磁氢谱图。
[0025]
图2是本发明得到的近红外荧光标记dha的核磁氢谱图。
[0026]
图3是本发明得到的近红外荧光标记la与β
‑
淀粉样蛋白共存160小时，β
‑
淀粉样蛋白衍变的tem形貌图。
[0027]
图4是本发明得到的近红外荧光标记dha监测β
‑
淀粉样蛋白衍变过程荧光强度图(以tht作为参照对比)。
具体实施方式
[0028]
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
[0029]
以下实施例所用的x1制备方法如下：
[0030]
将甲基吡咯(206mg，2.2mmol)、苯甲醛(106mg，1.0mmol)、和三乙胺(0.5ml)混合溶解到二氯甲烷中，室温搅拌过夜，0℃缓慢滴加三氟化硼乙醚(0.5ml)，搅拌10分钟，加入2,3
‑
二甲基
‑
5,6
‑
二氰基苯醌(227mg，1mmol)，二氯甲烷萃取，无水na2so4干燥，25℃
‑
60℃真空旋蒸除去溶剂，采用层析柱分离提纯，得到橙黄色固体产物x1。
[0031]
实施例1
[0032]
将x1(0.5mmol)、4
‑
n,n
‑
二苯基胺苯甲醛(1.0mmol)、对甲苯磺酰胺(0.01mmol)溶于甲苯(20ml)和哌啶(1ml)的混合溶液中，置于装有dean
‑
stark装置的圆底烧瓶中，140℃加热回流，直到所有溶剂都被dean
‑
stark装置收集，再向反应介质中加入甲苯(20ml)和哌啶(1ml)，继续140℃加热回流直到所有溶剂都被dean
‑
stark装置收集，重复加入甲苯(20ml)和哌啶(1ml)以及加热回流过程共3次，此过程通过tlc跟踪，原料反应完全后，柱层析，减压蒸馏除去溶剂后，得到黑色固体产物bdp，所述化合物通过核磁1h nmr谱图、质谱tof ms ei 进行表征，1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6):δ＝7.67(d,j＝8.8hz,2h),7.33
‑
7.34(m,5h),7.23(d,j＝8.8hz,2h),6.96(d,j＝4.2hz,2h),6.00(s,1h),6.02(s,1h),5.27(s,1h),4.61(s,2h),2.12(s,6h)，2.07(s,3h)；tof ms ei :442.2。
[0033]
将la(la)(0.2mmol)、dcc(0.01mmol)、dmap(0.01mmol)溶解到氯仿中，加入bdp(0.2mmol)，70℃搅拌3h，60℃真空旋蒸除去溶剂，粗产品采用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/乙酸乙酯(v/v，15/1)，溶剂减压浓缩，得到黑色固体产物bdp
‑
la，所述化合物通过核磁1h nmr谱图、质谱tof ms ei

进行表征，1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6):δ＝7.65(m,2h),
7.31
‑
7.35(m,5h),7.21(d,j＝8.0hz,2h),6.95(d,j＝8.1hz,2h),6.01(s,2h),5.48(m,2h),5.33(m,2h),5.22(s,2h),2.81(m,2h),2.33(m,2h),2.08
‑
2.12(m,13h),1.68(m,2h),1.28
‑
1.33(m,16h),0.88(m,3h)；tof ms ei

:718.5。
[0034]
实施例2
[0035]
将x1(0.3mmol)、4
‑
n,n
‑
二苯基胺苯甲醛(0.61mmol)、对甲苯磺酰胺(0.01mmol)溶于甲苯(2ml)和哌啶(0.5ml)的混合溶液中，置于装有dean
‑
stark装置的圆底烧瓶中，145℃加热回流，直到所有溶剂都被dean
‑
stark装置收集，再向反应介质中加入甲苯(2ml)和哌啶(0.5ml)，继续145℃加热回流直到所有溶剂都被dean
‑
stark装置收集，重复加入甲苯(2ml)和哌啶(0.5ml)以及加热回流过程共3次，此过程通过tlc跟踪，原料反应完全后，柱层析，减压蒸馏除去溶剂后，得到黑色固体产物bdp，所述化合物通过核磁1h nmr谱图、质谱tof ms ei

进行表征。
[0036]
将la(0.2mmol)、dcc(0.003mmol)、dmap(0.003mmol)溶解到氯仿中，加入bdp(0.2mmol)，70℃搅拌3h，60℃真空旋蒸除去溶剂，粗产品采用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/乙酸乙酯(v/v，15/1)，溶剂减压浓缩，得到黑色固体产物bdp
‑
la，所述化合物通过核磁1h nmr谱图、质谱tof ms ei

进行表征。
[0037]
实施例3
[0038]
将x1(0.54mmol)、4
‑
n,n
‑
二苯基胺苯甲醛(1.08mmol)、对甲苯磺酰胺(0.01mmol)溶于甲苯(25ml)和哌啶(1ml)的混合溶液中，置于装有dean
‑
stark装置的圆底烧瓶中，143℃加热回流，直到所有溶剂都被dean
‑
stark装置收集，再向反应介质中加入甲苯(25ml)和哌啶(1ml)，继续143℃加热回流直到所有溶剂都被dean
‑
stark装置收集，重复加入甲苯(25ml)和哌啶(1ml)以及加热回流过程共4次，此过程通过tlc跟踪，原料反应完全后，柱层析，减压蒸馏除去溶剂后，得到黑色固体产物bdp，所述化合物通过核磁1h nmr谱图、质谱tof ms ei

进行表征，1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6):δ＝7.54(d,j＝8.8hz,2h),7.18(d,j＝8.8hz,2h),6.75
‑
6.79(m,5h),6.02(s,1h),5.65
‑
5.67(m,2h),3.11(s,12h),2.12(s,9h)；tof ms ei

:498.3。
[0039]
将dha(0.5mmol)、dcc(0.01mmol)、dmap(0.01mmol)溶解到氯仿中，加入bdp(0.5mmol)，70℃搅拌3h，60℃真空旋蒸除去溶剂，粗产品采用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/乙酸乙酯(v/v，15/1)，溶剂减压浓缩，得到黑色固体产物bdp
‑
dha，所述化合物通过核磁1h nmr谱图、质谱tof ms ei

进行表征，1h nmr(300mhz,dmso
‑
d6):δ＝7.67(m,2h),7.33
‑
7.37(m,5h),7.23(d,j＝8.2hz,2h),6.95(d,j＝8.1hz,2h),6.02(s,2h),5.35
‑
5.49(m,12h),5.20(s,2h),2.78
‑
2.82(m,10h),2.35
‑
2.38(m,4h),2.12(s,6h),2.07(s,3h),2.01(m,2h),0.79(m,3h)；tof ms ei

:752.4。
[0040]
实施例4
[0041]
将x1(1.0mmol)、4
‑
n,n
‑
二苯基胺苯甲醛(2.3mmol)、对甲苯磺酰胺(0.03mmol)溶于甲苯(5ml)和哌啶(1ml)的混合溶液中，置于装有dean
‑
stark装置的圆底烧瓶中，142℃加热回流，直到所有溶剂都被dean
‑
stark装置收集，再向反应介质中加入甲苯(5ml)和哌啶(1ml)，继续142℃加热回流直到所有溶剂都被dean
‑
stark装置收集，重复加入甲苯(5ml)和哌啶(1ml)以及加热回流过程共3次，此过程通过tlc跟踪，原料反应完全后，柱层析，减压蒸馏除去溶剂后，得到黑色固体产物bdp，所述化合物通过核磁1h nmr谱图、质谱tof ms ei

进
行表征。
[0042]
将dha(1.0mmol)、dcc(0.03mmol)、dmap(0.03mmol)溶解到氯仿中，加入bdp(1.0mmol)，70℃搅拌3h，60℃真空旋蒸除去溶剂，粗产品采用硅胶柱层析提纯，淋洗剂为二氯甲烷/乙酸乙酯(v/v，15/1)，溶剂减压浓缩，得到黑色固体产物bdp
‑
dha，所述化合物通过核磁1h nmr谱图、质谱tof ms ei

进行表征。
[0043]
实施例1所制备物质的应用一
[0044]
近红外荧光标记la与β
‑
淀粉样蛋白共存160小时，β
‑
淀粉样蛋白衍变的tem形貌图(以tht作为参照对比)：
[0045]
20℃下，加入2μm纯化的aβ单体，用100mm tris
‑
hcl缓冲液(ph值7.4)孵化，每30分钟搅拌1分钟(500rpm)，160小时后，用tem观察aβ的形貌，发现无bdp
‑
la存在下aβ衍变成斑块，bdp
‑
la存在下aβ保持了自身的有序结构，说明bdp
‑
la对aβ的聚集有一定的抑制作用。
[0046]
实施例3所制备物质的应用二
[0047]
近红外荧光标记dha监测β
‑
淀粉样蛋白衍变过程荧光强度图(以tht作为参照对比)：
[0048]
aβ衍变聚集过程中24h时会有aβoligomers形成，72h时会有aβfibrils形成，tht检测aβfibrils，用tht参比对照，用bdp
‑
dha监测aβ单体反应聚集过程，反应开始时在96孔板中加入bdp
‑
dha和tht，20℃下，加入2μm纯化的aβ单体，用100mm tris
‑
hcl缓冲液(ph值7.4)孵化，每30分钟搅拌1分钟(500rpm)，然后使用荧光光谱仪测量一次bdp
‑
dha荧光，并使用玻尔兹曼方程进行拟合，发现bdp
‑
dha对aβ的聚集有一定的抑制作用。
[0049]
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。