在受试者中用于确定应激状态和/或用于评估应激反应水平的方法与流程

1.本发明涉及一种方法，用于确定受试者的应激状态、用于评估受试者的应激反应水平、用于预测干预方案在受试者中的功效、用于监测干预方案在受试者中的功效和/或用于确定用于受试者的干预方案，所述方法包括在所述受试者的样本中检测选自由26个基因组成的组的至少4个基因的表达和/或定量表达水平的步骤，本发明还涉及一种试剂盒及其用途，所述试剂盒包括用于扩增和/或检测所述基因表达的工具。


背景技术：

2.正如hans selye在其1956年的开创性著作“the stress of life”(版本：mcgraw
‑
hill book company)中所提出的，应激通常被定义为“一种由特定综合征表现出来的状态，其由生物系统内所有非特异性诱导的变化组成”。具体地，应激是一种生理状态，其中个体暴露于环境中生物或非生物因素的改变(称为应激源或挑战)后，会启动反应以维持体内平衡。这种应激反应首先会引起这些个体的行为、生物和物理变化，所属变化最终导致耐受和适应。如果适应没有完成或失败，可能会超过耐受阈值，导致生物功能改变。个体无法承受应激或应对环境挑战可能会导致许多不利后果，从不适到死亡。
3.特别是在动物生产中，已经确定了范围广泛的非生物应激源，例如社会交往或粗暴对待、常见的农场实践(如阉割、去角、剪牙、修蹄、断奶逼迫)、喂养不当、暴露于不利的气候条件、锻炼、工作和运输。饲养期间发生的应激源暴露可能会影响动物舒适感、生产力和性能的保持。动物生长参数(如体重增加、饲料摄取、饲料转化率、死亡率和发病率)传统上用于表征动物的性能，但它们并不具体反映动物的应激状态。因此，必须能够通过使用灵敏而强大的诊断工具来确定受试者(人或动物)的应激状态。
4.之前已经提出了一些选自以下的应激生物标志物：循环激素(例如皮质醇、acth、肾上腺素、催产素、加压素)、分解代谢产物(例如氧化脂质的积累(例如丙二醛、异前列腺素、氢过氧化物、氧化ldl、己酰赖氨酸)或氧化蛋白质的积累(例如硝基酪氨酸、羰基化蛋白质))、炎症生物标志物(例如过氧化氢、髓过氧化物酶)、氧化dna的生物标志物(例如8
‑
羟基
‑
2'
‑
脱氧鸟苷)、或细胞内抗氧化系统活性的量度(例如超氧化物歧化酶、过氧还蛋白、硫氧还蛋白、谷氧还蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽)。在此基础上，还开发了试剂盒，例如oxyscale诊断试剂盒(如专利ep2017623中所述)或qiagen氧化应激rt2分析仪pcr阵列(rt
2 profiler pcr array)，它们依赖于对大量基因表达的测量。
5.多种基因也被描述为参与特定的应激细胞模型，但本领域技术人员公知，体外获得的结果很少可在体内转化，并且无法从这些研究中推断出这些基因中的哪些(如果有)可用于确定受试者(人类或动物)的应激状态。
6.总的来说，所有这些生物标志物都显示出一些局限性，特别是因为它们通常是短暂的，并且特定于应激源的类型和/或所考虑的物种。事实上，这些生物标志物不容易在物种和/或应激条件之间转移，并且尚未确定令人满意的通用生物标志物。
7.在这方面，发明人完全出乎意料地发现，从二十六个基因的列表中选择的至少四个基因的表达的检测和/或定量对于规避这些问题是有用的。这些基因代表了与应激源类型和所考虑的物种无关的生物标志物。


技术实现要素：

8.因此，本发明涉及用于确定受试者中应激状态的存在或不存在，和/或用于评估(和/或用于量化)受试者中的应激反应水平的体外方法，所述方法包括在所述受试者的样品中检测至少4个基因的表达和/或定量其表达水平的步骤，所述基因选自由以下组成的组：ankrd33b、anxa1、anxa2、chac1、cidea、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、g0s2、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、sh2b2、slit3、thbs1和tnc。
9.在本发明的背景中：
10.‑
与受试者相关的术语“应激”或“应激状态”应理解为表示生理状态，其中个体暴露于环境中被称为应激源(或“应激因素”或“挑战”)的生物或非生物因素的改变后，会启动反应以维持体内平衡。这种“应激反应”首先会引起这些个体的行为、生物和物理变化，所属变化最终导致耐受和适应。如果适应没有完成或失败，可能会超过耐受阈值，导致生物功能改变。个体无法承受应激或应对环境挑战可能会导致许多不利后果，从不适到死亡。
11.‑
在受试者中“评估应激反应水平”不仅仅是确定受试者是否存在应激状态；它可以允许根据他们的应激反应水平对受试者进行分类，尤其是在适应和非适应亚组之间。“评估应激反应水平”包括在受试者中“量化应激反应水平”的可能性；
12.‑“
适应的”受试者被定义为能够对由于应激源暴露而产生的应激做出适当反应的受试者；“非适应”受试者被定义为不能对由于应激源暴露而产生的应激做出适当反应的受试者；
13.‑
术语“受试者”或“个体”是指人或动物；
14.‑“
家畜动物”一词是指在农业环境中饲养的驯养动物以生产劳动力和各种商品；
15.‑“
宠物”或“休闲动物”是指在家中作为伴侣饲养的动物(例如，如狗和猫的哺乳动物，以及观赏鱼、舍养或笼养的鸟类)；
16.‑“
干预方案”对应于对个体的任何类型的干预(例如饮食、营养补充剂、药物治疗、饲养实践或环境改变)，这对于限制应激的影响和/或降低应激反应水平和/或增加应激耐受性和/或刺激个体的适应是有用的。“候选干预方案”对应于一种干预，要对其进行测试以确定它是否是相关的干预方案；
17.‑
基因是编码蛋白质分子的dna序列。dna首先通过转录转化为rna(mrna)，然后通过翻译将所述rna转化为蛋白质分子。因此基因表达的检测和/或定量可以在mrna或蛋白质水平进行。在本发明中，为方便起见，基因以其在人类(智人(homo sapiens))中的名称来指代，但应理解，除非另有说明，这包括其他物种中这些基因的所有同源物，并包括所有可能的个体间多态性；
18.‑
基因的表达可以仅被检测(相应的mrna或蛋白质的存在/不存在)，而不必进行任何定量测量，或者它也可以被量化(即以定量方式在mrna或蛋白质水平确定基因表达)。基因表达水平的量化可以允许确定受试者中应激状态的存在或不存在和/或评估受试者中的
应激反应水平(并且可能地，量化应激反应水平)。
19.优选地，本发明涉及用于鉴定受试者中应激状态的存在或不存在，和/或用于评估(和/或用于量化)受试者中的应激反应水平的体外方法，所述方法包括在所述受试者的样品中检测至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个基因的表达和/或定量其表达水平的步骤，所述基因选自由以下组成的组：ankrd33b、anxa1、anxa2、chac1、cidea、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、g0s2、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、sh2b2、slit3、thbs1和tnc。
20.优选地，所述至少4种基因(至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个基因)是不同的基因，其分别选自以下列表1
‑
4中的每一个：
21.‑
列表1：anxa1、anxa2、chac1、postn、col12a1、gfpt2、mgp、thbs1、tnc、col1a1
22.‑
列表2：anxa1、anxa2、chac1、postn、mrc1、serpinh1
23.‑
列表3：anxa1、anxa2、chac1、postn、lgals1、cidea、hmox1、kctd12、sh2b2、slit3
24.‑
列表4：anxa1、anxa2、chac1、postn、col14a1、efemp1、g0s2、kera、nes、panx1、runx1、ankrd33b。
25.列表1由在四个模型pn、ct、sn和pt之间保守的四个基因(即anxa1、anxa2、chac1、postn，“四个最保守的基因”)以及在三个模型pt、pn和ct之间保守的基因(col12a1、gfpt2、mgp、thbs1、tnc、col1a1或“列表1a”)组成。列表2由四个最保守的基因，以及在三个模型pt、sn和ct之间保守的基因(mrc1、serpinh1或“列表2a”)组成。列表3由四个最保守的基因，以及在三个模型pt、pn和sn之间保守的基因(lgals1、cidea、hmox1、kctd12、sh2b2、slit3或“列表3a”)组成。列表4由四个最保守的基因，以及在三个模型ct、pn和sn之间保守的基因(col14a1、efemp1、g0s2、kera、nes、panx1、runx1、ankrd33b或“列表4a”)组成。
26.当所述至少4个基因分别选自上述列表1
‑
4中的每一个时，所述至少4个基因包括分别在pn、ct、sn和pt模型中的每一个中确定的至少三个基因。
27.更优选地，本发明涉及用于确定受试者中应激状态的存在或不存在，和/或用于评估(和/或用于量化)受试者中的应激反应水平的体外方法，所述方法包括在所述受试者的样品中检测至少4个最保守基因anxa1、anxa2、chac1和postn的表达和/或定量其表达水平的步骤。甚至更优选地，本发明涉及用于确定受试者中应激状态的存在或不存在，和/或用于评估(和/或用于量化)受试者中的应激反应水平的体外方法，所述方法包括在所述受试者的样品中检测以下基因的表达和/或定量其表达水平的步骤：至少4个最保守基因anxa1、anxa2、chac1和postn，以及：
28.‑
至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个列表1a的基因(col12a1、gfpt2、mgp、thbs1、tnc、col1a1)；
29.‑
至少1个、至少2个列表2a的基因(mrc1、serpinh1)；
30.‑
至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个列表3a的基因(lgals1、cidea、hmox1、kctd12、sh2b2、slit3)；或
31.‑
至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个列表4a的基因(col14a1、efemp1、g0s2、kera、nes、panx1、runx1、ankrd33b)。
32.在优选实施方案中，本发明涉及用于确定受试者中应激状态的存在或不存在，和/或用于评估(和/或用于量化)受试者中的应激反应水平的体外方法，所述方法包括在所述受试者的样品中检测至少列表1的全部基因、至少列表2的全部基因、至少列表3的全部基因、或至少列表4的全部基因的表达和/或定量其表达水平的步骤。在另一优选实施方案中，本发明涉及用于确定受试者中应激状态的存在或不存在，和/或用于评估(和/或用于量化)受试者中的应激反应水平的体外方法，所述方法包括在所述受试者的样品中检测至少以下26个基因的表达和/或定量其表达水平的步骤：ankrd33b、anxa1、anxa2、chac1、cidea、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、g0s2、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、sh2b2、slit3、thbs1和tnc。
33.还优选地，上述体外方法中的至少4个、至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个基因包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个选自由以下组成的组的基因：anxa1、anxa2、chac1、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、slit3、thbs1和tnc。更优选地，它们包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个选自由以下组成的组的基因：anxa1、anxa2、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、hmox1、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、slit3、thbs1和tnc。甚至更优选地，它们包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个选自由以下组成的组的基因：anxa1、anxa2、col1a1、col14a1、efemp1、lgals1、mgp、mrc1、postn、runx1、serpinh1、slit3、thbs1和tnc。甚至更优选地，它们包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个选自由以下组成的组的基因：anxa1、anxa2、col1a1、col14a1、efemp1、lgals1、mgp、postn、slit3和thbs1。甚至更优选地，它们包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个选自由以下组成的组的基因：anxa2、efemp1、lgals1和postn。
34.如上所述的过程可用于在任何类型的受试者(人或动物)中确定应激状态的存在或不存在和/或用于评估(和/或用于量化)应激反应水平。优选地，所述受试者是动物，特别是家畜动物或休闲动物。更优选地，所述受试者是选自由以下组成的组的动物：牛(例如奶牛)、绵羊(ovines)(例如绵羊(sheep))、山羊(caprines)(例如山羊(goat))、家禽(例如鸡、肉鸡、母鸡、火鸡、鸭、鹅)，猪(swine)(例如猪(pig))、马(例如小马、马、马驹)、兔类(例如家兔、野兔)、鱼(例如鲑鱼、鳟鱼)以及其他水产养殖物种(例如虾)。
35.如上所述的过程可用于确定应激状态的存在或不存在和/或用于评估(和/或用于量化)应激反应水平，其中所述应激状态源于受试者受到的任何类型的应激源或挑战。优选
地，所述应激状态包括氧化应激部分。更优选地，所述应激状态源于受试者受到：
36.‑
可诱导炎症反应或疾病的营养挑战(例如，蛋白质或能量水平不均衡的饮食、被霉菌毒素或其他污染物等异型生物质污染的饮食、富含抗营养因子的饮食、富含氧化脂肪的饮食、富含纤维的饮食等)、
37.‑
可诱导炎症反应或疾病的环境条件挑战(例如，热挑战、高相对湿度、高二氧化碳水平、湿垃圾)、
38.‑
可诱导炎症反应或疾病的物理挑战(例如，捕捉动物的物理操作挑战和/或动物运输引起的应激)、和/或
39.‑
可诱导炎症反应或疾病的卫生挑战(例如，由于存在细菌病原体、病毒或寄生虫)。
40.所述样品可以是任何类型的生物样品。特别地，所述样品可以选自由以下组成的组：肌肉组织(优选来自骨骼肌组织)、胸部组织、肝组织、脂肪组织、皮肤、淋巴组织、胎盘组织、胃肠道组织(例如回肠组织)、生殖道组织、中枢神经系统组织、脊髓、三叉神经的神经节、尿、粪便、羽毛、眼泪、精子、精液、脑脊液、咳痰、支气管肺泡灌洗液、胃液、唾液、血清、血浆和血液。所述样品可以是新鲜的或存放的(例如冷冻样品、福尔马林固定样品或固定石蜡包埋样品)。特别地，所述生物样品可以是生物流体，其优选地选自血液、血浆、血清、唾液和尿液。它也可以是从血样中提取的任何类型的细胞，例如外周血单个核细胞(pmc)，b细胞亚群，纯化的单核细胞或嗜中性粒细胞。
41.基因表达的检测和/或定量可以通过本领域技术人员公知的方法在mrna水平或蛋白质水平进行。优选地，使用多重技术，其允许同时检测和/或定量多个基因的表达。
42.在mrna水平检测和/或定量基因表达的方法可以直接对mrna进行，也可以间接进行(例如在将mrna转化为cdna的步骤和/或扩增步骤之后)。所有这些方法都涉及作为第一步的通过本领域技术人员公知的方法从样品中分离rna(更特别是mrna)(参见，例如ausubel等人(1997),current protocols of molecular biology,john wiley and sons、rupp和locker(1987),lab invest.56:a67、或de andr
é
s等人(1995),biotechniques 18:42044)。特别是，可以根据制造商的说明，使用来自商业制造商(如qiagen)的纯化试剂盒、缓冲液组和蛋白酶进行rna分离。在mrna水平检测和/或定量基因表达的方法已经描述于，例如：kricka等人,clinical chemistry,1999,n
°
45(4),453
‑
458页和relier g.h.等人,dna probes,第二版,stockton press,1993,第5和6节,173
‑
249页，并包括：
43.‑
扩增方法，其允许通过酶的作用产生靶核苷酸片段的多个拷贝。此类扩增方法是本领域技术人员熟知的并且包括pcr(聚合酶链式反应)，fluidigm biomark
tm
系统、lcr(连接酶链式反应；参见例如美国专利号5,494,810)、rcr(修复链式反应)、专利申请wo
‑
a
‑
90/06995的3sr(自主序列复制)、nasba(基于核酸序列的扩增)、专利us
‑
a
‑
5,399,491的tma(转录介导扩增)以及专利us6410278的lamp(环介导等温扩增)。特别地，当使用的扩增方法是pcr时，将更特别地使用rt
‑
pcr(逆转录pcr，其包括将mrna逆转录成cdna的步骤)，更优选地，rt
‑
qpcr(定量rt
‑
pcr)；
44.‑
杂交方法，尤其是微阵列方法、nanostring系统、northern印迹或原位杂交方法，例如fish(parker&barnes(1999),methods in molecular biology 106:247—283)，以及
45.‑
测序方法(尤其是高通量测序方法)。
46.在蛋白质水平检测和/或定量基因表达的方法的实例可以选自elisa、western印迹、免疫组织化学、流式细胞术和蛋白质组学。术语“蛋白质组”被定义为在某个时间点样品中存在的蛋白质的总和。蛋白质组学尤其包括研究样本中蛋白质表达的整体变化(也称为“表达蛋白质组学”)。蛋白质组学通常包括以下步骤：(1)通过二维凝胶电泳(2d page)分离样品中的单个蛋白质；(2)鉴定从凝胶中回收的单个蛋白质，例如通过质谱或n
‑
末端测序，以及(3)利用生物信息学分析数据。
47.检测和/或定量细胞外蛋白的表达是特别有利的，细胞外蛋白是分泌的并且可以非侵入性地检测，例如在血液、血浆、血清、尿液或羽毛中。选择在细胞外基质中发现的蛋白质尤其有用，例如由以下基因编码的蛋白质：anxa1、anxa2、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、kera、lgals1、mgp、nes、postn、slit3、thbs1和tnc；更优选由以下基因编码的蛋白质anxa1、anxa2、efemp1、kera、lgals1、mgp、nes、postn、slit3、thbs1和tnc。根据文献，选择已经在血液或尿液中检测到的蛋白质甚至尤其有用，例如由以下基因编码的蛋白质：anxa2、efemp1、lgals1、mgp、postn、slit3和thbs1。
48.优选地，本发明涉及如上所述的体外方法，所述方法包括将所述受试者的所述样品(测试样品)中的上述至少4个、至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个基因的每一个的基因表达水平与参考值或参考样品的基因表达水平相比较的步骤。更优选地，所述参考值对应于对照值或所述参考样品对应于来自对照受试者(即未经受应激源的受试者)的样品，并且测试样品与参考值或参考样品中的基因表达水平之间具有统计学显著差异的基因表达水平指示受试者的应激状态。
49.大量的算法可用于数据分析，这是本领域技术人员所熟知的。此类算法的一个示例是实施例4中描述的基于得分的分类系统。算法的其他非限制性示例包括结构和句法统计分类算法，以及利用模式识别特征构建风险指数的方法，包括已建立的技术，例如主成分分析(pca)、因子旋转、逻辑回归(logreg)、线性判别分析(lda)、本征基因线性判别分析(elda)、支持向量机(svm)、随机森林(rf)、递归分区树(rpart)，以及其他相关的决策树分类技术，质心收缩(sc)、k最邻近、boosting、决策树、神经网络、贝叶斯网络和隐马尔可夫模型、线性回归或分类算法、非线性回归或分类算法、变量分析(anova)、层级分析或聚类算法；使用决策树的层级算法；基于内核的机器算法，例如核偏最小二乘算法、核匹配追踪算法、核fisher判别分析算法或核主成分分析算法等。
50.已经确定了应激状态和/或高水平应激反应的个体可以有利地接受干预方案。因此，如上所述的过程还可以包括向所述个体提供干预方案的步骤，其优选为营养方案，更优选由以下组成的组，抗氧化剂，特别是维生素(例如维生素e)、氨基酸(例如甲硫氨酸、硒代甲硫氨酸)、微量元素和益生菌。
51.本发明还涉及用于预测干预方案在受试者中的功效、用于监测干预方案在受试者中的功效和/或用于确定用于受试者的干预方案的体外方法，所述方法包括在所述受试者的样品中检测至少4个、至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至
少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个基因的表达和/或定量其表达水平的步骤，所述基因选自由以下组成的组：ankrd33b、anxa1、anxa2、chac1、cidea、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、g0s2、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、sh2b2、slit3、thbs1和tnc。
52.特别地，本发明还涉及用于预测干预方案在受试者中的功效的体外方法，所述方法包括在所述受试者的样品中检测至少4个基因的表达和/或定量其表达水平的步骤，所述基因选自由以下组成的组：ankrd33b、anxa1、anxa2、chac1、cidea、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、g0s2、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、sh2b2、slit3、thbs1和tnc。优选实施方案与先前描述的那些相同。
53.本发明还涉及用于监测干预方案在受试者中的功效的体外方法，所述方法包括，在所述受试者接受干预方案后，在所述受试者的样品中检测至少4个基因的表达和/或定量其表达水平的步骤，所述基因选自由以下组成的组：ankrd33b、anxa1、anxa2、chac1、cidea、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、g0s2、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、sh2b2、slit3、thbs1和tnc。优选实施方案与先前描述的那些相同。
54.本发明也可用于筛选候选干预方案，以找到新的或最佳的干预方案。因此，本发明还涉及用于确定干预方案的体外方法，所述方法包括向受试者提供候选干预方案的步骤，以及在所述受试者接受该候选干预方案之前和之后的所述受试者的样品之间比较至少4个基因的表达和/或表达水平的步骤，所述基因选自由以下组成的组：ankrd33b、anxa1、anxa2、chac1、cidea、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、g0s2、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、sh2b2、slit3、thbs1和tnc。优选实施方案与先前描述的那些相同。
55.本发明还涉及试剂盒，所述试剂盒包含用于扩增和/或检测至少4个、至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个基因的表达的工具，所述基因选自由以下组成的组：ankrd33b、anxa1、anxa2、chac1、cidea、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、g0s2、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、sh2b2、slit3、thbs1和tnc。优选实施方案(特别是优选的基因列表)与先前描述的那些相同。
56.优选地，所述试剂盒包括用于扩增和/或检测总共最多200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4个基因(包括靶基因以及可能的话还包括管家基因)的表达的工具。实际上，所述试剂盒可以包括用于扩增和/或检测以下基因表达的工具，不仅是选自上述26个基因的列表的基因，而且还有其他目的基因(统称为“靶基因”)和/或管家基因。
57.用于扩增的工具是本领域技术人员熟知的，包括例如用于进行pcr反应的引物。引物是一种核苷酸片段(通常在5到100个核苷酸之间，优选在15到30个核苷酸之间)，它可以与靶核苷酸序列的一部分进行特异性杂交，并可以在特定条件下(例如在核苷酸和dna聚合酶等存在下，并在合适的温度和ph值下)作为合成的起始点。在本发明中，靶核苷酸序列将是包含在根据本发明的基因的mrna或cdna内的核苷酸片段。通常，使用引物对(由两个引物
组成)。
58.用于pcr的试剂盒还可包含用于进行pcr反应，特别是rt
‑
pcr反应的其他试剂，例如逆转录酶、聚合酶(例如taq聚合酶)、核苷酸、缓冲液和探针(见下文)。
59.检测基因表达的工具也是本领域技术人员众所周知的，包括：
60.‑
用于在mrna水平检测基因表达的工具，例如探针。探针是长度可变的dna或rna片段(通常长度在5到500个核苷酸之间)，其可以在特定条件下与靶核苷酸序列的一部分进行特异性杂交，并标记有可检测标签(如荧光、放射性、酶标签或任何其他检测系统)，从而可以检测靶核苷酸序列。在本发明中，靶核苷酸序列将是包含在根据本发明的基因的mrna或cdna内的核苷酸片段；
61.‑
在蛋白质水平检测基因表达的工具，例如抗体和其他类型的结合分子或结合物(例如，抗体片段(如fab、scfv)或亲和体、纳米抗体、darpins、anticalins
‑
参见，例如vazquez
‑
lombardi等人(2015),drug discovery today,20(10),p.1271
‑
1283)。
62.本发明还涉及用于扩增和/或检测至少4个、至少5个，至少6个，至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个基因的表达的工具的用途，所述基因选自由以下组成的组：ankrd33b、anxa1、anxa2、chac1、cidea、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、g0s2、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、sh2b2、slit3、thbs1和tnc，或涉及如上所述的试剂盒的用途，用于确定应激状态的存在或不存在，和/或用于评估(和/或用于定量)应激反应水平，和/或用于预测干预方案的功效，和/或用于监测干预方案在受试者中的功效，和/或用于确定或比较干预方案。优选实施方案(特别是优选的基因列表)与先前描述的那些相同。
附图说明
63.图1:用于每种应激模型分析的不同样本的多维标度(mds)图：(a)鸡/营养应激(pn模型)；(b)猪/热和炎症应激(ct模型)；(c)小鼠/体育锻炼应激(sn模型)和(d)鸡/热应激(pt模型)。点对应于对照(ctrl)、适应(adapt)和非适应(una)动物组。
64.图2:四种应激模型中所有差异表达(de)基因的venn图。该表示表明在每种模型的至少一个比较中，四个基因是差异表达的。通过考虑在四种模型中的至少3种中保守的基因，该列表扩展到26个基因。mpn
‑
h(来自使用人类基因命名法的pn模型的mrna基因)、mpt
‑
h(来自使用人类基因命名法的pt模型的mrna基因)、mct
‑
h(来自使用人类基因命名法的ct模型的mrna基因)、msn
‑
h(来自使用人类基因命名法的sn模型的mrna基因)。此图是使用venny 2.1.0网站工具生成的(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)。
65.图3:在四个模型的每个比较中，26个保守基因中的每一个的差异表达谱。每条垂直线代表以下两种条件下基因表达的变化，表示为倍数变化的log2：适应与对照(avsc)、非适应与对照(navsc)和非适应与适应(navsa)。黑色实线表示对应于无差异表达的零log2倍数变化水平。据观察，大多数基因在比较和模型中显示出收敛的表达谱。
66.图4:由26个保守基因编码的26个蛋白质的string网络表示。边缘灰色强度代表每次交互的置信度(confidence)，较深的线条对应较高的置信度分数。该网络获得的统计显
著性p值为3.21*e
‑
10。
67.图5:应激得分(纵轴)、适应得分(右轴)和非适应得分(左轴)的雷达图表示，其通过在应激动物组中计算一组差异表达的基因(左：26个基因；右：四个最保守的基因)获得(上图：非适应(na)条件下的pn模型动物；下图：暴露于百草枯引起的应激的鸡)。
实施例
68.本发明通过以下实施例进行了非详尽的说明。这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不是为了限制本发明的范围。
69.实施例1：确定可用于确定受试者应激状态的26个保守基因
70.材料和方法
71.应激模型设计
72.根据之前的研究选择和设计了四种动物应激模型，其中三种不同的物种经受四种不同的应激源：(i)经受热挑战的鸡(loyau等人(2016)bmc genomics,17:329)；(ii)经受高温和炎症挑战的猪(campos等人(2014),the veterinary journal,200,404
‑
409)；(iii)经受营养挑战的鸡；(iv)经受体育锻炼挑战的小鼠(rederstorff等人(2011),plos one,6(8):e23094)。
73.简而言之，在鸡/热应激模型(pt模型)中，或将鸡蛋在整个孵化期间保持在37.8℃和56％的相对湿度，或从胚胎日龄e7到e16(包括e7和e16)在39.5℃和65％的相对湿度下孵化12h/24。孵化后，雄性小鸡被转移到一个单独的禽舍，从第0天到第32天饲养。温度从第0天的33℃降低到第25天的21℃，此后保持在21℃。在第34天，对照或热操控的鸡组暴露于32℃下5小时。将在胚胎发生期间没有热应激并在标准条件下饲养的动物用作对照。在热挑战期间和第35天返回21℃后测量体温。对于基因表达分析，与呈现较高体温的非适应组和对照组相比，选择通过胚胎热适应更好地耐受热的低体温动物(适应组)。它们被宰杀并将胸肌回收、速冻并保持在
‑
80℃直至进一步分析。
74.关于猪/热和炎症模型(ct模型)，将77日龄的猪在14天的适应期内一直保持在24℃，然后分为两组，其中或将动物保持在热中性条件(24℃)或暴露在高温下17天。对于高温组，将房间保持在24℃5天，然后逐渐升高到30℃。从热挑战期的第8天开始，在热应激期的第8、10、12、14、16天对猪施用5次来自大肠杆菌的lps注射。在实验期开始和结束时对猪单独称重并记录直肠温度。在最后一次注射lps后24小时对所有动物实施安乐死。对于基因表达分析，与对照组相比体重偏差最大的应激动物被分配到未适应组，而暴露于实验处理但体重与对照组相似的动物被分配到适应组。基于评估荷尔蒙反应和氧化应激状态的血浆分析，进一步验证了这两个暴露于应激源的组的资格。
75.鸡/营养应激模型(pn模型)包括用提供低(17％)或通常(22％)粗蛋白水平的两种不同饮食喂养的鸡。在出生后的头两周内，鸡接受标准的基于玉米
‑
大豆的起始饮食(22％cp/3000kcal/kg)以确保正常发育。在第15天，用低或通常蛋白质等能量饮食处理鸡直至6周龄。对于每种情况和每种处理的24只鸡，收集血液和组织样本。测量血浆皮质甾醇、碘酪氨酸t3
‑
t4、tba
‑
rs和谷胱甘肽状态，以评估生长期间饮食处理之间的激素和氧化状态差异。此外，在治疗前后记录动物体重。根据体重增加和氧化参数，应激动物的反应变化很大，其中一些更接近对照参考值，其他则显著不同。考虑到这种可变性，我们定义了两个应激动
物亚组：适应动物(饲料转化率与对照动物相似)和非适应动物(饲料转化率与对照动物显著不同)。在第6周收集胸肌样品并储存在
‑
80℃直至进一步分析。
76.对于小鼠/体育锻炼应激模型(sn模型)，将8至12个月龄的转基因selenon
‑
/
‑
(ko/ko)小鼠或杂合子(ko/wt)小鼠进行强迫游泳测试。在这项研究中，使15只ko/ko和9只ko/wt小鼠在两个月内每天游泳6分钟。根据他们的游泳能力和体重参数，在ko/ko队列中定义了两个亚组。表现出体重减轻和完成游泳锻炼困难的动物被归类为非适应动物，而仅表现出细微或没有表型改变的动物被归类为适应动物。收集血液样本并使用系统(luoxis，englewood，美国)测量血浆的总氧化还原电位容量(oxidation
‑
reduction potential capacity)。适应和非适应亚组的应激动物获得的值与ko/wt相比均与体重减轻参数一致。在两个月的实验期结束时，将动物安乐死，收集椎旁肌肉组织并储存在
‑
80℃直至进一步分析。
77.总rna提取纯化
78.根据每个应激模型中测量的生物学指标，我们确定了代表适应和非适应亚组的四只动物；同样选择了对照组的四只动物。使用fastprep
‑
24 5gtm和1.4mm陶瓷珠(6913
‑
100,)，将肌肉样品在1.5mltri reagent缓冲液/100mg组织中以6m/s的速度匀浆两次，每次40秒。在4℃下以12000g离心10分钟后，收集1ml上清液。加入200μl氯仿，涡旋后，将混合物在4℃下以12000g离心10分钟。收集500μl上层水相，并通过在室温下加入一体积的100％异丙醇，持续10分钟，来沉淀rna。在4℃下以10000g离心10分钟后，去除上清液并将沉淀在室温下干燥10分钟。将rna沉淀重新溶解在50μl无rnase
‑
dnase的水中，并在冰上孵育10分钟。使用nanodrop 1000分光光度计(thermo scientific)测定rna浓度。
79.然后使用rna clean&concentratortm
‑
5试剂盒(zymo research)纯化总rna，包括mrna和长非编码rna。根据制造商的说明纯化10μg总rna。使用nanodrop测量rna样品的浓度和纯度，并使用bio
‑
analyzer 2100(agilent technologies)评估其完整性(rin)。rin值为8.0
‑
9.6。
80.rna测序
81.将纯化的rna逆转录成cdna，并在genomeast plateforme,igbmc使用hiseq技术(hiseq 4000)进行测序。检索包含读取的fastq序列文件。
82.rna
‑
seq数据处理
83.根据基因组注释，使用具有默认参数的hisat2工具版本2.0.4来对基因组进行读数比对。本步骤使用的gtf注释和fasta基因组文件如下：(i)对于鸡，galgal5基因组及其相关的ncbi注释；(ii)对于猪，sscrofa11.1基因组及其相关的ncbi注释和(iii)对于小鼠，grcm38.p5(mm10.p5)基因组及其相关的ensembl版本m14注释。
84.使用htseq工具版本0.6.1，使用默认参数，通过读数计数来测量基因表达水平。最后，使用sartools r包的edger工具定义以下三种测试条件之间的差异表达基因：适应与对照、非适应与对照和非适应与适应，分别称为avsc、navsc和navsa。为了管理样品可变性，我们使用了修改的edger robust模式的版本，其根据zhou和robinson(参考书目)开发的方法执行不同的离散度计算。对于所有模型都使用相同的参数，应用默认的benjamini
‑
hochberg p值调整方法。来自每个模型的差异表达(de)基因使用调整后的p值(padj)为0.05的经典阈值来定义。
85.模型比较
86.一旦为每个模型建立了de基因列表，我们就使用可从ensembl网站在线访问的biomart工具搜索这些基因每一个的人类直系同源物名称(https://www.ensembl.org/)。这一步让我们处理种间命名异质性。然后我们合并了每个模型中每个比较的所有de基因，并比较了四个列表来表征涉及应激反应的保守基因。我们通过选择四个模型中至少三个模型之间的所有共同基因来定义保守基因列表。此选择被做得更加宽松，比较四个严格不同的模型，并避免在biomart步骤期间主要由于由大量和高度相似的旁系同源基因组成的基因家族造成的错误分配偏差。
87.结果
88.先前的分析为每个模型定义了一组生理指标(体重减轻、血液激素标志物、氧化水平的测量)，所述指标是应激动物与对照组相比的特征。在我们的实验中，对这些标志物的分析表明，应激动物的反应是高度可变的(非单峰分布)，其中一些更接近对照参考值，而另一些则显著不同。考虑到应激动物之间的这种离散性，我们定义了两个亚组：适应和非适应动物，其参数分别是与对照动物趋同的或显著不同的。对于每组(适应的、非适应的和对照)，选择一组四只动物。转录组学分析是在肌肉中进行的，肌肉是一种对应激源暴露高度敏感的动态组织。从肌肉样品中提取总rna，并使用rnaseq技术对rna转录本进行测序。使用fastqc验证数据采集的质量。使用sartool评估每个样本的基因表达的数据离散和归一化程序。对于每个模型，mds图示验证了分析的动物在三个确定的组(对照、适应和非适应)中的相对聚类分布(图1)，尽管它们的个体间差异很大。然而，对于鸡/热应激模型，四个对照样本之一(a_ctrl)与该组的其他动物相比显示出非典型的变异性(图1d)，因此被视为异常值(out
‑
layer)并从基因表达比较分析的对照组中移除。
89.对于猪/热和炎症应激模型，我们注意到动物异常地聚类在两组中，独立于应激环境，这可能主要归因于性别差异(图1b：除j
‑
adapt外，聚类在左侧的动物对应于雌性，聚类在右侧的动物对应于雄性)。因此，在比较基因表达分析中引入了阻断因子“性别”，以考虑到雄性和雌性猪之间的应激反应差异。三个分类的应激动物和对照动物之间的比较分析确定了每个应激模型中的差异表达(de)基因列表。表1报告了应激动物和对照动物之间的de基因数量。值得注意的是，在大多数情况下，非适应与对照的比较显示最高数量的de基因，但在一种模型中(鸡/热应激模型)不是。这一观察结果表明，基于其基因组程序的表达，非适应的动物与对照动物的差异比适应的动物与对照动物的差异更大。这不是鸡/热应激模型的情况，但在这种情况下，动物在胚胎发生过程中接受预处理，其诱导预适应，从而诱导刺激适应的基因组程序的设置。
[0090][0091]
表1.每个模型每次比较的de基因数，padj阈值为0.05。avsc：适应的与对照；navsc：非适应的与对照；navsa：非适应的与适应的。
[0092]
差异表达分析让我们根据所选的padj阈值0.05定义de基因列表。表1总结了在每个模型的每个比较中使用此过滤发现的de基因的数量。为了比较这些列表，我们首先为每个模型创建了一个de基因列表，无论它们在哪个比较中差异表达，假设它总是由于应激反应。然后我们使用维恩图示并发现我们的四个模型之间保守的四个基因(图2)。为了尽量减少这种方法中的偏差，我们选择将列表扩展到在至少三个我们的模型之间保守的基因，然后我们发现了26个在应激反应过程中差异表达的保守基因：ankrd33b、anxa1、anxa2、chac1、cidea、col1a1、col12a1、col14a1、efemp1、g0s2、gfpt2、hmox1、kctd12、kera、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、sh2b2、slit3、thbs1和tnc(表2)。
[0093]
四个模型之间保守的四个基因是：anxa1、anxa2、chac1和postn。pt、pn和ct模型之间保守的6个基因是：col1a1、col12a1、gfpt2、mgp、thbs1和tnc。pt、sn和ct模型之间保守的2个基因是mrc1和serpinh1。pt、pn和sn模型之间保守的6个基因是：cidea、hmox1、kctd12、lgals1、sh2b2和slit3。ct、pn和sn模型之间保守的8个基因是：ankrd33b、col14a1、efemp1、g0s2、kera、nes、panx1 and runx1。
[0094]
[0095]
[0096][0097]
表2.不同模型间保守的差异表达基因列表。ecm＝细胞外基质；er＝内质网；cyto＝细胞质；memb＝膜
[0098]
实施例2：26个保守基因的功能性表征
[0099]
在获得26个保守基因的列表后，我们想知道它们是否在同一个生物过程中发挥作用，它们是否共同定位以及它们是否可以一起相互作用。
[0100]
材料和方法
[0101]
为了研究我们感兴趣的基因的联系程度，我们使用了string 10.5网站(https://string
‑
db.org/)。边缘在这里对应于预测的功能关联。为了编辑string图示的图形属性，我们还使用了cytoscape软件，版本3.6.1。这个工具允许我们根据节点的log2倍数变化用灰色渐变将节点着色，在差异表达水平方面提供更多信息。为了获得有关这些基因功能的更多信息，我们再次使用string网站进行了富集分析，该网站除了网络图示外，还为用户提供了go术语(go
‑
term)统计富集分析。
[0102]
结果
[0103]
为了更好地表征26个保守基因的生物学功能，我们首先使用平行坐标可视化来用它们的log2倍数变化值来比较它们在每个模型中的表达谱(图3)。这种表示表明，即使这些基因的差异表达水平在四个模型之间不同，但它们中的大多数在应激模型中共享相同的表达谱，几乎总是一起上调或下调。与该整体性状相比，差异最大的基因是chac1。这一观察结果表明，这些基因的主要部分可能通过独特的信号通路或转录因子共表达。我们还可以提出这些共表达的基因应该是同一生物过程的一部分，共同发挥功能作用。
[0104]
然后我们表征了由这些基因编码的蛋白质的细胞定位。结合文献和uniprot数据，我们可以表征26种蛋白质中的14种蛋白质的子列表，这些蛋白质可以位于在细胞外的细胞外基质(ecm)中或是分泌的(表2)。对这些蛋白质的文献调查也证明其中一部分是基质细胞蛋白质家族的成员。该家族包括存在于ecm中的细胞外蛋白，但不仅涉及其结构构造。已知基质细胞蛋白参与多种过程，如细胞粘附的调节、分化和增殖、细胞间相互作用以及信号转导途径。
[0105]
使用string网站，我们示出了我们感兴趣的26种蛋白质中的15种(13种在网络中以及另外2种)至少在功能上是联系的，支持共表达和共定位证据(图4)。这种联系表明这些基因参与了一个共同的生物过程。
[0106]
此外，使用string网站的本体富集(ontological enrichment)也与细胞外蛋白在共同生物过程中发挥作用的概念一致，指出了富集的项(enriched terms)，例如“细胞外基
质组织”、“胶原原纤维组织”或“信号转导的调节”(表3)。
[0107]
所有这些证据加在一起表明，保守的26个基因的一个子集与在细胞外发生的在ecm水平上的独特生物过程有关。我们还可以确切地说，这种生物学过程不仅与ecm的结构组成有关，而且还通过细胞间通讯和细胞内信号转导参与细胞命运，与应激反应一致。
[0108]
[0109]
[0110][0111]
表3.根据string网站，“生物过程”类别中的本体富集。这些数据表明，26个基因中的大多数涉及细胞外功能，例如细胞外基质组织和/或信号转导的调节。
[0112]
实施例3：geo数据库调查
[0113]
本研究中鉴定的26个基因不是大多数其他应激状态或应激反应研究中发现的经典基因的一部分。为了确认他们参与了这一生物过程，我们随后分析了来自ncbi的geo数据库(gene expression omnibus,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。这个公开可用的数据库包含来自rna
‑
seq和微阵列实验的原始数据，可以在线查询或通过命令行请求进行查询。
[0114]
材料和方法
[0115]
在我们执行此搜索时(2017年2月)，geo数据库包含大约95096个实验。为了用我们的基因列表查询geo数据库，我们使用了一个自制的python脚本，它允许我们为26个基因中的每一个查询geo数据库，并检索其中这些基因中的至少一个是差异表达的所有实验。然后我们检查了这些基因在关于我们定义的应激源暴露的研究中是否经常差异表达。
[0116]
结果
[0117]
我们发现三个实验，每个实验都显示了我们26个基因中的11个差异表达的基因(但三个实验中的每个实验中的11个基因都不相同)，其中一个是关于骨骼肌对体育锻炼的反应，而其他的涉及癌症疾病的研究。将三个实验中发现的基因结合起来，提供了以下基因列表：anxa1、anxa2、col1a1、col14a1、efemp1、hmox1、lgals1、mgp、mrc1、nes、panx1、postn、runx1、serpinh1、slit3、thbs1和tnc。在大多数情况下，我们使用这种方法确定的实验与应激源暴露、细胞外基质相关疾病或衰老过程有关。这些研究还表明，我们的26个基因中只有一个子集参与了这些机制，并且其中一部分更频繁地一起差异表达。这些结果再次表明，只有基因初始集合的一部分与进化保守的应激反应有关，而其他基因更依赖于应激因素的性质或更具有物种特异性。
[0118]
实施例4：在另一个动物模型中评估源自26个基因的4
‑
26个基因签名(signature)
[0119]
来自26个基因的各种签名的表现，用于确定受试者的应激状态的存在或不存在(如“应激得分”所反映的)，和/或用于评估受试者的应激反应水平，特别是用于确定受试者的适应状态(如由“适应得分”和“非适应得分”所反映的)，在非适应条件下(如实施例1中所述)在pn模型的动物中进行了检查，还在另一个暴露于异型生物质应激(由氧化剂分子百草枯诱导)的鸡的动物模型中进行了测试。
[0120]
材料和方法
[0121]
暴露于百草枯诱导的应激的鸡模型(“鸡
‑
百草枯模型”)
[0122]
当前研究中使用的所有实验程序都得到了进行研究的机构的伦理和研究委员会的批准。从d1至d21共饲养144只1日龄ross 308雄性肉鸡，其平均体重(bw)为39g。它们在环
境受控的房间里被分配在72个带有网底的层架式鸡笼(0.5
×
0.42m2)中(6只鸡/笼)。这些鸡被随机分配到具有相似起始重量的处理栏(treatment pens)。每个笼子配备一个槽式喂食器和一个饮水器。在所有研究期间，鸡可以随意获取饲料和水。放置处的平均温度为33℃，每2天降低1℃，直到23℃，以在整个研究过程中提供舒适度。在整个试验期间的每24小时期间，照明程序为18小时亮和6小时暗。
[0123]
实验设计是完全随机的因素设计，由安慰剂组或氧化应激组组成，因此有两种实验处理，每种处理12个重复，每个重复6只鸡。氧化应激仅从d7至d14通过供水系统以110μg/ml的剂量补充异型生物质，即百草枯二氯化物(sigma
‑
aldrich company ltd.，dorset，英国)，来施加。该剂量是通过使用单独放置在每个笼子中的水容器来实现的。对照组使用类似容器在同一时期接受标准水(安慰剂)。分别从d1
‑
d7和d8
‑
d21提供初始和生长饮食。按照nrc(1994)的建议，基础饮食是标准的基于小麦/玉米
‑
大豆的肉鸡饮食，其配方可满足或超过肉鸡的营养需求。在d1、d7、d14和d21记录体重(bw)。在d14和d21，每个处理的每个围栏重复处死一只鸡用于组织收集。简要地说，将100mg组织(胸部、肝脏和回肠)浸入含有1ml(sigma
‑
aldrich)的2ml eppendorf管中，并在
‑
20℃保存直至分析。如实施例1中所述进行rna提取和纯化。
[0124]
通过定量rt
‑
pcr测量基因表达水平
[0125]
为了去除痕量的基因组dna污染物，将2.5μg的总rna用2.5u的dnasei(thermofischer)在25℃下处理15分钟，最终体积为20μl。接下来，通过添加edta至终浓度为8mm并在70℃下温育10分钟来抑制dnase。dnase处理的rna样品的一半被逆转录(rt)，另一半作为未rt对照。将总体积17.6μl中的rna变性，其中包含1.25μg总rna、5mm九核苷酸随机引物(dn9)和0.5μm每种dntp(thermofischer)。将该混合物在热循环仪(simpliamptm，life technologies)中加热至70℃并保持5分钟。然后加入rt
‑
amv缓冲液(life sciences advance technology)、40u rnasine(promega)和0.25u amv逆转录酶(rt)(life sciences advance technology)，调整体积至21.6μl。通过在25℃下温育15分钟来杂交引物，并在热循环仪中在45℃下进行延伸2小时。平行处理未rt对照，但省略amv
‑
rt酶的添加。
[0126]
对于定量pcr反应，将1μl的cdna样品稀释至1/3与2μl特异性引物混合物(各2.5mm)和5μl 2x takyon sybrgreen
–
无rox(eurogentec)混合，最终体积为10μl。每个pcr反应设置一式三份。使用384孔板和以下程序在lc480nano(roche)上进行扩增：在95℃下进行1个初始活化循环3分钟，然后进行45个循环[95℃持续10秒；60℃持续15秒；72℃持续15秒]。每次扩增的特异性通过检测对应于单个扩增子的单峰的融合曲线技术来监测，包括在95℃下初始变性5秒，然后以0.11℃/秒的速度从55℃升至95℃，每秒采集5次。使用回归模式(regression mode)确定ct，仅考虑超过35个循环的ct进行进一步分析，并根据δδct方法计算差异表达水平。
[0127]
算法分析和雷达图表达
[0128]
应激、适应和不适应的得分是根据氧化应激组和安慰剂组之间的基因列表的差异表达以及整合了对我们四个参考应激模型的观察结果的算法确定的。然后使用适当的表达绘制这些得分，以便对动物应激状态进行简单直观的诊断。
[0129]
应激(s)分数的确定
[0130]
首先，根据用于测量基因表达的技术对26个基因中的每一个的差异表达(de)进行编码，如下：
[0131]
·
对于rna
‑
seq分析(如在四个初始应激模型中所用，特别地，在非适应条件下的pn模型中，在本示例中评估的“pn
‑
na”模型)：
[0132]
‑
如果上调(倍数变化，fc>1且调整后的p值≤0.05)：变量＝u
[0133]
‑
如果下调(fc<1且调整后的p值≤0.05)：变量＝d
[0134]
‑
如果不是de(fc＝1或调整后的p值>0.05)：变量＝
‑
[0135]
p值由edger确定并使用benjamini
‑
hochberg方法进行调整。
[0136]
·
对于rt
‑
qpcr分析(如在鸡百草枯模型中所用)：
[0137]
‑
如果上调(倍数变化，fc>1.5)：变量＝u
[0138]
‑
如果下调(fc<0.6667)：变量＝d
[0139]
‑
如果不是de(0.6667<fc<1.5)：变量＝
‑
[0140]
然后，考虑到mrc1、serpinh1、g0s2和chac1基因(在列表“列表a”下分组)仅在应激动物(适应或非适应)中观察到上调或不是de，而在对照动物中从未观察到de：
[0141]
列表a得分＝(具有变量＝u的列表a的基因数量)
[0142]
考虑到ankrd33b基因(“列表b”)仅在应激动物(适应或非适应)中观察到下调或不是de，而在对照动物中从未观察到de：
[0143]
列表b得分＝1，如果ankrd33b变量＝d
[0144]
列表b得分＝0，如果ankrd33b变量＝u或
‑
[0145]
考虑到剩余的21个基因中的每一个(称为“列表c”)仅在应激动物(适应或非适应)中观察到上调、下调或不是de，而在对照动物中从未观察到de：
[0146]
列表c得分＝(具有变量＝u的列表c的基因数量) (具有变量＝d的列表c的基因数量)
[0147]
最后，应激得分值计算如下：
[0148]
应激(s)得分＝(列表a得分 列表b得分 列表c得分)/所考虑签名的基因数量*100
[0149]
确定适应(a)和非适应(na)得分
[0150]
在我们的四个参考模型(pn、pt、ct和sn模型)中，仅在非适应动物中发现15个基因上调或下调，并且仅在适应动物中发现1个基因上调或下调。
[0151]
考虑到col1a1、panx1、efemp1、cidea、tnc、gfpt2、slit3、thbs1、mgp、lgals1、postn和anxa2基因(在列表“列表d”下分组)仅在非适应动物中观察到下调，而从未在适应动物或对照动物中观察到：
[0152]
列表d得分＝(具有变量＝d的列表d的基因数量)
[0153]
考虑到sh2b2基因(“列表e”)仅在非适应动物中观察到上调，而从未在适应动物或对照动物中观察到：
[0154]
列表e得分＝1，如果sh2b2变量＝u
[0155]
列表e得分＝0，如果sh2b2变量＝d或
‑
[0156]
考虑到kctd12和nes基因(在列表“列表f”下分组)仅在非适应动物中发现了de(上调或下调)，而从未在适应动物中发现：
[0157]
列表f得分＝(具有变量＝u的列表f的基因数量) (具有变量＝d的列表f的基因数
量)
[0158]
非适应得分值计算如下：
[0159]
非适应(na)得分＝(列表d得分 列表e得分 列表f得分)/仅在非适应动物中上调或下调的签名基因数量*100
[0160]
考虑到sh2b2基因(“列表g”)仅在适应动物中观察到下调，而从未在非适应动物或对照动物中观察到：
[0161]
列表g得分＝1，如果sh2b2变量＝d
[0162]
列表g得分＝0，如果sh2b2变量＝u或
‑
[0163]
适应得分值计算如下：
[0164]
适应(a)得分＝(列表g得分)/仅在适应动物中上调或下调的签名基因数量*100
[0165]
得分绘图
[0166]
将s、na和a得分以雷达图的形式绘制在三个相应的轴上。图中的数字是指每种得分的百分比。
[0167]
结果
[0168]
在pn
‑
na模型和鸡
‑
百草枯模型中使用26个基因或四个最保守的基因(anxa1、anxa2、chac1、postn)获得的s、na和a得分如图5所示。用两种签名均获得了类似的结果。正如预期的那样，pn
‑
na模型的特征在于高应激(s)和非适应(na)得分，其中适应(a)得分为0％(图5，上图)。在鸡
‑
百草枯模型中，我们的方法使用任一签名证明了高应激(s)和非适应(na)得分(图5，下图)。这种非适应状态与百草枯处理的动物记录的体重减轻一致。总体而言，在不同于我们的四种参考动物模型的动物模型中获得的这些观察结果验证了该方法。
[0169]
然后，我们在鸡
‑
百草枯模型中计算了用所有4
‑
基因到26
‑
基因签名获得的应激、适应和非适应得分，这些签名可以来自26个基因。结果示于表4。
[0170]
任何大小的签名的平均应激得分值与使用26
‑
基因签名获得的应激得分值相同，但标准偏差随着签名中基因数量的增加而降低。对于非适应分数，平均值相似(介于78.2％和80.0％之间)，并且标准偏差也随着签名中基因数量的增加而降低。关于适应得分，在该模型中未检测到适应状态，同样与在所有应激动物中观察到的体重减轻一致。
[0171]
这些结果表明，源自26个基因的4
‑
26个基因的不同签名可用于确定受试者是否存在应激状态，和/或用于评估受试者的应激反应水平。
[0172][0173][0174]
表4.在鸡
‑
百草枯模型中针对不同大小的签名(4
‑
26个基因)计算的应激、不适应和适应得分值(平均值
±
标准差)。作为参考，使用四个最保守的基因获得的得分显示在第一行。