一种橡胶树磺肽素基因HbPSK5及其编码小肽和应用的制作方法

一种橡胶树磺肽素基因hbpsk5及其编码小肽和应用
技术领域
1.本发明属于植物生理与分子育种技术领域，具体涉及一种橡胶树磺肽素基因hbpsk5及其编码小肽和应用。


背景技术：

2.橡胶与石油、煤炭和钢铁并称为四大工业原料。橡胶按其来源可分为天然橡胶和合成橡胶。天然橡胶来自产胶植物，是一种可再生资源。虽然有2000多种植物可产天然橡胶，但是巴西橡胶树因其具有橡胶含量高、质量好、经济寿命长、易采收等特点，从而成为天然橡胶的主要来源，占世界所需天然橡胶的98％以上；合成橡胶的原料是石油，因此合成橡胶是一种不可再生资源。为了应对全球气候变化，随着化石能源消耗的减少，合成橡胶在橡胶中的份额会日益下降，但天然橡胶的需求量将大幅度增加。
3.虽然巴西橡胶树的驯化时间短，还不到150年，但是栽培品种的产量已经增加四倍多，其中一个被驯化的主效性状就是树干树皮中的次生乳管列数量。因为乳管是合成和贮存天然橡胶的场所，所以，树干树皮中的乳管数量与天然橡胶产量显著正相关。橡胶树的次生乳管是由次生乳管细胞构成的一种有节乳汁管，而次生乳管细胞是由维管形成层的纺锤状原始细胞分化而来的。已有研究表明橡胶树分化次生乳管主要受茉莉酸信号途径调控。外施茉莉酸或者冠菌素(coronatine，cor，一种茉莉酸类似物)都可诱导橡胶树的次生乳管分化。
4.磺肽素(psk)是一种小肽类激素，于1996年首次从芦笋叶肉细胞悬浮培养的培养基中分离鉴定。在植物中psk由一个小的基因家族编码，其转录翻译形成的psk前体经蛋白水解和磺化修饰，形成包含两个磺化基团在内的5个氨基酸(tyr(so3h)
‑
ile
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tyr(so3h)
‑
thr
‑
gln
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oh)的最终产物psk
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α。目前研究表明psk
‑
α广泛参与了植物的生长发育等重要生物学过程。
5.通过组织特异性分析，我们鉴定到一个橡胶树形成层区域特异表达的磺肽素编码基因hbpsk5。荧光定量分析显示hbpsk5的表达量可被cor显著诱导。外施psk
‑
α我们观察到可有效地促进橡胶树次生乳管分化。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种本发明提供了一种橡胶树形成层特异表达的磺肽素基因hbpsk5及其编码小肽，可有效地促进橡胶树次生乳管分化，有望用于橡胶树产量的化学调控和遗传改良。
7.本发明的第一个方面是提供一种橡胶树磺肽素基因hbpsk5，其核苷酸序列如seq id no:1所示。
8.本发明的第二个方面是提供一种橡胶树磺肽素基因hbpsk5编码的前体蛋白，其氨基酸序列如seq id no:2所示。
9.本发明的第三个方面是提供一种小肽psk
‑
α，其位于权利要求2所述前体蛋白的靠
近c端位置，氨基酸序列如seq id no:3所示。
10.本发明第四个方面是提供一种本发明第一个方面所述的橡胶树磺肽素基因hbpsk5的全长序列扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：以橡胶树树皮内层为材料提取总rna，以反转录好的cdna为模板，以正向全长引物atgaagcaacatctttccca(seq id no:4)和反向全长引物tcaaggcttgtggtgctgg(seq id no:5)，通过pcr方法扩增获得橡胶树磺肽素基因hbpsk5，其序列如seq id no:1所示。
11.本发明的第五个方面是提供一种扩增hbpsk5基因全长的引物对，其核苷酸序列如seq id no:4和seq id no:5所示。
12.本发明第六个方面是提供一种本发明第一个方面所述的橡胶树磺肽素基因hbpsk5表达量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：分别以h2o(阴性对照)和cor(阳性对照)处理的橡胶树树皮内层为材料提取总rna，以反转录好的cdna为模板，以正向特异性引物tagcctccctccttat(seq id no:6)和反向特异性引物tgagctgcaagtgttct(seq id no:7)，通过荧光定量pcr方法对hbpsk5基因的表达量进行分析。以橡胶树hbubc2b作为内参基因。
13.本发明的第七个方面是提供一种检测hbpsk5基因表达量的特异引物对，其核苷酸序列如seq id no:6和seq id no:7所示。
14.本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的橡胶树磺肽素基因hbpsk5、或者本发明第二个方面所述的前体蛋白、或者本发明第三个方面所述的小肽psk
‑
α在诱导橡胶树产生次生乳管中的应用。
15.本发明的有益效果在于：
16.本发明鉴定到一个橡胶树形成层区域特异表达的磺肽素基因hbpsk5，该基因的表达量受cor显著上调，该基因编码的小肽psk
‑
α可以有效诱导橡胶树产生次生乳管，有望用于橡胶树产量的化学调控和遗传改良。
附图说明
17.图1为实施例1中橡胶树6个磺肽素编码基因在不同组织中的表达模式，只有hbpsk5在形成层区特异表达。
18.图2为实施例2中hbpsk5在cor处理后不同时间段的表达量分析。
19.图3为实施例3中h2o阴性对照、cor阳性对照和hbpsk5基因编码的小肽psk
‑
α处理10天后的橡胶树萌条显微结构图。黑色箭头表示次生乳管。ca：形成层；r：射线细胞；s：筛管。bar＝100μm。
具体实施方式
20.下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
21.实施例1橡胶树形成层区域特异表达的磺肽素基因hbpsk5鉴定
22.本发明通过分析橡胶树基因组序列，发现有6个编码磺肽素的基因(hbpsk1
‑
hbpsk6)。进一步分析这6个基因在形成层、初生胶乳、次生胶乳、雄花、雌花、叶片等五个组织中的表达情况，发现只有hbpsk5在形成层区域特异表达(图1)。该成员的基因序列如seq id no.1所示，前体蛋白序列如seq id no.2所示。
23.以橡胶树“热研7
‑
33
‑
97”树皮内层为材料，根据多糖多酚植物总rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)操作说明，提取总rna并反转录cdna。以反转录好的cdna为模板，以正向全长引物atgaagcaacatctttccca和反向全长引物tcaaggcttgtggtgctgg，通过pcr方法扩增获得橡胶树磺肽素基因hbpsk5，其序列如seq id no:1所示。
24.pcr扩增反应体系20ul：2x pcr buffer 10μl，正、反向引物(10μmol
·
l
‑
1)各1μl，dna模板1μl，ddh2o为7μl。
25.pcr扩增程序：96℃预变性10min；96℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s，共设置35个循环；72℃延伸10min。
26.实施例2hbpsk5在cor处理后不同时间段的表达量分析
27.一、处理制剂的制备与施用
28.将cor(c8115
‑
1mg，sigma，美国)用灭菌水配制成600μm的母液，在4℃下保存。工作液浓度为20μm。
29.选取橡胶树品种“热研7
‑
33
‑
97”的萌条，刮去萌条的第二伸长单位(从上往下数)茎的表皮及部分皮层(1cm
×
1cm)，马上在刮伤部位分别施加h2o和20μm cor，随后立即用封口膜紧密缠绕包裹。在处理后的第1h、第2h、第1d、第3d分别用无菌刀片切取处理部位的树皮材料，置于液氮中保存。
30.二、hbpsk5在cor处理后不同时间段的表达量分析
31.根据多糖多酚植物总rna提取试剂盒(天根生化科技有限公司)操作说明，提取液氮保存材料的总rna并反转录cdna。以反转录好的cdna为模板，以正向特异引物tagcctccctccttat和反向特异引物tgagctgcaagtgttct，进行荧光定量pcr分析。以hbubc2b为内参基因，内参基因的正向引物为cgaccaagttttcatttcgggtg，反向引物为agtctcttctttgctggggttg。荧光定量pcr在bio
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rad cfx384荧光定量pcr仪进行。三次生物学重复。
32.荧光定量pcr反应体系10ul：sybr premix ex taq(2x)5μl，正、反向引物(10μmol
·
l
‑
1)各1μl，cdna模板1μl，ddh2o为2μl。
33.荧光定量pcr扩增程序：96℃预变性5min；96℃变性30s，58℃退火延伸30s。共设置40个循环。
34.hbpsk5基因相对表达量的计算采用公式2
–
δδct
。数据分析及作图采用graphpad prism 7。
35.结果如图2所示，在cor处理1h时，hbpsk5基因在阴性对照中的相对表达量为2.86，而在cor处理下的相对表达量为10.56，提升了3.69倍。这一结果表明hbpsk5快速响应cor信号，推测可能在诱导橡胶树次生乳管分化中起重要作用。
36.实施例3psk
‑
α诱导橡胶树次生乳管产生
37.一、处理制剂的制备
38.1、将cor(c8115
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1mg，sigma，美国)用灭菌水配制成600μm的母液，在4℃下保存。工作液浓度为20μm。
39.2、将小肽psk
‑
α(委托苏州强耀生物科技有限公司采用固相合成法合成)用灭菌水配制成1mm的母液，在
‑
20℃保存。工作液浓度为100μm。
40.二、制剂的施用和检测
41.选取橡胶树品种“热研73397”的萌条，刮去萌条的第二伸长单位(从上往下数)茎的表皮及部分皮层(1cm
×
1cm)，马上在刮伤部位分别施加无菌水、20μm冠菌素、100μm磺化psk
‑
α，随后立即用封口膜紧密缠绕包裹。处理10天后，分别切取处理部位的树皮(带部分木质部)，置于80％乙醇中，室温固定24小时。然后经过酒精序列脱水、冰醋酸过渡、碘
‑
溴处理、正丁醇透明、渗蜡和包埋等常规石蜡切片程序，进行石蜡切片。切片经0.5％固绿衬染后，在研究显微镜下观察、照相。
42.结果如图3所示，磺化psk
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α可显著诱导橡胶树次生乳管的产生，细胞学观察显示在靠近形成层一侧出现一排次生乳管。作为阳性对照的冠菌素处理后也有同样的效果，但作为阴性对照的无菌水不能诱导次生乳管的产生。
43.以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。