油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因BnNTT1在调控作物含油量中的应用的制作方法

油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因bnntt1在调控作物含油量中的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程和作物育种技术领域，具体涉及油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因bnntt1在调控作物含油量和脂肪酸组成中的应用。


背景技术：

2.植物食用油提供了人体所需的大部分脂肪酸，其中饱和脂肪酸是人类生命活动中的主要能量来源；此外，植物油脂还是制造化妆品、油漆、肥皂、润滑剂等化工产品的重要原料。油菜则是世界三大油料作物之一，菜籽油消费量位居世界第三，仅次于棕榈油和大豆油。据研究表明，油菜种子含油量每提高1个百分点，单位面积油菜的产油量就能提高2.3
‑
2.5百分点左右，因此提高种子含油量是提高油菜单位面积产油量的关键措施之一。此外，高油育种也一直是油菜育种的主要目标之一。
3.油脂是油和脂肪的统称，油是不饱和高级脂肪酸甘油酯，脂肪是饱和高级脂肪酸甘油酯。脂肪酸的生物合成受到多种酶、底物和转录因子的调控，是一个复杂的生理生化反应。accase就是一个脂肪酸从头合成的关键作用酶，研究表明异质型的accase可能调控胡麻种子发育前期油脂的合成积累；另外，一些转录因子也在脂肪酸的合成过程中起到了关键的调控作用，包括lec1、lec2、fus3、wri1和dof等，这些与脂肪酸合成相关的转录因子组成了复杂的网络系统，来共同调控种子发育过程中油脂的合成与积累。
4.本发明从油菜中克隆了保守的三磷酸核苷酸转运蛋白基因bnntt1。研究表明，在组成型启动子35s的作用下将该基因在油菜中过表达可以显著提高种子的含油量；而利用crispr/cas9基因编辑技术创建的突变体油菜种子的含油量显著下降。以上结果表明bnntt1基因在调控油菜种子含油量中起到重要作用，可以为油菜高油育种提供理论参考依据，同时为油脂合成这一研究提供新的思路。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供油菜三磷酸核苷酸转运蛋白基因bnntt1在调控作物含油量和脂肪酸组成中的应用，该基因能与atp/adp结合，将胞浆内的atp转运到叶绿体中，并将adp交换到细胞质中。该基因在油菜c6和a7染色体上各有两个拷贝，分别是bnac06.ntt1a(bnac06g19090d)、bnac06.ntt1b(bnac06g40660d)、bnaa07.ntt1a(bnaa07g38360d)和bnaa07.ntt1b(bnaa07g35740d)，基因的核苷酸序列分别如序列表seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4所示，其中bnac06.ntt1a由1851bp组成、bnac06.ntt1b由1848bp组成、bnaa07.ntt1a由1851bp组成，bnaa07.ntt1b由1845bp组成；该基因编码的蛋白质序列分别如序列表seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8所示，其中bnac06.ntt1a编码616个氨基酸、bnac06.ntt1b编码615个氨基酸、bnaa07.ntt1a编码616个氨基酸，bnaa07.ntt1b编码614个氨基酸。可以采用pcr技术从植物基因组、mrna和cdna中扩增得到本发明的基因。
no:3和seq id no:4所示的序列，含有完整的orf阅读框及起始密码子atg，它们分别编码616、615、616和614个氨基酸(分别见seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8)。在种子发育过程中，我们发现bnac06.ntt1b和bnaa07.ntt1a的表达水平高于bnac06.ntt1a和bnaa07.ntt1b。此外，bnac06.ntt1a和bnaa07.ntt1b具有保守的氨基酸序列和高度相似的蛋白质结构。为便于操作，我们选择基因bnac06.ntt1b和bnaa07.ntt1a作为候选基因进行克隆。
20.(1)rna的提取
21.总rna的提取采用全式金公司的transzol(目录号et101)，提取方案遵从试剂盒使用说明书。需要提前准备的试剂有rnase
‑
free水、氯仿、异丙醇和75％乙醇(由depc处理的水配制)。所用试剂和实验用品均经过depc灭活rna酶处理。具体步骤如下：
22.a.取甘蓝型油菜的叶片于液氮中充分研磨直至粉末状，取100mg研磨好的样品转移到1.5ml离心管中，加入1ml transzol，之后上下剧烈震荡使之充分混匀，进行匀浆处理，之后室温静置5分钟；
23.b.向离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；
24.c.10，000
×
g 4℃离心15分钟；
25.d.将上层无色的水相转移至新的离心管中(体积大约为0.6ml)，加入0.5ml经过预冷的异丙醇并颠倒混匀，室温孵育10分钟；
26.e.10，000
×
g 4℃离心10分钟，倒去上清，离心管侧壁和底部形成沉淀；向离心管中加入1ml 75％乙醇(depc水配制)，剧烈涡旋；
27.f.7，500
×
g 4℃离心5分钟，去上清，室温晾干沉淀15分钟左右；
28.g.将沉淀溶于50μl
‑
100μl rna溶解液中，55
‑
60℃孵育10分钟，将样品保存于
‑
80℃冰箱中备用。
29.h.取1μl抽提的总rna在nanodrop下测定rna浓度和质量，依据1.8<od260/od280<2.0鉴定rna纯度。同时取2μl进行1％的琼脂糖凝胶电泳，检测完整性和质量。
30.(2)rna反转录
31.本实验所用的反转录试剂盒是全式金one
‑
step gdna removal and cdna synthesis supermix(目录号ae311
‑
03)。具体实验操作遵从使用说明书：
32.以5μg总rna为模板，依次加入1μl的anchored oligo(dt)18primer，10μl的2
×
es reaction mix，1μl的rt/ri enzyme mix，1μl的gdna remover，最后用rnase
‑
free water补充至20μl。将以上反应体系轻轻混匀后置于42℃孵育30min，进行合成第一链cdna和去除gdna；之后，85℃加热5秒钟失活rt/ri和gdna remover。最后，加入180μl rnase
‑
free water溶解合成的cdna。
33.(3)bnac06.ntt1b和bnaa07.ntt1a基因的扩增
34.以上述cdna为模板，用正向引物5
’‑
gcgggtaccatggcaaccgtgatacaaac
‑3’
和反向引物5
’‑
gcgggatccgtatgttggtgggagctg
‑3’
扩增得到含有bnac06.ntt1b全长cds的片段；用正向引物5
’‑
gcgggtaccatggaagcggcgatacaaac
‑3’
和反向引物5
’‑
gcgggatccgtatgttggtgggagctg
‑3’
扩增得到含有bnaa07.ntt1a全长cds的片段。采用i
‑5tm2×
high
‑
fidelity master mix(tsingke biologica technology)进行pcr扩增。pcr扩增反
应体系为:
[0035][0036]
按照上述反应体系配置好反应液于pcr管中，在bio
‑
rad pcr仪上进行扩增，pcr扩增程序为：
[0037][0038]
扩增后产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，扩增获得1848bp的bnac06.ntt1b全长和1851bp的bnaa07.ntt1a全长，pcr扩增产物的挖胶回收使用天根琼脂凝胶dna回收试剂盒(dp130227)。
[0039]
实施例2 bnac06.ntt1b和bnaa07.ntt1a基因过表达转化载体的构建
[0040]
(1)对上述获得的bnac06.ntt1b和bnaa07.ntt1a片段用快速限制性内切酶kpni和bamhi进行双酶切，本实验所用的限制性内切酶为上海赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品。双酶切体系如下:
[0041][0042][0043]
酶切反应在37℃水浴1.5小时。酶切产物利用北京天根生物工程有限公司的通用型dna纯化回收试剂盒(dp130227)进行回收。
[0044]
(2)酶切产物连接到载体p35s
‑
fast，连接反应体系如下：
[0045][0046]
连接反应条件：22℃3小时。
[0047]
(3)转化大肠杆菌dh5α，筛选阳性克隆后提质粒酶切鉴定，选取3个阳性克隆送样测序，分析结果显示，bnac06.ntt1b和bnaa07.ntt1a基因的cds序列成功连接上载体，即成功构建并转化植株的植物表达载体p35s
‑
fast
‑
bnac06.ntt1b和p35s
‑
fast
‑
bnaa07.ntt1a(如图2所示)。
[0048]
(4)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株gv3101，挑选阳性单克隆于
‑
80℃冰箱保存。使用电击法转化农杆菌gv3101感受态，具体实验步骤如下：
[0049]
a.用纯水、超纯水、无水乙醇分别清洗电转杯，置于超净台晾干；
[0050]
b.将重组质粒和农杆菌gv3101感受态置于冰上解冻；
[0051]
c.取构建正确的重组质粒1μl，加入到25μl农杆菌gv3101感受态中，轻轻吸打混匀，避免产生气泡；
[0052]
d.将上述混合液沿着杯壁迅速转入已经预冷的电转杯中；
[0053]
e.将电转仪调至1800v，之后用吸水纸擦干电转杯外壁，在1800v电压条件下电击；
[0054]
f.电击成功后，向电转杯中加入200μl无抗lb液体培养基，轻轻吸打几下，之后将溶液转移至1.5ml无菌离心管中，28℃150r/min活化2小时左右；
[0055]
g.将复苏的菌株涂到含有抗生素的lb固体培养基上，于28℃培养箱中倒置培养48小时；
[0056]
h.在平板上挑取单菌落，用载体前引物和目的基因后引物对其进行pcr扩增，1％琼脂糖凝胶电泳检测阳性克隆。
[0057]
i.取阳性菌液加入抗性的lb液体培养基，于28℃，150r/min摇床中扩大培养至od值达到0.8，加入等体积的50％(v/v)的甘油混匀，将其保存于
‑
80℃冰箱。
[0058]
实施例3 bnantt1
‑
crispr载体的构建
[0059]
利用中国农业大学陈其军实验室的sgrna
‑
cas9系统创建突变体。实验操作步骤如下:
[0060]
(1)登录到网站http://www.cbi.hzau.edu.cn/cgi
‑
bin/crispr，筛选靶点。构建两个靶点同时编辑bnac06.ntt1a(bnac06g19090d)、bnac06.ntt1b(bnac06g40660d)、bnaa07.ntt1a(bnaa07g38360d)和bnaa07.ntt1b(bnaa07g35740d)四个基因的载体，两个靶点均设计在四个基因的第一外显子上，sgrna1的碱基序列为5
’‑
ccttacccgccaaacccatcgg
‑3’
，5’端距离起始密码子atg 34bp，sgrna2碱基序列为5
’‑
gtgaatatagttgctgagagg g
‑3’
，5’端距第一个外显子末端159bp。bnac06.ntt1b基因中两靶点相距578bp，bnaa07.ntt1a基因的两靶位点间相隔572bp。
[0061]
(2)设计引物：
[0062]
dt1
‑
bsf:atatatggtctcgattgccttacccgccaaacccatgtt
[0063]
dt1
‑
f0:tgccttacccgccaaacccatgttttagagctagaaatagc
[0064]
dt2
‑
r0:aactctcagcaactatattcaccaatctcttagtcgactctac
[0065]
dt2
‑
bsr:attattggtctcgaaactctcagcaactatattcaccaa
[0066]
(3)pcr扩增：以稀释100倍的pcbc
‑
dt1t2为模板进行四引物pcr扩增。dt1
‑
bsf和dt2
‑
bsr为正常引物浓度；dt1
‑
f0和dt2
‑
r0稀释20倍。pcr扩增体系为:
[0067][0068]
pcr扩增程序为：
[0069][0070]
(4)纯化回收pcr产物，建立如下酶切
‑
连接体系：
[0071][0072]
(5)取5μl连接产物转化大肠杆菌感受态，在kana抗性的lb培养基上筛选阳性克隆。u626
‑
idf u629
‑
idr＝726bp菌落pcr鉴定，u626
‑
idf和u629
‑
idf测序，测序正确的载体即为构建成功的crispr载体。
[0073]
(6)将构建正确的重组质粒载体导入农杆菌菌株gv3101感受态中，挑选阳性单克
隆于
‑
80℃冰箱保存，继续油菜遗传转化工作的开展。
[0074]
实施例4遗传转化实验
[0075]
(1)油菜的遗传转化
[0076]
对构建好的过表达载体和crispr载体采用下胚轴暗光培养进行油菜的遗传转化，本发明中用于油菜转化的受体为甘蓝型油菜westar，具体方法如下：
[0077]
a.种子的灭菌：
[0078]
将经过挑选的成熟饱满的甘蓝型油菜
‘
westar’种子倒入培养盒中，用75％的酒精浸泡种子1min左右，时间不能超过5分钟；使用无菌水清洗浸泡后的种子1
‑
2次；加入能够淹没种子的0.15％
‑
0.2％升汞溶液(保存于实验室的棕色瓶中，可用实验室5％的母液稀释)，消毒15min；用无菌水清洗种子5
‑
6次。
[0079]
b.播种：
[0080]
用灭过菌的镊子将种子播种于m0培养基，每个培养皿均匀播种40
‑
50粒种子；播完种后将培养皿放在暗光条件下培养7天左右，温度25℃。
[0081]
c.农杆菌的培养：
[0082]
播种五天后，在抗性平板上接种细菌，用经过消毒的接种环蘸取含有目的基因的农杆菌菌液在抗性lb平板上划线；2天后在抗性平板上用牙签或枪头吸取阳性单菌落，置于抗性lb液体培养基中吹打，于28℃，150r/min摇菌。
[0083]
d.外植体的制备和侵染：
[0084]
检测菌液在600nm吸收光条件下的浓度(分光光度计)，测出菌液的od值，od值在0.6
‑
0.8之间为最佳，此时将菌液6000rpm离心10min，弃上清；用与菌液等体积的dm(dilution medium)液体重悬，6000rpm离心10min，弃上清；用与菌液相同体积的dm溶液悬浮。之后取2ml菌液于灭菌的培养皿中，20ml dm溶液对其进行稀释(1：10)；用无菌解剖刀和镊子将暗光培养7天后的幼苗下胚轴切下，切取长度为0.8
‑
1.0cm，切取外植体时尽量一刀切下，保持其切口整齐；将切取下来的外植体放到已配好浓度的菌液中，侵染30min(时间不能过长)，用移液器隔段时间吸打一次，使得切口充分接触菌液。
[0085]
e.愈伤组织的培养：
[0086]
用已灭菌的吸水纸吸干外植体上的菌液，再将外植体转移到m1培养基中，每皿50
‑
60个外植体，暗光条件下培养2天左右，温度25℃；两天后，将外植体转移到诱导愈伤的m2培养基中，光照条件下进行培养(白天16h/夜晚8h)，温度22℃，之后都在光照条件下进行培养；三周后，将生长正常，两端膨大的外植体转到分化培养基m3中，每2
‑
3周继代一次，长出绿芽为止；切下已经有明显基节的绿芽并将其转入培养基m4中进行生根，需要2
‑
4周，待生根后将其移栽至室外大田里，观察植株田间生长表型(培养基配方见表1)。
[0087]
表1下胚轴暗光培养的培养基配方
[0088]
[0089][0090]
(2)过表达转化单株的鉴定
[0091]
提取获得的油菜过表达转化单株的基因组dna，通过pcr检测外源基因片段的插入，本发明中过表达的骨架载体为p35s
‑
fast，在骨架载体上设计引物fast
‑
f(5
’‑
aaaggccatcgttgaagatg
‑3’
)和fast
‑
r(5
’‑
tcgaactcagtaggattctg
‑3’
)，通过载体骨架引物与外源片段引物搭配来进行pcr反应(fast
‑
f和bnac06.ntt1b
‑
r/bnaa07.ntt1a
‑
r或者bnac06.ntt1b
‑
f/bnaa07.ntt1a
‑
f和fast
‑
r)，外源片段引物bnac06.ntt1b
‑
f(5
’‑
gcgggtaccatggcaaccgtgatacaaac
‑3’
)，bnac06.ntt1b
‑
r(5
’‑
gcgggatccgtatgttggtgggagctg
‑3’
)，bnaa07.ntt1a
‑
f(5
’‑
gcgggtaccatggaagcggcgatacaaac
‑3’
)和bnaa07.ntt1a
‑
r(5
’‑
gcgggatccgtatgttggtgggagctg
‑3’
)，在pcr水平检测转基因苗。
[0092]
pcr反应体系为：
[0093][0094][0095]
pcr反应程序为：
[0096][0097]
对pcr获得的油菜转基因阳性苗进行qrt
‑
pcr，以检测基因表达量。利用transzol试剂盒提取转化单株种子的rna并进行反转录合成cdna(方法同实施例1)，最后用全氏金的perfectstart
tm green qpcr supermix试剂对样品进行荧光定量pcr分析。
[0098]
定量引物利用primer 5软件设计得到，产物大小在100bp
‑
200bp之间，设计好后用参考序列进行blast比对，确保引物rt
‑
bnac06.ntt1b
‑
f(5
’‑
tcctcttgctatcctgagga
‑3’
)、rt
‑
bnac06.ntt1b
‑
r(5
’‑
gagaaaatgagcgcaacgtt
‑3’
)、rt
‑
bnaa07.ntt1a
‑
f(5
’‑
gctttggggtagtgtggttat
‑3’
)和rt
‑
bnaa07.ntt1a
‑
r(5
’‑
attggctccgagtccaaacaa
‑3’
)的特异性。bnactin7
‑
l(5
’‑
cgcgcctagcagcatgaa
‑3’
)和bnactin7
‑
r(5
’‑
gttggaaagtgctgagagatgca
‑3’
)作为油菜qrt
‑
pcr的内参引物。qrt
‑
pcr反应体系为:
[0099][0100]
qrt
‑
pcr反应程序为：
[0101][0102][0103]
qrt
‑
pcr反应在bio
‑
rad cfx96 real
‑
time system中进行。
[0104]
根据内参引物进行标准化，不同重复间定量变异用delta
‑
deltathreshold cycle relative quantification(2
‑
δδct)的方法计算。最后分析选择油菜过表bnac06.ntt1b的两个单株oe13和oe14和过表达bnaa07.ntt1a的两个单株oe22和oe23进行进一步分析(图
3)。
[0105]
(3)crispr转化单株的鉴定
[0106]
对获得的油菜crispr转化单株进行测序筛选油菜突变体。首先利用引物cas9
‑
f(5
’‑
cgcacaatcccactatcct
‑3’
)和cas9
‑
r(5
’‑
ccaggtcatcgtcgtatgtg
‑3’
)鉴定cas9蛋白，对于cas9蛋白阳性单株进行目的基因的特异扩增以及测序鉴定。目的基因的特异扩增的方法为：分别用引物ntt1b
‑
c6
‑
f(5
’‑
atggcaaccgtgatacaaac
‑3’
)和ntt1b
‑
c6
‑
r(5
’‑
ggcttcatccacagttgttatc
‑3’
)特异扩增bnac06.ntt1b；ntt1a
‑
a7
‑
f(5
’‑
atggaagcggcgatacaaac
‑3’
)和ntt1a
‑
a7
‑
r(5
’‑
caagagcctccggg
‑3’
)特异扩增bnaa07.ntt1a。扩增方法同实施例4(2)所示。
[0107]
对扩增的目的片段进行pcr产物测序，分析靶位点的编辑情况。测序结果显示，获得了bnac06.ntt1b和bnaa07.ntt1a同时被编辑的双突变体株系m55和m56，编辑造成了靶点处不同程度的碱基插入和缺失(图4)。
[0108]
(4)遗传转化所得转基因植株的含油量分析
[0109]
采用气相色谱
‑
火焰离子化检测器法测定油菜种子含油量：
[0110]
a.称取4粒形状大小一致的油菜成熟种子，保证总质量在15mg
‑
18mg范围内，记录下称取的质量，每株材料进行5个重复。
[0111]
b.将称取好对油菜种子放入干净的提脂管中，加入4.5ml甲醇提取液(95％甲醇，5％浓硫酸，0.01％bht)。
[0112]
c.利用玻璃棒研破提脂管中种子的种皮并使种子露出胚。
[0113]
d.用玻璃针(100μl)量取配好的十七烷酸100μl(c17：0，16.2μmol/ml，分子量270.45)于提脂管中，用力旋紧管盖，上下颠倒混匀。
[0114]
e.将提脂管置于85℃水浴锅中，水浴2h，让其充分反应。
[0115]
f.2h后，将提脂管拿出并冷却至室温，之后加入3ml的ddh2o和3ml的正己烷，注意要缓慢加液防止液体溅出，涡旋混匀。
[0116]
g.1000r/min 25℃离心10min，用胶头滴管吸取1ml左右的上清液于进样瓶中，用于之后的gc
‑
ms分析，暂时不用可放置
‑
20℃冰箱储存。
[0117]
(以上提取脂肪酸过程用的有机试剂均是色谱纯级别。)
[0118]
h.设置高效气相色谱气质联用分析仪(gc
‑
ms)参数：将分流比设成10：1，选择rtx
‑
wax(0.25mm
×
30m)色谱柱，设置gc进样口温度为230℃，柱箱初始温度为170℃并保持2min，之后温度以5℃/min的速率上升至230℃保持5min。ms进样口温度设置为230℃，调谐电压为0.2kv。之后gc
‑
ms自动进样进行分析。
[0119]
i.利用gc
‑
ms的峰图结果对物质进行定性分析。利用gc
‑
ms的峰图结果对物质进行定量分析：结合物质的分子量和质量，根据内标计算脂肪酸组成和含油率。
[0120]
含油量结果显示，与wt(39.25
±
0.51)相比，bnac06.ntt1b基因的过表达材料含油量分别为oe13(42.97
±
0.33)和oe14(41.77
±
0.26)，显著上升2.5
‑
3.7个百分点(图5a)；bnaa07.ntt1a基因的过表达材料含油量分别为oe22(41.96
±
0.37)和oe23(42.80
±
0.85)，显著上升2.7
‑
3.5个百分点(图5a)；而突变体材料的含油量分别为m55(36.44
±
0.33)和m56(37.56
±
0.55)，显著下降1.7
‑
2.8个百分点(图5a)。另外，脂肪酸组成结果显示，与wt相比，过表达材料的c16:0、c18:0、c18:1、c18:2和c18:3含量均显著增加(图5b)。
[0121]
这些结果表明，bnac06.ntt1b和bnaa07.ntt1a在调控甘蓝型油菜种子含油量和脂肪酸组成中确实发挥着重要作用。