饲料缓冲剂、制备方法和应用以及应用其的饲料与流程

1.本发明涉及饲料添加剂技术领域，尤其是涉及一种饲料缓冲剂、制备方法和应用以及应用其的饲料。


背景技术：

2.泌乳是一个复杂的过程，泌乳动物在产奶过程中的主要代谢特征是高能量需求。目前，我国由于耕地缺乏和草场不足，造成粗料缺乏或品质不好。因此，生产上通常通过添加高精料饲料来满足泌乳期奶牛或奶山羊对高能量的需要，但研究已经证实，当给泌乳奶牛或奶山羊长期饲喂高精料时，会造成瘤胃ph下降，继而导致亚急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，sara)以及脂多糖(lipopolysaccharides，lps)等异常产物的过度释放，超出了肠道脱毒能力并移位至血液，引起机体的炎症反应，同时造成肝脏代谢紊乱，影响乳腺中乳成分的合成和含量，最终导致乳品质下降。也就是说sara时，瘤胃ph值下降、异常产物lps等过多释放是导致高精料长期饲喂致乳品质下降的关键环节。因此，控制反刍动物sara，改善瘤胃酸碱度，可能是缓解高精料长期饲喂致乳品质下降的途径之一。目前，sara是奶农极为关注的一个问题，因为它与各种疾病的发生有关，如乳腺炎、乳脂抑制、蹄叶炎、肝脏脓肿甚至死亡等。高精料所带来的危害已严重影响到奶业的健康发展，而如何调控这种负面作用就显得尤为重要。
3.缓冲剂常用来防止反刍动物瘤胃酸中毒。缓冲剂不仅可以改善反刍动物在采食高精料日粮时所造成的乳脂率下降，也可以提高反刍动物的生产性能。因此，近年来向日粮中添加缓冲剂已经成为提高动物生产性能的重要措施。目前，国内外常用于反刍动物的缓冲剂有碳酸氢钠、乙酸钠、丁酸钠、氧化镁、碳酸钙等。对单一缓冲剂的研究较多，而两种或两种以上复合缓冲剂对反刍动物的综合调控方面的研究报道不多。
4.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种饲料缓冲剂，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
6.本发明的第二个目的在于提供上述饲料缓冲剂的制备方法，该方法工艺简单、操作方便，能够节约大量的人力物力，降低成本，且制备得到的饲料缓冲剂具有良好的改善反刍动物瘤胃酸中毒的效果。
7.本发明的第三个目的在于提供上述饲料缓冲剂在制备预防和/或治疗反刍动物瘤胃酸中毒的产品中的应用。
8.本发明的第四个目的在于提供一种饲料，该饲料能够有效改善泌乳动物泌乳性能，同时预防和/或治疗反刍动物瘤胃酸中毒。
9.本发明提供了一种饲料缓冲剂，所述饲料缓冲剂主要由以下组分组成：
10.碳酸氢钠、氧化镁、乙酸钠和丁酸钠。
11.进一步地，所述饲料缓冲剂主要由以下重量份的组分组成：
12.碳酸氢钠1-10份、氧化镁1-10份、乙酸钠5-15份和丁酸钠5-15份。
13.进一步地，所述饲料缓冲剂主要由以下重量份的组分组成：
14.碳酸氢钠2-8份、氧化镁2-8份、乙酸钠8-12份和丁酸钠8-12份。
15.进一步地，所述饲料缓冲剂主要由以下重量份的组分组成：
16.碳酸氢钠6份、氧化镁6份、乙酸钠10份和丁酸钠10份。
17.本发明还提供了上述的饲料缓冲剂的制备方法，将配方重量份的碳酸氢钠、氧化镁、乙酸钠和丁酸钠混合均匀，得到所述饲料缓冲剂。
18.本发明还提供了上述的饲料缓冲剂或采用上述的制备方法制备得到的饲料缓冲剂在制备预防和/或治疗反刍动物瘤胃酸中毒的产品中的应用。
19.进一步地，所述产品为饲料。
20.另外，本发明还提供了一种饲料，所述饲料包括基础饲料和上述的饲料缓冲剂或采用上述的制备方法制备得到的饲料缓冲剂。
21.进一步地，所述基础饲料包括粗饲料和/或精饲料；
22.优选地，所述基础饲料包括精饲料。
23.进一步地，所述基础饲料和饲料缓冲剂的质量比为25-35∶1，优选为31∶1。
24.本发明提供的饲料缓冲剂，主要由碳酸氢钠、氧化镁、乙酸钠和丁酸钠组成，其中，碳酸氢钠可以对瘤胃起到酸碱缓冲的效果，维持理想的瘤胃发酵环境；氧化镁可以维持胃肠道内有益生物菌群，增加肠道有益菌的数量；乙酸钠能增加瘤胃中乙酸浓度，提高乳脂率；丁酸钠可以增加反刍动物食欲。本发明提供的饲料缓冲剂通过上述特定组分的配合，不仅能够对反刍动物瘤胃酸中毒起到一定的预防和缓解作用、维持反刍动物肠道内有益菌群的数量，改善机体的健康状态，还可以改善泌乳动物的泌乳性能，改善乳品质，提高乳脂肪、乳糖及乳产量含量，同时还能够增强对乳腺的保护作用。
25.本发明提供的上述饲料缓冲剂的制备方法，将配方量的各组分混合均匀即可，该方法工艺简单、操作方便，能够节约大量的人力物力，降低成本，且制备得到的饲料缓冲剂具有良好的改善反刍动物瘤胃酸中毒及改善泌乳性能的效果。
26.本发明提供的饲料，包括基础饲料和本发明提供的饲料缓冲剂，该饲料在保证营养供应的基础上，能够有效改善泌乳动物泌乳性能，同时预防和/或治疗反刍动物瘤胃酸中毒。在饲料中补充适量的饲料缓冲剂是一种有益的饲喂方式。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊乳产量的影响的结果图；
29.图2为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊乳脂肪含量的影响的结果图；
30.图3为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊乳糖含量的影响的结果图；
31.图4为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊瘤胃ph的影响的结果图；
32.图5a为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊瘤胃lps含量的影响的结果图；
33.图5b为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊血液lps含量的影响的结果图；
34.图6a为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊乳腺凋亡蛋白caspase-3的影响的结果图；
35.图6b为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊乳腺凋亡蛋白caspase-9的影响的结果图；
36.图6c为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊乳腺凋亡蛋白bax的影响的结果图；
37.图6d为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊乳腺凋亡蛋白bcl-2的影响的结果图；
38.图7a为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊血液乳酸含量检测结果图；
39.图7b为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊血液组胺含量检测结果图；
40.图7c为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊血液炎症细胞因子tnf-α含量检测结果图；
41.图7d为本发明实验例提供的饲料缓冲剂对泌乳山羊血液炎症细胞因子il-1β含量检测结果图。
具体实施方式
42.下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.需要说明的是：
44.本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优10选实施方法可以相互组合形成新的技术方案。
45.本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案。
46.本发明中，如果没有特别的说明，百分数(％)或者份指的是相对于组合物的重量百分数或重量份。
47.本发明中，如果没有特别的说明，所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
48.本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。例如数值范围“3～30”表示本文中已经全部列出了“3～30”之间的全部实数，“3～30”只是这些数20值组合的缩略表示。
49.本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。
50.本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以按照顺序进行。优选地，本文中的反应方法是顺序进行的。
51.除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
52.高精料长期饲喂可以导致泌乳反刍动物乳产量、乳脂肪及乳糖含量下降，还可诱发泌乳反刍动物机体健康受损，出现sara，瘤胃及血液lps等代谢异常产物升高。基于此，根据本发明的一个方面，提供了一种饲料缓冲剂，所述饲料缓冲剂主要由以下组分组成：
53.碳酸氢钠、氧化镁、乙酸钠和丁酸钠。
54.其中，碳酸氢钠是一种酸式盐，其溶于水时呈现弱碱性，因此可以对瘤胃起到酸碱缓冲的效果，使ph(6-7)值保持相对稳定状态，维持理想的瘤胃发酵环境。在本发明中优选使用食品级碳酸氢钙。
55.氧化镁可以维持胃肠道内有益生物菌群，增加肠道有益菌的数量，不仅对机体起到增强免疫的作用也可以及时补充日粮中镁元素的不足。在本发明中优选使用食品级氧化镁。
56.乙酸钠能增加瘤胃中乙酸浓度，乙酸作为脂质合成的前体物，添加到反刍动物饲料中可以提高乳脂率。在本发明中优选使用食品级乙酸钠。
57.丁酸钠可以增加反刍动物食欲，也对机体健康其一定的保护作用，并且可以改变血液中丁酸含量，增强乳腺抗氧化应激能力，并且减少细胞凋亡，进一步增强对乳腺的保护作用。在本发明中优选使用食品级丁酸钠。
58.本发明提供的饲料缓冲剂通过上述特定组分的配合，不仅能够对反刍动物瘤胃酸中毒起到一定的预防和缓解作用、维持反刍动物肠道内有益菌群的数量，改善机体的健康状态，还可以改善泌乳动物的泌乳性能，改善乳品质，提高乳脂肪、乳糖及乳产量含量，同时还能够增强对乳腺的保护作用。
59.在一些优选的实施方式中，所述饲料缓冲剂主要由以下重量份的组分组成：
60.碳酸氢钠1-10份、氧化镁1-10份、乙酸钠5-15份和丁酸钠5-15份。
61.其中，碳酸氢钠例如可以为，但不限于1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或10份；氧化镁例如可以为，但不限于1份、2份、3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份或10份；乙酸钠例如可以为，但不限于5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份或15份；丁酸钠例如可以为，但不限于5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份或15份。
62.通过对各特定组分进行特定配比的限定，得到的饲料缓冲剂具有更好的改善反刍动物瘤胃酸中毒及改善泌乳性能的效果。
63.在一些更优选的实施方式中，所述饲料缓冲剂主要由以下重量份的组分组成：
64.碳酸氢钠2-8份、氧化镁2-8份、乙酸钠8-12份和丁酸钠8-12份。
65.在一些进一步优选的实施方式中，所述饲料缓冲剂主要由以下重量份的组分组成：
66.碳酸氢钠6份、氧化镁6份、乙酸钠10份和丁酸钠10份。
67.通过对饲料缓冲剂各组分配比的进一步调整和优化，使得本发明提供的饲料缓冲剂具有更好的改善反刍动物瘤胃酸中毒及改善泌乳性能的效果。
68.根据本发明的第二个方面，还提供了上述的饲料缓冲剂的制备方法，将配方重量份的碳酸氢钠、氧化镁、乙酸钠和丁酸钠混合均匀，得到所述饲料缓冲剂。
69.本发明提供的上述饲料缓冲剂的制备方法，该方法工艺简单、操作方便，能够节约
大量的人力物力，降低成本，且制备得到的饲料缓冲剂具有良好的改善反刍动物瘤胃酸中毒及改善泌乳性能的效果。
70.根据本发明的第三个方面，还提供了上述的饲料缓冲剂或采用上述的制备方法制备得到的饲料缓冲剂在制备预防和/或治疗反刍动物瘤胃酸中毒的产品中的应用。
71.由于本发明提供的饲料缓冲剂能够对瘤胃起到酸碱缓冲的效果，维持理想的瘤胃发酵环境，因此，应用本发明提供的饲料缓冲剂可以制备用于预防和/或治疗反刍动物瘤胃酸中毒的产品。
72.其中，产品例如可以为，但不限于饲料、药品或保健品等。
73.可以理解的是“预防和/或治疗”指的是该产品具有预防作用、或者具有治疗作用、或者兼具预防和质量的作用。
74.在预防性应用中，可以以相对低频率的间隔长期给予相对低的剂量。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量，直至疾病的进展被延缓或停止，优选直至个体表现出疾病症状的部分或完全改善，在此之后，可以给予预防方案。
75.在一些优选的实施方式中，所述产品为饲料。
76.根据本发明的第四个方面，还提供了一种饲料，所述饲料包括基础饲料和上述的饲料缓冲剂或采用上述的制备方法制备得到的饲料缓冲剂。
77.该饲料在保证营养供应的基础上，能够有效改善泌乳动物泌乳性能，同时预防和/或治疗反刍动物瘤胃酸中毒。在饲料中补充适量的饲料缓冲剂是一种有益的饲喂方式。
78.在一些优选的实施方式中，所述基础饲料包括粗饲料和/或精饲料。
79.粗饲料是指在饲料中天然水分含量在60％以下，干物质中粗纤维含量等于或高于18％，并以风干物形式饲喂的饲料，如牧草、农作物秸秆、酒糟等。精饲料又称精料，是相对于粗饲料而言的，单位体积或单位重量内含营养成分丰富，粗纤维含量低，可消化养分含量多的一类饲料，主要包括农作物的子实(谷物、豆类及油料作物的子实)及其加工的副产品。
80.优选地，所述基础饲料包括精饲料。
81.通过添加精料饲料来满足泌乳期奶牛或奶山羊对高能量的需要时，造成瘤胃ph下降，继而导致亚急性瘤胃酸中毒的风险更高，因此，在精饲料中添加饲料缓冲剂能够起到更好的预防和治疗效果。
82.在一些优选的实施方式中，所述基础饲料和饲料缓冲剂的质量比为25-35∶1，例如可以为，但不限于25∶1、26∶1、27∶1、28∶1、29∶1、30∶1、31∶1、32∶1、33∶1、34∶1或35∶1，当基础饲料和饲料缓冲剂的质量比在上述范围内时，混合得到的饲料在保证营养供应的基础上，能够具有良好的改善反刍动物瘤胃酸中毒及改善泌乳性能的效果。
83.优选地，基础饲料和饲料缓冲剂的质量比为31∶1。
84.通过对基础饲料和饲料缓冲剂的质量比进行进一步的调整和优化，能够使得混合得到的饲料在保证营养供应的基础上，具有更好的改善反刍动物瘤胃酸中毒及改善泌乳性能的效果。
85.下面结合具体实施例和对比例，对本发明作进一步说明。
86.实施例1
87.本实施例提供了一种饲料缓冲剂，主要由如下重量份的组分组成：
88.碳酸氢钠1份、氧化镁10份、乙酸钠5份和丁酸钠15份。
89.实施例2
90.本实施例提供了一种饲料缓冲剂，主要由如下重量份的组分组成：
91.碳酸氢钠10份、氧化镁1份、乙酸钠15份和丁酸钠5份。
92.实施例3
93.本实施例提供了一种饲料缓冲剂，主要由如下重量份的组分组成：
94.碳酸氢钠2份、氧化镁8份、乙酸钠8份和丁酸钠12份。
95.实施例4
96.本实施例提供了一种饲料缓冲剂，主要由如下重量份的组分组成：
97.碳酸氢钠8份、氧化镁2份、乙酸钠12份和丁酸钠8份。
98.实施例5
99.本实施例提供了一种饲料缓冲剂，主要由如下重量份的组分组成：
100.碳酸氢钠6份、氧化镁6份、乙酸钠10份和丁酸钠10份。
101.实施例6
102.本实施例提供了一种饲料缓冲剂，主要由如下重量份的组分组成：
103.碳酸氢钠12份、氧化镁15份、乙酸钠3份和丁酸钠18份。
104.对比例1
105.本对比例提供了一种饲料缓冲剂，主要由如下重量份的组分组成：
106.氧化镁6份、乙酸钠10份和丁酸钠10份。
107.对比例2
108.本对比例提供了一种饲料缓冲剂，主要由如下重量份的组分组成：
109.碳酸氢钠6份、乙酸钠10份和丁酸钠10份。
110.对比例3
111.本实施例提供了一种饲料缓冲剂，主要由如下重量份的组分组成：
112.碳酸氢钠6份、氧化镁6份和丁酸钠10份。
113.对比例4
114.本实施例提供了一种饲料缓冲剂，主要由如下重量份的组分组成：
115.碳酸氢钠6份、氧化镁6份和乙酸钠10份。
116.实验例
117.本实验例所用的12只体重和泌乳期相近的萨能奶山羊(39
±
7kg，mean
±
sem kg，产后2-3周)，健康状况良好，购于西北农林科技大学试验农场，饲养于南京农业大学农业部动物生理生化重点实验室实验动物房。
118.所有动物均在高精料饲喂适应一周后，分别给试验动物安装瘤胃瘘管以及肝脏血液瘘管，手术后试验动物恢复2周。为保持肝脏血管瘘通畅，每隔8h每根瘘管注射肝素钠生理盐水溶液0.3ml(500iu/ml)直到试验结束。
119.恢复期过后，将泌乳山羊随机分成11组，分别为高精料组(high concentrate group，hg)和饲料缓冲剂组1-10(buffering agent group，bg，1-10对应本发明实施例1-6及对比例1-4)，每组6只。两组动物饲喂相同的试验基础日粮，饲喂的精粗日粮质量比均为60∶40，配方见表1。缓冲
120.剂组在基础日粮的基础上添加本发明实施例1-6及对比例1-4提供的饲料缓冲剂。
试验周期为20周，单笼饲养，期间自由饮水。
121.表1试验日粮和营养组成
[0122][0123]
注：a.每千克日粮提供vd 2 500iu、va 6 000iu、ve 80mg、铜6.25mg、铁62.5mg、锌62.5mg、锰50mg、碘0.125mg、钴0.125mg；b.营养水平根据nrc(2001)方法计算。note：a.provided per kg of diet：vitamin a 6,000iu，vitamin d 2,500iu，vitamin e 80mg，cu 6.25mg，fe 62.5mg，zn 62.5mg，mn 50mg，i 0.125mg，co 0.125mg.b nutrient levels were measured according to national research council methods(2001).
[0124]
试验期间每天挤奶2次(时间为：早8：00和晚18：00)。挤出前3把奶弃掉，挤奶结束后称重并记录产奶量。每两周通过瘤胃瘘管采集一次瘤胃液进行ph测定。结果如下表2所示。
[0125]
表2产奶量及瘤胃ph检测
[0126]
组别产奶量瘤胃ph高精料组1.15
±
0.125.70
±
0.12饲料缓冲剂组11.22
±
0.106.18
±
0.13饲料缓冲剂组21.21
±
0.116.16
±
0.16饲料缓冲剂组31.25
±
0.136.26
±
0.13饲料缓冲剂组41.24
±
0.216.25
±
0.11饲料缓冲剂组51.28
±
0.156.40
±
0.14饲料缓冲剂组61.20
±
0.176.13
±
0.10饲料缓冲剂组71.18
±
0.166.14
±
0.12饲料缓冲剂组81.17
±
0.156.11
±
0.17饲料缓冲剂组91.19
±
0.136.13
±
0.13饲料缓冲剂组101.16
±
0.106.12
±
0.11
[0127]
从上述结果中可以看出，本发明实施例1-6提供的饲料缓冲剂，通过各特定组分之间的协同配合，使得本发明提供的饲料缓冲剂具有良好的改善反刍动物瘤胃酸中毒及改善泌乳性能的效果。而对比例1-4提供的饲料缓冲剂，无论在产奶量还是改善瘤胃ph的方面，其效果均不及本发明实施例的水平。
[0128]
其中，实施例1-6提供的饲料缓冲剂，其原料组分完全相同，仅配比不同，但实施例1-5提供的饲料缓冲剂无论在产奶量还是改善瘤胃ph的方面均优于实施例6的水平，说明各组分在本发明优选配比条件下能够使得本发明提供的饲料缓冲剂具有更好的改善反刍动物瘤胃酸中毒及改善泌乳性能的效果。
[0129]
并且，实施例5的效果优于实施例1-4，实施例3和4的效果优于实施例1和2，说明通过对各组分配比进行进一步的调整和优化，能够使得本发明提供的饲料缓冲剂具有更好的改善反刍动物瘤胃酸中毒及改善泌乳性能的效果。
[0130]
实施例5与对比例1-4提供的饲料缓冲剂，其相同组分的配比相同，但对比例1中缺少碳酸氢钠、对比例2中缺少氧化镁、对比例3中缺少乙酸钠、对比例4中缺少丁酸钠，实施例5提供的饲料缓冲剂无论在产奶量还是改善瘤胃ph的方面均优于对比例1-4的水平，说明在相同原料组分的配比相同的情况下，只有通过各原料特定组分之间的协同配合，才能使得本发明提供的饲料缓冲剂具有更好的改善反刍动物瘤胃酸中毒及改善泌乳性能的效果。
[0131]
下面为了节约成本，选择上述效果较优的实施例5作为饲料缓冲剂组与高精料组进行试验。
[0132]
一、乳样采集和乳成分含量测定
[0133]
试验期间每天挤奶2次(时间为：早8：00和晚18：00)。挤出前3把奶弃掉，挤奶结束后称重并记录产奶量。
[0134]
每周测定一次乳脂肪、乳糖含量。送至江苏省南京卫岗乳业检测中心，利用乳成分分析仪检测乳脂肪、乳糖等含量。
[0135]
1、饲料缓冲剂对高精料饲喂泌乳山羊乳产量的影响
[0136]
由图1所示，试验的前2周两组山羊的产奶量基本相近，从第3周开始缓冲剂组泌乳山羊产奶量开始高于高精料组，其中从第8周起乳产量开始显著高于高精料组(1.26
±
0.14vs 1.15
±
0.12，p＜0.05)，一直持续到第15周，至16-19周，缓冲剂组泌乳山羊产奶量也高于高精料组，但差异不显著(p＞0.05)。
[0137]
2、饲料缓冲剂对泌乳山羊乳脂肪含量的影响
[0138]
由图2可知，从第1周到第5周两组山羊乳脂率差异不大，其趋势都是先升高后降低再升高。第6周开始，缓冲剂组乳脂肪含量开始高于高精料组，其中在第10周的时候缓冲剂组的乳脂率达到最高为3.60
±
0.13％，第18周开始缓冲剂组乳脂率开始下降。
[0139]
3、复合缓冲剂对泌乳山羊乳糖含量的影响
[0140]
由图3可知，试验的前3周乳糖含量基本一致。从第4周开始缓冲剂组乳糖含量开始高于高精料组，第6周的时候乳糖含量达到最高，并且显著高于高精料组(3.42
±
0.12vs 2.80
±
0.11，p＜0.05)，第7周至试验结束，缓冲剂组都高于高精料组。
[0141]
二、血液样品采集
[0142]
试验至第19周的最后1d采集颈静脉血。采集的血样快速转入含有肝素钠的抗凝管内，4℃，2500
×
g离心12min，分离血清到ep管中，-20℃保存待测。
[0143]
1、血液生化指标测定
[0144]
取上述采集的颈静脉血样1ml，送至南京市中西医结合医院血液科，利用全自动生化分析仪检测血液生化指标，包括谷丙转氨酶(alanine transaminase，alt)、谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase，ast)、总胆红素(total bilirubin，tb)、碱性磷酸
酶(alkaline phosphatase，akp)、甘油三酯(triglyceride，tg)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，ldh)、超敏c反应蛋白(hypersensitive c-reactive protein，hs-crp)等指标。
[0145]
由表3可知，缓冲剂组泌乳山羊血液中alt、ast、akp含量低于高精料组，且差异显著(p＜0.05)，提示泌乳山羊的肝脏损伤状态得到缓解。而缓冲剂组血液中tb含量显著高于高精料组(p＜0.05)，其他指标两组间均无明显差异。
[0146]
表3复合缓冲剂对泌乳山羊血液相关生化指标的影响(n＝6)
[0147][0148]
2、血液激素指标检测
[0149]
取采集的颈静脉血样，采用胰岛素(ins)、胰高血糖素、皮质醇、胰岛素样生长因子-1elisa检测试剂盒测定相关激素含量，试验步骤按照试剂盒说明书进行。结果如表4所示。通常动物机体在正常情况下，机体内的内分泌激素处于一个正常的生理水平。主要是通过一些特定的器官分泌，通过弥散的方式进入循环血液，在靶组织中发挥作用。从表4可知，复合缓冲剂导致血液中的ins含量升高。ins可以调控机体的糖脂代谢。血液中ins含量的升高，提示可能对机体糖脂代谢的主要器官(肝脏)起到了一定作用。
[0150]
表4复合缓冲剂对泌乳山羊血液激素含量的影响(n＝6)
[0151][0152]
注：与高精料组相比，*表示差异显著(p＜0.05)。
[0153]
note：compared with the high concentrate group，*indicates a significant difference(p＜0.05).
[0154]
3、血液代谢异常产物及炎症因子的测定
[0155]
颈静脉血液中组胺采用elisa方法测定，在450nm波长测定各孔吸光度含量，通过回归方程计算样品浓度，单位以ng/ml表示；乳酸含量采用乳酸脱氢酶法测定，在530nm波长
测定各孔吸光度含量，通过回归方程计算样品浓度，单位以mmol/l表示。操作步骤分别按照相关说明书进行。结果如图7a和图7b所示。
[0156]
颈静脉血液中炎症细胞因子tnf-α、il-1β采用[125i]放射免疫试剂盒进行检测。操作步骤按照说明书进行。结果如图7c和图7d所示，本试验研究发现，高精料日粮会引发泌乳山羊机体sara，瘤胃液中升高的lps通过瘤胃壁进入血液，并且血液中的乳酸和tnf-α含量显著升高，并造成机体出现炎症。添加复合缓冲剂后，未出现sara状态，同时瘤胃释放的lps及血液中的代谢异常产物、炎症因子含量均明显降低。说明复合缓冲剂可以缓解高精料饲喂导致的瘤胃ph值降低以及减少了lps等的释放，改善了机体的健康状态。
[0157]
三、瘤胃液的采集和ph测定
[0158]
1、瘤胃液ph测定
[0159]
每两周通过瘤胃瘘管采集一次瘤胃液进行ph测定。具体方法：从采食前15min开始以及饲喂后0、2、4、6、8、10h采集瘤胃内容物，然后通过消毒好的医用纱布将瘤胃液进行过滤收集。立即测定ph值，每只试验动物连续测量三次。
[0160]
通过检测2-18周采食后0、2、4、6、8、10h瘤胃液的平均ph值，结果由图4可知，瘤胃ph值变化总趋势都是先降低后升高。即采食后，ph值呈下降趋势，4h后ph值下降至最低值(5.65
±
0.03)，随后由于瘤胃本身具有较强的缓冲能力，ph值又逐渐上升至初始水平。但缓冲剂组泌乳山羊瘤胃液ph值均高于高精料组(6.0
±
0.10vs 5.8
±
0.08)。
[0161]
以每日瘤胃ph值低于5.8的时间不少于4h为sara来看，高精料组泌乳山羊在采食2h后开始出现sara现象。而添加复合缓冲剂后，缓解了高精料所致的瘤胃ph值的下降，使瘤胃液的ph值得到了稳定。
[0162]
2、瘤胃内容物及血液中lps含量的测定
[0163]
将瘤胃液及血液样品用试剂盒中的样品稀释液稀释5倍后，按lps酶联免疫检测试剂盒说明书加样，在450nm波长处依次测定各孔的吸光度值(od)，以空白孔调零为基准，利用标准曲线方程求出瘤胃液及血液中lps的含量(活性单位为eu/ml)。lps标准曲线方程：y＝1445.5x-92.211，r2＝0.9995(y表示浓度，x表示od值)。
[0164]
通过检测两组泌乳山羊瘤胃液及血液中lps的含量，结果由图5a和图5b可知，缓冲剂组瘤胃中lps(26201.41
±
2398.18vs 40395.43
±
4723.14，p＜0.01)含量极显著低于高精料组，血液中的lps(2.01
±
0.24vs 3.62
±
0.50，p＜0.05)含量显著低于高精料组。提示，通过添加复合缓冲剂稳定了泌乳山羊瘤胃ph水平，减少了瘤胃中异常产物lps的产生。
[0165]
3、瘤胃液以及血液中挥发性脂肪酸(vfa)含量的测定
[0166]
瘤胃液处理：取1ml瘤胃液至ep管中，加入25％偏磷酸混合溶液(内含0.2ml巴豆酸)，充分混匀，于-20℃保存过夜，然后室温放置解冻，在4℃，12 000
×
g离心10min，取上清液经针式滤器(0.22μm)过滤。
[0167]
血液处理：取200μl血浆至ep管中，加入200μl含巴豆酸的5％磺基水杨酸混合液(沉淀蛋白)充分混匀，于-20℃保存过夜，在4℃，12 000
×
g离心30min，取上清液经针式滤器过滤后待测。结果如表5和表6所示，本研究发现，添加复合缓冲剂不仅改善了精料比例过大而造成的瘤胃ph的下降，同时瘤胃及血液中vfa的含量和比例也发生了改变。其中瘤胃中总vfa有上升的趋势，丙酸和丁酸含量显著升高，但是瘤胃ph却并没有因此下降，其主要原因一方面是碳酸氢钠的缓冲作用，另一方面是因为乙酸、丁酸等是弱酸，缓冲剂乙酸钠、丁
酸钠进入瘤胃以后，会结合瘤胃中的氢离子形成弱酸，从而抑制了ph值的下降。而经过瘤胃上皮的吸收，血液中丁酸的含量也显著升高。本试验中血液丁酸浓度的升高。可能是由于饲料中添加了丁酸钠所致。丁酸作为丁酸钠的主要成分，目前在胃肠道健康及抗炎方面的作用越来越重要，其可以缓解高精料饲喂造成的肝细胞的损伤。因此，血液中升高的丁酸，可能对保护机体的健康发挥了一定作用。
[0168]
表5复合缓冲剂对泌乳山羊瘤胃vfa的影响(n＝6)
[0169][0170]
注：与高精料组相比，*表示差异显著(p＜0.05)。
[0171]
note：compared with the high concentrate group，*indicates a significant difference(p＜0.05).
[0172]
表6复合缓冲剂对泌乳山羊血液vfa的影响(n＝6)
[0173][0174]
注：与高精料组相比，*表示差异显著(p＜0.05)。
[0175]
note：compared with the high concentrate group，*indicates a significant difference(p＜0.05).
[0176]
四、乳腺氧化应激指标及组织凋亡相关蛋白的测定
[0177]
1、本试验测定抗氧化应激指标包括谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，gsh-px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)、过氧化氢酶(catalase，cat)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，t-aoc)及氧化应激指标丙二醛(malondialdehyde，mda)。各种指标测定均采用酶联免疫法法进行。试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
[0178]
由表7所示，缓冲剂组泌乳山羊乳腺抗氧化应激指标sod、cat以及t-aoc都高于高精料组，其中cat和t-aoc显著高于高精料组(p＜0.05)。而氧化应激指标mda显著低于高精
料组(p＜0.05)；缓冲剂组gsh-px低于高精料组，但无显著差异(p＞0.05)。提示，添加复合缓冲剂改善了泌乳山羊因高精料饲喂所诱导的乳腺氧化应激状态。
[0179]
表7复合缓冲剂对泌乳山羊乳腺氧化应激指标的影响(n＝6)
[0180][0181]
注：与高精料组相比，*表示差异显著(p＜0.05)。
[0182]
2、乳腺组织凋亡相关蛋白的western blot检测
[0183]
其中caspase-3、caspase-9、bcl-2一抗抗体按1∶1000倍稀释；bax一抗抗体按1∶2000倍稀释；内参gapdh按1∶5000倍稀释。
[0184]
(1)蛋白样品提取
[0185]
提前配制预冷的ripa裂解液(内含浓度为1mmol/l的pmsf)，取80mg左右的肝脏，冰上匀浆5min左右；静置30min后放入高速离心机，4℃，12000
×
g离心20min取上清。采用总蛋白定量法对蛋白浓度进行测定，步骤严格按照说明书进行。将蛋白浓度调整为同浓度后，分装于ep管内，-80℃冰箱保存待用。
[0186]
(2)sds-page电泳及湿转
[0187]
配置分离胶(10％)和浓缩胶(5％)。取变性处理后蛋白60μg进行上样，蛋白标准品maker上样量4μl，80v恒压冰浴电泳30min，然后更换至110v恒压直至冰浴电泳结束。
[0188]
截取目的蛋白相应位置的凝胶，根据凝胶的大小裁剪pvdf膜。裁剪好的pvdf膜用甲醇活化10-20s，然后将凝胶、滤纸、pvdf膜放入转印液中浸泡10min。从正极到负极分别为：滤纸、pvdf膜、凝胶、滤纸，用100v恒压湿转转印1.5h。
[0189]
(3)封闭和抗体孵育
[0190]
封闭：取下转印好的pvdf膜，在摇床上用脱脂奶粉(5％)封闭液室温封闭蛋白，时间2h。
[0191]
抗体孵育：封闭结束后，弃去封闭液。以1∶1000倍稀释兔抗一抗抗体，1∶5000倍稀释gapdh，4℃孵育过夜。一抗孵育完成后，将一抗轻轻吸出，用tbst洗膜5次，每次10min。然后加入用tbst以1∶10000倍稀释hrp标记的羊抗兔二抗，室温孵育2h。二抗孵育结束后，重复上述洗膜过程。
[0192]
(4)显色和分析
[0193]
将膜用滤纸吸干以后，快速加入ecl发光液，避光5min后，用全自动化学发光图像分析系统进行显影，并观察各组条带的灰度值。用image j软件分析条带灰度值，计算各目的蛋白的相对表达量。
[0194]
结果由图6a、图6b、图6c和图6d所示，添加复合缓冲剂后泌乳山羊乳腺中caspase-3(0.65
±
0.05vs 1.00
±
0.25)以及bax(0.74
±
0.08vs 1.00
±
0.22)蛋白表达显著下调(p
＜0.05)；而抗凋亡蛋白bcl-2(1.52
±
0.18vs 1.00
±
0.11)表达水平显著上调(p＜0.05)。结合氧化应激指标结果提示，高精料饲喂诱导了泌乳山羊的乳腺的氧化应激，造成了乳腺的凋亡损伤。而添加复合缓冲剂可以改善泌乳山羊高精料饲喂所诱导的乳腺的应激或凋亡损伤。
[0195]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。