花生遗传群体的构建方法与流程

1.本发明属于遗传群体构建技术领域，具体涉及一种花生遗传群体的构建方法。


背景技术：

2.有性杂交是作物育种的重要途径，也是遗传群体构建必不可少的方法。对于自花授粉作物，人工杂交需要经过母本去雄及人工授粉两个阶段。在花生杂交过程中，需要在杂交之前以及杂交之后摘除没有授粉花朵以避免非杂交果针的混杂。但在实际操作过程中，母本雄蕊去除不彻底以及摘花遗漏等原因均会导致收获的杂交果中存在一定比例的假杂种。因此，筛选真杂种、剔除假杂种便成为杂交果收获后的重要工作。长期以来，育种工作者都是通过观察f1的表型以及在f2代是否发生性状分离来筛选真杂种，但这样筛选的前提是两个杂交亲本需要存在明显的容易识别的性状差异，且这些差异性状要在f2发生分离。如果某性状由2对以上基因决定，f2群体的分离比例需要达到一定的数量才能够显现。而且很多性状诸如含油量、脂肪酸含量、抗病性、抗逆性等的表型检测工作既繁重又不准确。随着分子生物技术的飞速发展，利用分子标记筛选杂交种逐渐成为鉴定真杂种的有效方法。如利用ssr标记、ahmite标记、caps标记、kasp标记以及snp标记鉴定真杂种在花生中均有报道。利用这些方法首先需要对杂交亲本进行多态性筛选，而生产上广泛选用的杂交亲本之间均存在亲缘关系较近且多态性低的现状，使得筛选工作繁琐且效率低下。


技术实现要素：

3.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种花生遗传群体的构建方法。
4.为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
5.一种花生遗传群体的构建方法，步骤如下：
6.(1)采用目标性状差异明显且能够稳定遗传的两亲本花生进行杂交，收获杂交荚果f1代，两亲本花生除目标性状外还存在非目标性状的fad2基因型差异；
7.(2)切取f1代籽仁远胚端一侧子叶，用于基因组dna的提取，带切口籽仁用石蜡涂抹切口封闭；
8.(3)提取所切取子叶的dna，设计特异性引物，采用竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr,kasp)检测fad2的基因型，筛选fad2的基因型为杂合的籽仁，剔除fad2的基因型为纯合的籽仁；
9.(4)将步骤(3)筛选获得的杂合f1单粒播种于田间，待成熟后按单株编号收获f2代；
10.(5)观察检测f2代目标表型是否发生分离，对于f2代表型分离不明显的株系，取其对应f2株系的叶片，提取dna，采用竞争性等位基因特异性pcr(kasp)检测其fad2的基因型，淘汰fad2的基因型为纯合的株系；
11.(6)经二次筛选获得的f2代籽粒进行单粒播种，随后按单粒传法连续自交5～6代构建重组近交系(recombinant inbred line,ril)遗传群体，或者通过回交构建近等基因
系(near isogenic lines，nil)遗传群体。
12.所述存在fad2基因型差异为两亲本花生含有ahfad2a/2a和ahfad2b/2b中至少一个基因型差异。
13.所述特异性引物是根据ahfad2a/2a位点(ahfad2基因第448位)碱基g/asnp差异，分别针对野生型位点与突变位点设计差异引物fad2a
‑
wt、fad2a
‑
m，以及通用反向引物fad2a
‑
r；根据ahfad2b/2b位点(ahfad2基因第442位)a碱基的缺失/插入差异，分别针对野生型位点与突变位点设计差异引物fad2b
‑
wt、fad2b
‑
m，以及通用反向引物fad2b
‑
r。引物序列见表1，野生型位点引物fad2a
‑
wt和fad2b
‑
wt的5'端加尾序列均使用fam荧光标记；突变位点引物fad2a
‑
m和fad2b
‑
m的5'端加尾序列均使用hex荧光标记。
14.一种针对花生含油量表型的重组近交系遗传群体的构建方法，步骤如下：
15.(1)采用花生含油量性状差异明显的两亲本花生进行杂交，收获杂交荚果f1代，两亲本花生除目标性状外还存在非目标性状的fad2基因型差异；
16.(2)切取f1代籽仁远胚端一侧子叶，用于基因组dna的提取，带切口籽仁用石蜡涂抹切口封闭；
17.(3)提取所切取子叶的dna，设计特异性引物，采用竞争性等位基因特异性pcr(kasp)检测fad2的基因型，筛选fad2的基因型为杂合的籽仁，剔除fad2的基因型为纯合的籽仁；
18.(4)将步骤(3)筛选获得的杂合f1单粒播种于田间，待成熟后按单株编号收获f2代；
19.(5)观察检测f2代目标表型是否发生分离，对于f2代表型分离不明显的株系，取其对应f2株系的叶片，提取dna，采用竞争性等位基因特异性pcr检测其fad2的基因型，淘汰fad2的基因型为纯合的株系；
20.(6)经二次筛选获得的f2代籽粒进行单粒播种，随后按单粒传法连续自交5～6代构建针对花生含油量表型的重组近交系遗传群体。
21.在一个具体实施例中，所述花生亲本为高油亲本宇花14号和低油亲本spi098。
22.一种针对花生荚果长表型的重组近交系遗传群体的构建方法，步骤如下：
23.(1)采用花生荚果长性状差异明显的两亲本花生进行杂交，收获杂交荚果f1代，两亲本花生除目标性状外还存在非目标性状的fad2基因型差异；
24.(2)切取f1代籽仁远胚端一侧子叶，用于基因组dna的提取，带切口籽仁用石蜡涂抹切口封闭；
25.(3)提取所切取子叶的dna，设计特异性引物，采用竞争性等位基因特异性pcr(kasp)检测fad2的基因型，筛选fad2的基因型为杂合的籽仁，剔除fad2的基因型为纯合的籽仁；
26.(4)将步骤(3)筛选获得的杂合f1单粒播种于田间，待成熟后按单株编号收获f2代；
27.(5)观察检测f2代目标表型是否发生分离，对于f2代表型分离不明显的株系，取其对应f2株系的叶片，提取dna，采用竞争性等位基因特异性pcr(kasp)检测其fad2的基因型，淘汰fad2的基因型为纯合的株系；
28.(6)经二次筛选获得的f2代籽粒进行单粒播种，随后按单粒传法连续自交5～6代构建针对花生荚果长表型的重组近交系遗传群体。
29.在一个具体实施例中，所述花生亲本为大果品种鲁花11和小果品系bc54。
30.本发明技术方案的优点：
31.其中高油酸分子标记ahfad2a/2a和ahfad2b/2b是花生中应用最广泛的snp标记。ahfad2a基因编码区448nt处碱基g突变为a(ahfad2a)，导致编码氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺，ahfad2a酶活性大幅降低；同时ahfad2b基因编码区442nt处插入1个a碱基(ahfad2b)，导致编码蛋白提前终止，从而导致ahfad2b酶活性丧失。未经改良的花生种质资源及品种中，均不含有ahfad2b位点，极少部分含有ahfad2a位点。因此利用目前普遍存在的非高油酸材料(aabb)与已选育出的高油酸材料(aabb)进行杂交，可在f1代利用ahfad2a/2b位点进行真杂种鉴定和选择，能简单高效地筛选出真杂种，构建目标性状有效分离群体。
附图说明
32.图1高油亲本宇花14在ahfad2a/2b两基因位点处序列及基因型；
33.图2低油亲本spi098和小果亲本bc54在ahfad2a/2b两基因位点处序列及基因型；
34.图3是高油亲本宇花14和低油亲本spi098的含油量(％)表型差异；
35.图4是宇花14与spi098杂交后收获的f1籽仁在ahfad2a/2b两基因位点处kasp检测结果(其中aabb为杂交成功获得的真杂种，aabb为杂交失败收获的母本自交种)；
36.图5是f1自交后收获的f2籽粒在ahfad2b基因位点处kasp检测结果(存在bb，bb，bb三种基因型属真杂种后代(左)；只有bb基因型属假杂种后代(右)；
37.图6为ril群体(宇花14
×
spi098)的含油量(％)表型鉴定结果；
38.图7为大果亲本鲁花11在ahfad2a/2b两基因位点处序列及基因型；
39.图8是大果亲本鲁花11和小果亲本bc54的荚果长度(mm)表型差异；
40.图9是鲁花11与bc54杂交后收获的f1籽粒在ahfad2b/2b位点处kasp检测结果(其中，bb为杂交成功获得的真杂种，bb为杂交失败收获的母本自交种)；
41.图10是ril群体(鲁花11
×
bc54)荚果长度(mm)表型鉴定结果。
具体实施方式
42.在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
43.下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
44.实施例1
45.亲本：花生高油亲本宇花14号，fad2位点为ahfad2a和ahfad2b(基因型为aabb)；花生低油亲本spi098，fad2位点为ahfad2a和ahfad2b(基因型为aabb)，两者fad2位点的基因型差异如图1和图2所示，宇花14号和spi098的含油量存在显著差异，如图3所示。
46.花生遗传群体的构建方法，步骤如下：
47.1、花生人工授粉杂交
48.田间间隔种植高油亲本宇花14(普通油酸含量)与低油亲本spi098(高油酸含量)。到盛花期来临前一周(播种后约7周)人工去除母本宇花14的花蕾约1周；盛花期每天下午17∶00点后用镊子将母本花蕾中的花药摘除，完成去雄工作；次日上午8∶00之前取父本spi098花粉，涂抹到母本去雄后花蕾的雌蕊柱头上，完成人工杂交授粉工作；杂交工作持续约10天
后，再人工去除花蕾约1周；随后对杂交后着生的果针进行绑绳标记；待荚果成熟后收获标记荚果。
49.2、花生杂交果基因组dna提取
50.待荚果自然干燥后剥出籽仁获得f1，切取远胚端一侧子叶约10mg，放入1.5ml离心管中，用组织研磨仪磨碎后按照北京天根生化科技有限公司的植物基因组dna提取试剂盒说明书，提取基因组dna，溶解于50μl无菌水中，紫外分光光度计和凝胶电泳检测dna的浓度和质量；带切口的籽仁用石蜡涂抹切口封闭，具体是将固体石蜡高温融化后滴到切口处，待其自然凝固。
51.3、引物设计
52.根据ahfad2a/2a位点(ahfad2基因第448位)碱基g/a snp差异，分别针对野生型位点与突变位点设计差异引物fad2a
‑
wt、fad2a
‑
m，以及通用反向引物fad2a
‑
r；根据ahfad2b/2b位点(ahfad2基因第442位)a碱基的缺失/插入差异，分别针对野生型位点与突变位点设计差异引物fad2b
‑
wt、fad2b
‑
m，以及通用反向引物fad2b
‑
r。引物序列见表1，野生型位点引物fad2a
‑
wt和fad2b
‑
wt的5'端加尾序列均使用fam荧光标记；突变位点引物fad2a
‑
m和fad2b
‑
m的5'端加尾序列均使用hex荧光标记。
53.表1 ksap标记所用到的引物序列
[0054][0055]
4、kasp反应
[0056]
kasp反应在lgc snpline xl水浴pcr仪中进行，反应体系为1μl。首先在pcr反应板中加入适量(10～50ng)提取的f1子叶的基因组dna，然后离心、65℃烘干约30min，加入0.5μl master mix，正反向引物各0.013μl(0.2μmol/l)，去离子水补足1μl。pcr反应条件为：94℃预变性15min；扩增的第一轮进行94℃变性20s，68℃退火延伸1min，10个touch down循环(每个循环降低0.6℃)；第二轮进行94℃变性20s，62℃退火延伸1min，26个循环。针对ahfad2a/2a的g/a等位差异的检测，增加了第三轮3个循环的扩增，条件为94℃变性20s、62℃退火延伸1min。数据读取和结果分析使用lgc公司snpviewer软件进行。
[0057]
5、kasp鉴别ahfad2a/2a及ahfad2b/2b基因型差异
[0058]
宇花14杂交后收获的f1籽仁在fad2a和fad2b位点处kasp检测结果如图4所示，野生型ahfad2a位点引物的5'端标记fam荧光，突变型位点引物标记hex荧光，当检测到仅有fam荧光时，第448位为g碱基纯合，基因型为野生型aa；同时存在fam和hex荧光时，为杂合基因型aa。同理，野生型ahfad2b位点引物的5'端标记fam荧光，突变型位点引物标记hex荧光，
当检测到仅有fam荧光时，第442位为a碱基缺失纯合，基因型为野生型bb；同时存在fam和hex荧光时，为杂合基因型bb。
[0059]
6、根据基因型鉴定结果筛选真杂种、剔除假杂种
[0060]
宇花14在ahfad2a和ahfad2b两位点处基因型为aa和bb，spi098为aa和bb。因此，f1真杂种基因型为aabb。根据kasp检测结果筛选出在ahfad2a和ahfad2b基因位点处均表现杂合的样本，获得基因型为aabb的真杂种(图4)。筛选出的真杂种同年在海南进行自交繁殖后按单株收获，获得f2代。
[0061]
7、f2代目标表型鉴定及fad2位点基因型确认
[0062]
真杂种f2代在目标性状及fad2位点均应发生性状分离。测定每个f1单株获得的f2群体中含油量表型，选留含油量存在分离变异的株系。对于含油量分离较小，且均偏向于母本宇花14的株系，取该株系叶片提取dna，利用竞争性等位基因特异性pcr(kasp)检测fad2的基因型，如该群体中存在ahfad2b位点，则为真杂种后代，予以保留；如该群体中不存在ahfad2b位点，则可能来源于f1代分子检测的假阳性，淘汰该株系(图5)。
[0063]
8、利用单粒传法构建ril群体
[0064]
选留二次鉴定后的真杂种后代f2籽粒，单粒播种后单株收获，随后每个单株随机种植2～4粒，收获时随机选留1株，按单粒传法进行自交繁殖连续5～6代，创建重组近交系ril群体。
[0065]
7、ril群体目标性状的检测
[0066]
经自交6代后选育出包含460个家系的ril群体，2020年播种于青岛平度，收获后采用索氏提取法测定每个家系的含油量。结果如图6所示，该群体含油量表型呈连续正态分布。可作为含油量基因定位的有效群体。
[0067]
实施例2
[0068]
亲本：花生大果品种鲁花11，fad2位点为ahfad2a和ahfad2b(基因型为aabb)，花生小果品系bc54为鲁花11与开农1715杂交后，再与母本鲁花11回交4次后获得，fad2位点为ahfad2a和ahfad2b(基因型为aabb)，两者fad2位点的基因型差异如图7和图2所示，鲁花11和bc54的荚果长度存在显著差异，如图8所示。
[0069]
一种花生遗传群体的构建方法，步骤如下：
[0070]
1、花生人工授粉杂交
[0071]
田间间隔种植大果亲本鲁花11(普通油酸含量)与小果亲本鲁花11与开农1715回交后代bc54(高油酸含量)。到盛花期来临前一周(播种后约7周)人工去除母本鲁花11的花蕾约1周；盛花期每天下午17∶00点后用镊子将母本花蕾中的花药摘除，完成去雄工作；次日上午8∶00之前取父本bc54花粉，涂抹到母本去雄后花蕾的雌蕊柱头上，完成人工杂交授粉工作；杂交工作持续约10天后，再人工去除花蕾约1周；随后对杂交后着生的果针进行绑绳标记；待荚果成熟后收获标记荚果。
[0072]
2、花生杂交果基因组dna提取
[0073]
待荚果自然干燥后剥出籽仁获得f1，切取远胚端一侧子叶约10mg，放入1.5ml离心管中，用组织研磨仪磨碎后按照北京天根生化科技有限公司的植物基因组dna提取试剂盒说明书，提取基因组dna，溶解于50μl无菌水中，分光光度计和凝胶电泳检测dna的浓度和质量，带切口的籽仁用石蜡涂抹切口封闭，具体是将固体石蜡高温融化后滴到切口处，待其自
然凝固。
[0074]
3、引物设计
[0075]
根据ahfad2b/2b位点(ahfad2基因442位)a碱基的缺失/插入差异，分别针对野生型位点与突变位点设计差异引物fad2b
‑
wt、fad2b
‑
m，以及通用反向引物fad2b
‑
r。引物序列见表1，野生型位点引物fad2b
‑
wt的5'端加尾序列使用fam荧光标记；突变位点引物fad2b
‑
m的5'端加尾序列使用hex荧光标记。
[0076]
4、kasp反应
[0077]
kasp反应在lgc snpline xl水浴pcr仪中进行，反应体系为1μl。首先在pcr反应板中加入适量(10～50ng)基因组dna，然后离心、65℃烘干约30min，加入0.5μl matser mix，正反向引物各0.013μl(0.2μmol/l)，去离子水补足1μl。pcr反应条件为：94℃预变性15min；扩增的第一轮进行94℃变性20s，68℃退火延伸1min，10个touch down循环(每个循环降低0.6℃)；第二轮进行94℃变性20s，62℃退火延伸1min，26个循环。数据读取和结果分析使用lgc公司snpviewer软件进行。
[0078]
5、kasp鉴别ahfad2b/2b基因型差异
[0079]
野生型ahfad2b位点引物的5'端标记fam荧光，突变型位点引物标记hex荧光，当检测到仅有fam荧光时，第442位为a碱基缺失纯合，基因型为野生型bb；同时存在fam和hex荧光时，为杂合基因型bb(图9)。
[0080]
6、根据基因型鉴定结果筛选真杂种、剔除假杂种
[0081]
鲁花11在ahfad2a和ahfad2b两位点处基因型为aabb，bc54为aabb。因此，f1真杂种基因型为aabb(图9)。根据kasp检测结果筛选出在ahfad2b基因位点处表现杂合的样本，获得基因型为bb的真杂种。筛选出的真杂种同年在海南进行自交繁殖后按单株收获，获得f2代。
[0082]
7、f2代目标表型鉴定及fad2位点基因型确认
[0083]
真杂种f2代在目标性状及fad2位点均应发生性状分离。测定每个f1单株获得的f2群体荚果长度表现型，选留荚果长度存在分离表现的株系。对于荚果长度分离较小，且均偏向于母本鲁花11的株系，取该株系叶片提取dna，利用竞争性等位基因特异性pcr(kasp)检测fad2的基因型，如该群体中ahfad2b位点，则为真杂种后代，予以保留；如该群体中不存在ahfad2b位点，则可能来源于f1代分子检测的假阳性，淘汰该株系。
[0084]
8、利用单粒传法构建ril群体
[0085]
选留二次鉴定后的真杂种后代f2籽粒，单粒播种后单株收获，随后每个单株随机种植2～4粒，收获时随机选留1株，按单粒传法进行自交繁殖连续5～6代，创建重组近交系ril群体。
[0086]
9、ril群体目标性状的检测
[0087]
经自交6代后选育出包含520个家系的ril群体，2020年播种于青岛平度，收获后测定荚果长度。结果如图10所示，该群体荚果长度表型呈连续正态分布。可作为荚果大小基因定位的有效群体。
[0088]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所
作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。