一种体外细胞与3D表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法与流程

一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法
技术领域
1.本发明涉及一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，属于化妆品技术领域。


背景技术：

2.过敏是指人体免疫系统对某些物质如细菌、病毒、花粉、尘螨、皮毛以及药物等排斥，引起人体的异常反应。过敏性物质(即过敏原，也叫变应原)进入人体后，能使某些组织细胞释放出一些活性物质，而这些活性物质能使平滑肌收缩，毛细血管通透性增加，黏膜腺体分泌增多，所以过敏者常出现表皮红肿、瘙痒、斑块或喉部、支气管、胃肠痉挛等症状。过敏反应是指人体对抗原物质接触后的不正常反应。表皮敏感的一般表现是干燥、瘙痒、红肿、色素沉着等。它于正常的免疫反应不同，不但不起保护作用，相反由于反应过度强烈而导致生理功能紊乱和组织损伤。
3.表皮致敏的诱导阶段，朗格汉斯细胞起着呈递和修饰抗原、启动免疫反应的作用。当朗格汉斯细胞捕获抗原后，分化、成熟和迁移至局部淋巴结，将抗原传递给 t细胞，促发t细胞的增值。在这个过程中，朗格汉斯细胞活化成熟，表现为共刺激分子(cd86和cd54)表达上调。细胞表面标志cd86、cd54能够在诱导后的 thp
‑
1细胞中检测到。
4.传统的表皮敏感性预测主要是基于动物实验，包括豚鼠最大值测试、局部封闭涂皮试验以及动物局部淋巴结试验，但一方面由于动物实验成本较高、通量低难以满足化妆品行业飞速发展的需求，另一方面由于动物福利观念的增强和动物实验本身的外推不确定性，基于非动物的体外替代方法越来越多地用于化妆品安全性评价。


技术实现要素：

5.本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，建立体外表皮细胞联合3d表皮共培养致敏模型，将待测物作用于所建立的模型上，筛选能够抑制或促进目标分子表达的物质，结合体外细胞模型和3d表皮模型检测结果，对目标产品的致敏性进行安全评价。
6.实现上述目的的技术方案是：一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，包括以下步骤：
7.步骤s1，thp
‑
1细胞培养和3d表皮培养；
8.步骤s2，thp
‑
1细胞及3d表皮活力检测确定实验样品的检测浓度，包括以下工序：
9.步骤s21，取步骤s1中生长状态稳定的3d表皮模型，加入实验样品，所述实验样品为待测化妆品原液，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养18
‑
24h 后，用mtt检测3d表皮模型的组织存活率；
10.步骤s22，根据步骤s21筛选得到组织存活率大于50％时对应的实验样品的浓度为3d表皮模型给药浓度；
11.步骤s3，细胞铺板及表皮模型联合培养步骤：取步骤s1中对数生长的thp
‑
1 细胞
接种至6孔细胞培养板，分别设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组，空白对照组加入完全培养基，阴性对照组加入乳酸，阳性对照组加入肉桂醛，待测物处理组加入待测物质；同时将3d表皮模型放置在6孔细胞培养板的板内的thp
‑
1细胞上方，放置过程中不要产生气泡；然后将空白对照、阴性对照、阳性对照及待测物质一一对应涂抹在空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组的3d表皮模型上，用量100
‑
200μl，
12.步骤s4，受试物暴露步骤：然后将步骤s3中的6孔细胞培养板转移至37℃、 5％co2、相对湿度95％的co2培养箱内，培养时间18
‑
24h；
13.步骤s5，冲洗步骤：取出6孔细胞培养板，用pbs(磷酸缓冲盐溶液)将3d 表皮模型表面的空白对照、阴性对照、阳性对照及待测物质冲洗掉；
14.步骤s6，mtt组织活性检测步骤，具体包括以下步骤：
15.s61，表皮模型mtt处理步骤：将步骤s5中经过冲洗的3d表皮模型从6孔细胞培养板中取出，取一块24孔细胞培养板，放入200μl的1mg/ml mtt工作液中，将3d表皮模型转移至24孔细胞培养板上，并放入37℃，5％co2，相对湿度95％的co2培养箱内，培养时间2
‑
3h；
16.s62，表皮模型活力检测步骤：取一块新的24孔板，先在孔内加入500
‑
1000μl 异丙醇，将步骤s6处理后的3d表皮模型转移到该24孔板内，放置过程中不要产生气泡，在3d表皮模型内加入500
‑
1000μl异丙醇萃取，用封口膜将24孔板覆盖封住，封一层后，盖上盖子再封一层，将24孔板避光过夜；24孔板取出后在摇床上混匀1
‑
2h；将溶液混匀，酶标板空白孔为异丙醇，甲瓒萃取液200μl/每孔，6个复孔，用酶标仪570nm进行检测；取组织存活率大于50％的3d表皮模型进行后续的细胞致敏性实验测试；
17.步骤s7，体外细胞致敏模型建立步骤，具体包括以下步骤：
18.步骤s71，thp
‑
1细胞收集步骤，将步骤s5中经过冲洗的3d表皮模型从6孔细胞培养板中取出后，将空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组对应的thp
‑
1细胞，从6孔细胞培养板中分别移入对应的1ml ep管中，离心沉淀 thp
‑
1细胞，并用facs缓冲液清洗一次，再次离心收集thp
‑
1细胞；
19.步骤s72，fcr阻断步骤：按thp
‑
1细胞数量配制适宜浓度的fcr阻断剂， 50
‑
100μl体积的一百万个细胞需要2.5μg的fcr阻断剂，随后将离心获得的thp
‑
1 细胞进行阻断；
20.步骤s73，抗体染色步骤：将进行过阻断的thp
‑
1细胞按每管50μl平均分配至4支1ml的ep管中，在4支1ml的ep管一一对应地加入抗体fitc标记的cd86 抗体、pe标记的cd54抗体、fitc标记的小鼠同型对照igg1和pe标记的小鼠同型对照igg1；4℃环境和暗室条件下染色30min；使用facs缓冲液清洗2次，再用500μlfacs缓冲液重悬细胞并转移5ml流式管中待检测；每次实验条件下同时进行7
‑
aad的染色，确定该浓度下细胞活力与相应抗体染色的情况；
21.步骤s74，流式细胞测定步骤：收集分析10000个thp
‑
1细胞，通过无处理的空白对照组的thp
‑
1细胞调节实验fsc vs ssc的实验电压，以确保本批次thp
‑
1 细胞后续实验的计算结果的准确性，得到细胞表面目标分子表达量，建立以目标分子表达量为基准的体外细胞致敏模型；
22.步骤s8，结合体外细胞致敏模型，参照步骤s7的方法对待测物质的致敏性进行评价，以目标分子表达量为基准，计算待测物质引起的目标分子相对表达量的变化，以目标分子相对表达量的变化值表示致敏的强度，目标分子相对表达量的变化值越大，待测物质的
潜在致敏性越强。
23.上述的一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，步骤s1中， thp
‑
1细胞采用rpmi
‑
1640 10％fbs完全培养基培养，所有培养条件均为37
±
0.5℃， (5
±
1)％co2浓度，饱和湿度。
24.上述的一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，步骤s1中， 3d表皮模型为skinethic皮肤模型
25.上述的一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，步骤s3中， thp
‑
1细胞以106个细胞/ml的密度接种至6孔细胞培养板，每孔培养基1ml，每个培养孔设置3个复孔
26.上述的一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，步骤s3中，所述阴性对照组中加入的乳酸为用细胞培养基将乳酸稀释至体积浓度为0.1％的乳酸溶液；所述阳性对照组加入肉桂醛为用细胞培养基将肉桂醛稀释至体积浓度为 0.5％的肉桂醛溶液。
27.上述的一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，步骤s3中，所述待测物质为防晒喷雾、抗老化防晒乳、防晒凝露、物理防晒乳、男士防晒乳、美白防晒喷雾和清透防晒乳。
28.上述的一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，步骤s7中，所述目标分子为细胞表面标记物cd86和细胞表面标记物cd54。
29.本发明的体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，结合细胞模型和3d表皮模型检测结果，将待测物作用于所建立的致敏模型中，筛选能够抑制或促进目标分子表达的活性物质，从而对产品的致敏安全性进行评价，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品的致敏性提供快捷可靠的评价方法，为原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发及功效验证的进一步研究提供有效依据。
附图说明
30.图1为不同受试物作用下的3d表皮活性结果图；
31.图2为不同受试物所引起的细胞表面标记物cd86和cd54的表达量的结果图。
具体实施方式
32.为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
33.实施例中涉及的试剂与耗材如表1所示：
[0034][0035]
表1
[0036]
实施例中受试物及编号如表2所示：
[0037]
编号受试物#1乳酸
#2肉桂醛#3防晒喷雾#4抗老化防晒乳#5防晒凝露#6物理防晒乳#7男士防晒乳#8美白防晒喷雾#9清透防晒乳
[0038]
表2
[0039]
一、溶液配制：
[0040]
1、配制facs缓冲液：将100mg bsa粉末溶解于100ml 1xpbs(磷酸缓冲盐溶液)中，0.22μm滤膜过滤即可。
[0041]
2、fcr阻断剂工作液：向100μl facs缓冲液中加入0.5μl fcr阻断剂抗体即可。
[0042]
3、7
‑
aad工作液：向398μl facs缓冲液中加入2μl 7
‑
aad即可。
[0043]
二、实验过程：
[0044]
本发明的最佳实施例，一种体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，包括以下步骤：
[0045]
步骤s1，thp
‑
1细胞培养和3d表皮培养；
[0046]
(1)thp
‑
1细胞培养：
[0047]
thp
‑
1细胞购买于中科院上海细胞库，根据指示说明，使用rpmi
‑
1640培养基添加10％的胎牛血清，放置于含有5％co2的37℃细胞培养箱中进行培养。每 3
‑
4天进行传代，1:3
‑
1:4传代。采用rpmi
‑
1640 10％fbs完全培养基培养，所有培养条件均为37
±
0.5℃，(5
±
1)％co2浓度，饱和湿度。
[0048]
(2)3d表皮培养：
[0049]
skinethic皮肤模型购于上海斯安肤诺生物科技有限公司，根据指示说明，每批次含：皮肤模型、维持培养基及检测培养基。skinethic皮肤模型到达实验室后，使用镊子将皮肤模型移入已经添加1ml的维持培养基的6孔板中，于37℃，5％co2 和95％湿度的培养条件下孵育过夜，待3d表皮模型稳定后进行实验。
[0050]
步骤s2，thp
‑
1细胞及3d表皮活力检测确定实验样品的检测浓度，包括以下工序：
[0051]
步骤s21，取步骤s1中生长状态稳定的3d表皮模型，加入实验样品，所述实验样品为待测化妆品原液，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养18
‑
24h 后，用mtt检测3d表皮模型的组织存活率；
[0052]
步骤s22，根据步骤s21筛选得到组织存活率大于50％时对应的实验样品的浓度为3d表皮模型给药浓度。
[0053]
步骤s3，细胞铺板及表皮模型联合培养步骤：取步骤s1中对数生长的thp
‑
1 细胞接种至6孔细胞培养板，具体是将预先培养的对数生长的thp
‑
1细胞离心，去上清，用培养基重悬细胞，浓度为106个/ml，吸取1ml上述重悬液接种至6孔细胞培养板，这样，thp
‑
1细胞以106个细胞/ml的密度接种至6孔细胞培养板，每孔培养基1ml，每个培养孔设置3个复孔；6孔细胞培养板上分别设置空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组，空白对照组
加入完全培养基，阴性对照组加入乳酸，阳性对照组加入肉桂醛，待测物处理组加入待测物质；阴性对照组中加入的乳酸为用细胞培养基将乳酸稀释至体积浓度为0.1％的乳酸溶液；阳性对照组加入肉桂醛为用细胞培养基将肉桂醛稀释至体积浓度为0.5％的肉桂醛溶液；
[0054]
同时将3d表皮模型放置在6孔细胞培养板的板内的thp
‑
1细胞上方，放置过程中不要产生气泡；然后将空白对照、阴性对照、阳性对照及待测物质一一对应涂抹在空白对照组、阴性对照组、阳性对照组和待测物处理组的3d表皮模型上，用量150
‑
200μl；
[0055]
待测物质包括#3防晒喷雾、#4抗老化防晒乳、#5防晒凝露、#6物理防晒乳、#7男士防晒乳、#8美白防晒喷雾和#9清透防晒乳。
[0056]
步骤s4，受试物暴露步骤：然后将步骤s3中的6孔细胞培养板转移至37℃、 5％co2、相对湿度95％的co2培养箱内，培养时间20
‑
24h。
[0057]
步骤s5，冲洗步骤：取出6孔细胞培养板，用pbs(磷酸缓冲盐溶液)将3d 表皮模型表面的空白对照、阴性对照、阳性对照及待测物质冲洗掉。
[0058]
步骤s6，mtt组织活性检测步骤，具体包括以下步骤：
[0059]
s61，表皮模型mtt处理步骤：将步骤s5中经过冲洗的3d表皮模型从6孔细胞培养板中取出，取一块24孔细胞培养板，放入200μl的1mg/ml mtt工作液中，将3d表皮模型转移至24孔细胞培养板上，并放入37℃，5％co2，相对湿度95％的co2培养箱内，培养时间3h；
[0060]
s62，表皮模型活力检测步骤：取一块新的24孔板，先在孔内加入500
‑
1000μl 异丙醇，将步骤s6处理后的3d表皮模型转移到该24孔板内，放置过程中不要产生气泡，在3d表皮模型内加入500
‑
1000μl异丙醇萃取，用封口膜将24孔板覆盖封住，封一层后，盖上盖子再封一层，将24孔板避光过夜；24孔板取出后在摇床上混匀1
‑
2h；将溶液混匀，酶标板空白孔为异丙醇，甲瓒萃取液200μl/每孔，6个复孔，用酶标仪570nm进行检测；取组织存活率大于50％的3d表皮模型进行后续的细胞致敏性实验测试。
[0061]
步骤s7，体外细胞致敏模型建立步骤，需要进行细胞表面目标分子表达量检测，目标分子为细胞表面标记物cd86和细胞表面标记物cd54，具体包括以下步骤：
[0062]
步骤s71，thp
‑
1细胞收集步骤，将步骤s5中经过冲洗的3d表皮模型从6孔细胞培养板中取出后，将每种受试物作用下的thp
‑
1细胞，从6孔细胞培养板中分别移入对应的1ml ep管中，离心沉淀thp
‑
1细胞，并用facs缓冲液清洗一次，再次离心收集thp
‑
1细胞；
[0063]
步骤s72，fcr阻断步骤：按thp
‑
1细胞数量配制适宜浓度的fcr阻断剂， 50
‑
100μl体积的一百万个细胞需要2.5μg的fcr阻断剂，随后将离心获得的thp
‑
1 细胞进行阻断；
[0064]
步骤s73，抗体染色步骤：将进行过阻断的thp
‑
1细胞按每管50μl平均分配至4支1ml的ep管中，在4支1ml的ep管一一对应地加入抗体fitc标记的cd86 抗体、pe标记的cd54抗体、fitc标记的小鼠同型对照igg1和pe标记的小鼠同型对照igg1；4℃环境和暗室条件下染色30min；使用facs缓冲液清洗2次，再用500μlfacs缓冲液重悬细胞并转移5ml流式管中待检测；每次实验条件下同时进行7
‑
aad的染色，确定该浓度下细胞活力与相应抗体染色的情况；
[0065]
步骤s74，流式细胞测定步骤：收集分析10000个thp
‑
1细胞，通过无处理的空白对照组的thp
‑
1细胞调节实验fsc vs ssc的实验电压，以确保本批次thp
‑
1 细胞后续实验的计算结果的准确性，得到细胞表面目标分子表达量，建立以目标分子表达量为基准的体外细胞致敏模型。
[0066]
步骤s8，结合体外细胞致敏模型，参照步骤s7的方法对待测物质的致敏性进行评价，以目标分子表达量为基准，计算待测物质引起的目标分子相对表达量的变化，以目标分子相对表达量的变化值表示致敏的强度，目标分子相对表达量的变化值越大，待测物质的潜在致敏性越强。
[0067]
三、实验结果
[0068]
1、3d表皮模型活力测试
[0069]
请参阅图1和表3来评估受试物对skinethic皮肤模型活力的影响。
[0070]
编号3d表皮活力(％)#1110.0#285.9#392.5#482.1#554.5#653.0#7102.6#854.0#951.6
[0071]
表3
[0072]
请参阅图1，不同受试物所引起的3d表皮活力变化结果，再结合表3，待测物 #5、#6、#8、#9作用的3d表皮活力相对较低，但所有受试物作用的3d表皮活力均超过50％。
[0073]
2.thp
‑
1细胞活力测试
[0074]
不同受试物对thp
‑
1细胞存活率的影响如表4所示：
[0075]
编号细胞存活率(％)#198.2#288.0#390.6#493.5#594.0#695.9#797.0#898.7#995.4
[0076]
表4
[0077]
3.受试物引起的目标分子表达量检测
[0078]
不同受试物引起的细胞表面标记物cd86和cd54的表达量如表5所示：
[0079]
编号cd86表达量cd54表达量#113532#2150219
#312282#413877#513359#6187223#711874#811480#914784
[0080]
表5
[0081]
请参阅图2，不同受试物所引起的细胞表面标记物cd86和cd54的表达量变化结果，再结合表4和表5，待测物#6能引起目标分子cd86和cd54的表达量明显增高，判断其可能具有潜在致敏性，需要后续进一步研究。另外，#3、#4、#5、 #7、#8、#9均未引起目标分子的表达量增高，不具有致敏性。
[0082]
本发明提供的通过结合3d表皮的组织活性及细胞表面cd86、cd54的表达筛选活性物的方式，稳定性高，重现性好，可以用于特定目的的化妆品产品的筛选，为后续研发提供了新的思路。
[0083]
综上所述，本发明的体外细胞与3d表皮模型共培养的化妆品致敏评价方法，结合细胞模型和3d表皮模型检测结果，将待测物作用于所建立的致敏模型中，筛选能够抑制或促进目标分子表达的活性物质，从而对产品的致敏安全性进行评价，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品的致敏性提供快捷可靠的评价方法，为原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发及功效验证的进一步研究提供有效依据。
[0084]
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。