一种小分子荧光探针及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及荧光成像领域，特别涉及一种小分子荧光探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.髓鞘(myelin)是包裹在神经细胞轴突外面的一层膜，由髓磷脂构成，一般出现在脊椎动物的中枢神经系统中。髓鞘化(myelination)是指髓鞘发展的过程，它使神经兴奋在沿神经纤维传导时速度加快，并保证其定向传导以避免信息相互干扰，同时在一些轴突受损时能引导轴突的再生。脱髓鞘(demyelination)是指髓鞘形成后发生的髓鞘损坏，可能会引发多种中枢神经系统疾病，其中最为常见的是多发性硬化(multiplesclerosis,ms)。在ms的诊断和疗效评价上，寻求在体内或体外定性或定量地使得髓鞘可视化的方法一直是研究人员和临床医师努力的目标。要实现这个目标，关键是要开发出能够通过血脑屏障与髓鞘特异性结合的分子探针。根据现有研究成果，发现能够通过血脑屏障与髓鞘有效结合的分子均具有二苯基乙烯结构，结构上至少含有一个氨基基团，且进一步研究发现，含有两个氨基基团的分子探针与myelin结合更牢固、成像效果更好(j.med.chem.2016,59(8):3705
‑
3718；j.med.chem.2011,54(7):2331
‑
2340)。另根据已公开的专利文件(公开号：cn 107759533 a)，该发明的一类近红外荧光小分子探针，可有效用于近红外条件下的髓鞘靶向成像，其同样具有类二苯基乙烯结构，并含有两个氨基基团。在目前的ms临床诊断技术中，主要依靠核磁共振成像技术，且不具有靶向特异性，另有操作复杂、费用昂贵等缺点。


技术实现要素：

3.发明目的：本发明提供了一种小分子荧光探针，其能够与髓鞘特异性结合，从而实现髓鞘体内可视化成像尤其是近红外条件下的可视化成像，为中枢神经系统疾病如多发性硬化的诊断和疗效评价以及对应的药效评价提供了一种直观、简单、快捷、廉价的成像方法。本发明还提供了该小分子荧光探针的制备方法以及用途。
4.技术方案：本发明所述的一种小分子荧光探针，所述荧光探针如式(ⅰ)所示：
[0005][0006]
所述r1为c1‑
c8烷基；
[0007]
所述r2为c1‑
c8烷基。
[0008]
本发明的取代基
‑
nh
‑
r1位于苯环的5位或6位：
[0009]
优选地，
[0010]
所述r1为c1‑
c5烷基；
[0011]
所述r2为c1‑
c4烷基。
[0012]
优选地，
[0013]
所述r1为甲基、乙基、丙基、异丁基或异戊基；
[0014]
所述r2为甲基或乙基。
[0015]
优选地，所述小分子荧光探针如下所示：
[0016][0017]
本发明所述的小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0018]
(1)：中间体2的制备：将原料1和二碳酸二叔丁酯置于圆底烧瓶中，加入四氢呋喃溶剂溶解，后再加入碳酸氢钠固体，室温下搅拌反应，tlc检测反应进程，反应结束后减压蒸除四氢呋喃溶剂后加入蒸馏水，待固体析出后过滤、洗涤，得到中间体2；
[0019]
(2)：中间体3的制备：圆底烧瓶使用前经充分干燥，并用氮气吹扫，加入磁子，迅速加入氢化钠和中间体2，塞好橡皮塞，充入氮气保护，0℃冰浴冷却，加入干燥dmf，搅拌后缓慢滴加碘代烷烃，tlc检测反应进程，反应结束后，加入蒸馏水淬灭反应，乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除溶剂得粗品，再经硅胶柱层析得中间体3；所述碘代烷烃为c1
‑
c8碘代烷烃；
[0020]
(3)：中间体5的制备：圆底烧瓶中加入原料4和新鲜蒸馏的氯化亚砜，加入适量 dmf，加热回流，反应结束后回收未反应的氯化亚砜，乙酸乙酯重结晶得中间体5；
[0021]
(4)：中间体6的制备：圆底烧瓶中加入中间体3、dmap和三乙胺，加入二氯甲烷溶解，冷却至0℃，将中间体5溶于二氯甲烷中，缓慢滴加入圆底烧瓶中，反应结束后，加入蒸馏水，乙酸乙酯萃取，合并有机层，水洗、盐洗，无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除有机溶剂得中
间体6；
[0022]
(5)：中间体7的制备：圆底烧瓶中加入中间体6和三氯化铝，再加入溶剂溶解，加热反应，反应结束冷却至室温后，过滤除去三氯化铝，滤液蒸干，经硅胶柱层析得纯品中间体7；
[0023]
(6)：中间体8的制备：圆底烧瓶中加入中间体7，将其溶解于thf中，依次加入硼氢化钠和三氯化铝，回流反应，反应结束后冷却至室温，加适量水后用乙酸乙酯萃取，水洗、盐洗、无水硫酸钠干燥后减压蒸除乙酸乙酯得中间体8；
[0024]
(7)：中间体9的制备：圆底烧瓶中加入发烟硫酸和中间体8，加热反应，结束后冷却至室温，加入大量冰水，用氢氧化钠水溶液调节ph值至中性，过滤，水洗得中间体9；
[0025]
(8)：目标产品的制备：圆底烧瓶中加入中间体9，加入甲醇溶解，再加入ddq搅拌反应，tlc检测反应进程，反应结束后减压浓缩，加入dcm，过滤，滤液浓缩后经硅胶柱层析得目标产品。
[0026]
本发明的合成路线如下所示：
[0027][0028]
优选地，步骤(5)中，所述溶剂为甲苯，加热反应温度为135
‑
145℃。
[0029]
优选地，步骤(7)中，所述加热反应温度为75
‑
85℃。
[0030]
优选地，步骤(2)中，所述碘代烷烃为碘代甲烷、碘代乙烷、碘代丙烷、碘代异丁烷、碘代异戊烷。
[0031]
本发明还提供了上述的小分子荧光探针或上述的制备方法制备的小分子荧光探针在髓鞘成像中的用途。
[0032]
有益效果：本发明所述的小分子荧光探针，其发射和激发波长进入近红外区，属于
近红外荧光小分子探针，并且该具有与髓鞘特异性结合的特征，从而能够实现髓鞘体内可视化成像尤其是近红外条件下的可视化成像，从而为中枢神经系统疾病如多发性硬化的诊断和疗效评价以及对应的治疗药物筛选提供了一种直观、简单、快捷、廉价的成像方法。
附图说明
[0033]
图1为本发明目标产物的质谱图；
[0034]
图2为本发明目标产物的质谱图；
[0035]
图3为本发明目标产物的质谱图；
[0036]
图4为本发明目标产物的质谱图。
具体实施方式
[0037]
实施例1：中间体5的合成
[0038]
中间体5
‑
1的合成：100ml圆底烧瓶中加入3.87g(2.0mmol) 4
‑
(二乙氨基)苯甲酸，加入60ml新鲜蒸馏的氯化亚砜和0.5ml dmf，75℃加热回流，反应4小时，停止加热，回收未反应的socl2，残余s℃l2减压蒸除，粗品乙酸乙酯重结晶得0.38g白色晶体中间体5
‑
1，收率90％。
[0039]
中间体5
‑
2：的合成：参见中间体5
‑
1的合成，采用4
‑
(二甲氨基)苯甲酸，合成中间体5
‑
2，收率92％。
[0040]
实施例2：中间体2的合成
[0041]
中间体2
‑
1的合成：将8
‑
胺基
‑1‑
萘酚1.59g(10.0mmol)、二碳酸二叔丁酯2.4g(11.0mmol)置于100ml圆底烧瓶中，加入20ml四氢呋喃溶解，后再加入碳酸氢钠1.25g(15.0mmol)和10ml水，室温下反应，tlc检测反应进程(展开剂:乙酸乙酯:正己烷＝1:3，v:v)，反应结束后减压蒸除四氢呋喃溶剂后加入100ml蒸馏水，有大量黑色固体析出，过滤，先后用大量蒸馏水和正己烷洗涤，得到中间体2
‑
1(黑色固体)。
[0042]
实施例3：中间体3的合成
[0043]
中间体3
‑
1的合成：25ml圆底烧瓶使用前经充分干燥，并用氮气吹扫，加入磁子，迅速加入0.12g(5mmol)氢化钠和0.259g(1mmol)中间体2
‑
1，塞好橡皮塞，充入氮气保护，0℃冰浴冷却，加入5ml干燥dmf，搅拌30分钟后，0℃下缓慢滴加0.568g(4mmol)碘甲烷，0℃至室温下反应，tlc检测反应进程(展开剂:乙酸乙酯:正己烷＝1:3，v:v)，反应结束后，加入20ml蒸馏水淬灭反应，乙酸乙酯萃取(25ml
×
3)，合并乙酸乙酯层，水洗(25ml
×
3)、饱和食盐水洗(10ml
×
2)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除乙酸乙酯得粗品，再经硅胶柱层析得中间体3
‑
1，收率67％。
[0044]
中间体3
‑
2的合成：参见中间体3
‑
1的合成方法，采用碘乙烷，合成中间体3
‑
2，收率66％。
[0045]
中间体3
‑
3的合成：25ml圆底烧瓶使用前经充分干燥，并用氮气吹扫，加入磁子，迅速加入0.12g(5mmol)氢化钠和0.259g(1mmol)中间体，塞好橡皮塞，充入氮气保护，0℃冰浴冷却，加入5ml干燥dmf，搅拌30分钟后，0℃下缓慢滴加0.68g(4mmol)碘丙烷，0℃至室温下反应，tlc检测反应进程(展开剂:乙酸乙酯:正己烷＝1:3，v：v)，反应结束后，加入20ml蒸馏水淬灭反应，乙酸乙酯萃取(25ml
×
3)，合并乙酸乙酯层，水洗(25ml
×
3)、饱和食盐水洗(10ml
×
2)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除乙酸乙酯得粗品，再经硅胶柱层析得0.21g中间体3
‑
3(黑色固体)，收率67％。
[0046]
中间体3
‑
4的合成：25ml圆底烧瓶使用前经充分干燥，并用氮气吹扫，加入磁子，迅速加入0.12g(5mmol)氢化钠和0.259g(1mmol)中间体，塞好橡皮塞，充入氮气保护，0℃冰浴冷却，加入5ml干燥dmf，搅拌30分钟后，0℃下缓慢滴加0.79g(4mmol)碘代异戊烷，0℃至室温下反应，tlc检测反应进程(展开剂:乙酸乙酯:正己烷＝1:3，v:v)，反应结束后，加入20ml蒸馏水淬灭反应，乙酸乙酯萃取(25ml
×
3)，合并乙酸乙酯层，水洗(25ml
×
3)、饱和食盐水洗(10ml
×
2)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除乙酸乙酯得粗品，再经硅胶柱层析得0.23g中间体3
‑
4(黑色固体)，收率68％。实施例4：中间体6的合成
[0047]
中间体6
‑
1的合成：50ml圆底烧瓶中加入2g(7.5 mmol)中间体3
‑
2、0.3g(2.5mmol)dmap和0.56g(5.5mmol)三乙胺，加入20ml 二氯甲烷溶解，冷却至0℃，1.05g(5mmol)中间体5
‑
2溶于10ml二氯甲烷中，缓慢滴加入圆底烧瓶中，滴加结束后，移至室温下反应，tlc检测反应进程(展开剂:乙酸乙酯:正己烷＝1:3，v:v)，反应结束后，加入20ml蒸馏水淬灭反应，乙酸乙酯萃取(25ml
×
3)，合并乙酸乙酯层，水洗(25ml
×
3)、饱和食盐水洗(10ml
×
2)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除乙酸乙酯得粗品，再经硅胶柱层析得纯品(洗脱剂：15
‑
20％乙酸乙酯
‑
正己烷)，收率92％。
[0048]
中间体6
‑
2的合成：50ml圆底烧瓶中加入2.25 g(7.5mmol)中间体3
‑
3、0.3g(2.5mmol)dmap和0.56g(5.5mmol)三乙胺，加入 20ml二氯甲烷溶解，冷却至0℃，0.9g(5mmol)中间体5
‑
2溶于10ml二氯甲烷中，缓慢滴加入圆底烧瓶中，滴加结束后，移至室温下反应，tlc检测反应进程(展开剂: 乙酸乙酯:正己烷＝1:3，v:v)，反应结束后，加入20ml蒸馏水淬灭反应，乙酸乙酯萃取(25ml
×
3)，合并乙酸乙酯层，水洗(25ml
×
3)、饱和食盐水洗(10ml
×
2)，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸除乙酸乙酯得粗品，再经硅胶柱层析得纯品(洗脱剂：15
‑
20％乙酸乙酯
‑
正己烷)，收率85％。
[0049]
中间体6
‑
3的合成：参见中间体6
‑
1的合成方法，采用中间体5
‑
1与中间体3
‑
4合成中间体6
‑
3。
[0050]
中间体6
‑
4的合成：参见中间体3
‑
1的合成方法，采用中间体5
‑
1与中间体3
‑
1合成中间体6
‑
4。实施例5：中间体7的合成
[0051]
中间体7
‑
1的合成：50ml圆底烧瓶中加入0.63g(1.5mmol)中间体6
‑
1和0.36g (2.7mmol)三氯化铝，再加入20ml甲苯溶解，加热至140℃反应2h，tlc检测反应进程(展开剂:乙酸乙酯:正己烷＝1:3，v:v)反应停止冷却至室温，过滤，滤液蒸干，得米黄色固体，再
经硅胶柱层析得纯品做中间体7
‑
1，收率42％。
[0052]
对应地，采用实施例7
‑
1的合成方法，分别用中间体6
‑
2合成中间体7
‑
2，中间体6
‑
3 合成中间体7
‑
3，中间体6
‑
4合成中间体7
‑
4。
[0053]
实施例6：中间体8的合成
[0054]
中间体8
‑
1的合成：在50ml圆底烧瓶中加入0.45g(1mmol)中间体7
‑
1，将其溶解于10ml thf中，依次加入0.18g(4.8mmol)硼氢化钠与0.36g(2.7mmol)三氯化铝，加热至60℃回流2h，tlc检测反应进程(展开剂:乙酸乙酯:正己烷＝1:3， v:v)，反应结束后冷却至室温，向反应后的溶液中加入适量水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后，减压蒸除乙酸乙酯得粗品，硅胶柱层析分离得产品0.34g，收率75％。
[0055]
分别通过8
‑
1的合成方法，用中间体7
‑
2合成中间体8
‑
2，中间体7
‑
3合成中间体8
‑
3，中间体7
‑
4合成中间体8
‑
4。
[0056]
实施例7：中间体9的合成
[0057]
中间体9
‑
1的合成：在25ml圆底烧瓶中加入发烟硫酸(10ml)中，再向其中加入0.43 g(1mmol)中间体8
‑
1，加热至80℃反应30min，反应结束冷却至室温，加入大量冰水，用20％氢氧化钠水溶液调节ph至中性，有固体析出，过滤，用水洗涤得产品，收率71％。
[0058]
采用9
‑
1的合成方法，用中间体8
‑
2合成中间体9
‑
2，中间体8
‑
3合成中间体9
‑
3，中间体8
‑
4合成中间体9
‑
4。
[0059]
实施例8：目标产物10的合成
[0060]
中间体10
‑
2的合成：50ml圆底烧瓶中加入0.39g(1mmol) 中间体9，再加入10ml甲醇将其溶解，加入0.45g(2mmol)ddq在空气中搅拌12h。 tlc检测反应进程(展开剂:乙酸乙酯:正己烷＝1:3)，反应结束后，减压浓缩，将产品溶于dcm中，过滤，滤液浓缩得粗品，再经硅胶柱层析得纯品得产品0.32g，收率82％。esi
‑
ms m/z:[m na]

＝417.2。如图2所示。
[0061]
目标产物10
‑
1的合成：采用目标产物10
‑
2的合成方法，合成目标产物10
‑
1。esi
‑
ms m/z:[m k]

＝419.3。如图1所示。
[0062]
目标产物10
‑
3的合成：50ml圆底烧瓶中加入0.45g (1mmol)中间体9
‑
3，再加入10ml甲醇将其溶解，加入0.45g(2mmol)ddq在空气中搅拌12h。tlc检测反应进程(展开剂:乙酸乙酯:正己烷＝1:3)，反应结束后，减压浓缩，将产品溶于dcm中，过滤，滤液浓缩得粗品，再经硅胶柱层析得纯品得产品0.34g，收率75％。esi
‑
ms m/z:[m k]

＝489.3。如图3所示。
[0063]
目标产物10
‑
4，通过中间体10
‑
3的合成方法，合成目标产物10
‑
4。esi
‑
ms m/z:[m k]

＝433.2。如图4所示。
[0064]
二、荧光性能测试：
[0065]
将产品溶于二甲亚砜(dmso)中，配置成1mm溶液，利用荧光分光光度计测试其激发波长和发射波长。部分近红外荧光小分子探针的结构和荧光性能见表1，结果显示，其发射波长均大于650nm，处于近红外区。
[0066]
表1小分子探针的结构和荧光性能
[0067]