一种凝结芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种凝结芽孢杆菌及其应用，属微生物技术领域。


背景技术：

2.益生菌被世界卫生组织定义为“当给予足量时会有利于机体健康的活的微生物”。在世界范围内有无数的补充益生菌，但是大多数在室温条件下是不稳定的，也缺乏对胃酸以及的胆盐的耐受能力。国内目前能摄入活性益生菌的食品只有低温酸奶，少量固体饮料冲剂，这些产品在整个食品行业中所占的份额很小。益生菌食品之所以小众，并不是因为大家没有发现其中的价值，而是受制于传统益生菌本身的生物特性。益生菌作为一种细菌，不低温保存的话会代谢，死亡，死亡失去活性不是最大的问题，问题是代谢产物会改变食品本身的口感，甚至可能滋生其他细菌。另一方面很多益生菌产品，效果不明显，这也不是益生菌本身有问题，而是益生菌一方面保存不当容易失活，另一方面人体消化腺包括胃酸，胆盐等等本来就有杀菌的功能，传统的益生菌会被胃酸杀死，不会有预期的益生效果，这也会导致传统的益生菌产品的保持期很短，造成生产和保存成本的增加。另外，现有技术中报道的益生菌主要为乳酸菌，乳酸菌在动物肠道中的益生表现主要是产乳酸从而起到润滑肠道的作用，功能比较单一。因此，寻找一种功能更多样，益生效果更显著的微生物成为了现有技术中的研究热点。
3.凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)属于芽孢杆菌属，最初从炼乳的结块中分离得到。该菌种已列入欧盟安全资格认定(qps)推荐的生物制剂列表中，并列入国际乳业联盟(idf)“具有在食品中安全使用记录史的微生物清单”，已通过美国食品药品监督管理局的gras(一般认为安全的物质)认定。加拿大、澳大利亚、新西兰等国家已批准使用，其主要应用于饮料、烘焙食品、烘焙混合料、早餐谷物、糖果等生产加工。
4.凝结芽孢杆菌是益生菌中的一种例外，其孢子化的特性使之可以在不经特殊处理的前提下生存，并且能够在肠胃环境中正常生长繁殖同时发挥其乳酸菌特性的保健功能，凝结芽孢杆菌在动物肠道中的作用一般分以下3个过程：(1)萌发过程：凝结芽孢杆菌在制剂或者食品中以内生孢子的形式存在，经过口服进入胃后，因为胃的搅拌作用和酸性条件使其芽孢衣吸水膨胀，开始萌发，当进入十二指肠部位时，孢子在适宜环境中萌发成营养细胞。(2)对肠道有益菌的影响：凝结芽孢杆菌以活菌形式进入肠道后，其兼性厌氧的特性使其在进入小肠后，消耗游离氧，降低肠内氧浓度。肠道有益菌如乳酸菌喝双歧杆菌等都为厌氧菌，凝结芽孢杆菌优化了它们的生长环境，调节肠道微生物菌群平衡，进而提高人体的免疫力和抗病性。(3)对肠道有害菌的影响：凝结芽孢杆菌对游离氧的消耗，有利于厌氧菌生长的同时也可以抑制需氧生存的有害菌，如金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。其分泌的凝结素作为一种抗菌肽可以穿透细胞的细胞膜，对肠球菌等多种有害菌都有抑制作用，其代谢的乳酸也可以抑制有害菌生长。
5.目前，已有专利报道了凝结芽孢杆菌的在耐酸、耐胆盐、产乳酸、抑制病原菌生长的特性、提高免疫力等方面的特性。比如，cn106754579a公开了分离于健康散养鸡肠道内容
物的凝结芽孢杆菌cgmcc no.12125，具有耐酸、耐胆盐、抑制病原菌生长、能够产淀粉酶和蛋白酶等特性，能够有效提高免疫力，促进生长和改善肠道微环境等益生作用；数据显示，其对磺胺和杆菌肽低敏，在ph为1.5和2.5的模拟胃液中孵育2h后存活率分别达到了69.15％和78.09％，在胆盐浓度0.03％～0.3％的范围内均有较多的菌体存活，可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌，其制备的发酵制剂对黄羽肉鸡生长性能的实验结果显示其可提高机体免疫器官成熟速度、促进机体生长发育；但是，该专利文献中并没有提及凝结芽孢杆菌的耐高温性能，也没有提及其产乳酸等的情况，一定程度上会限制凝结芽孢杆菌的应用范围。此外，cn102250817a公开了一株饲用凝结芽孢杆菌cgmcc no.4846，显示可耐受ph 1.5～2.5合成胃液180min，最高耐受胆盐浓度为3.0％，对肠杆菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有很强的抑制作用，可耐受ph 1.5～2.5的合成胃液180min，最高耐受胆盐浓度为3.0％，菌株制成的菌剂能够提高饲料利用率(料肉比降低18.9％)，降低断奶仔猪腹泻率(腹泻率降低68.2％)，可起到取代抗生素的作用。但是，该专利文献中也没有提及凝结芽孢杆菌的耐高温性能，也没有提及其产乳酸等的情况，一定程度上会限制凝结芽孢杆菌的应用范围。cn101412983b公开了凝结芽孢杆菌cgmcc no.2602，在有氧条件下能够产芽孢，并在发酵过程中代谢产出少量l
‑
乳酸，在静置厌氧条件下能够产出纯度较高的l
‑
乳酸，l
‑
乳酸含量可达8.5g/l；可明显降低养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐等有害物质含量，改善养殖池塘水质；在提高增重，提高饲料转化率，降低料重比，提高存活率，增强抗病能力及免疫力方面效果明显。同样地，该专利文献中也没有提及凝结芽孢杆菌的耐高温性能等，一定程度上会限制凝结芽孢杆菌的应用范围。
6.益生菌剂是活菌制剂，凝结芽孢杆菌活菌制剂对环境例如温度、压力、ph等的敏感性，使其在高温加工过程中活性会受到一定的损失，特别是烘焙食品或者饲料制粒过程等高温高压条件，使一些耐热性差的益生菌几乎在制粒后全部死亡，严重影响了益生菌的使用效果。由此可见，益生菌不仅要求益生功能显著，还必须耐受加工过程中的高温高压等环境，才能具有真正发挥益生作用。cn110511884a的凝结芽孢杆菌cctcc no.m 2019529，耐热性能好、耐储存，在饲料高温造粒工艺中存活率达80％以上，在室温下储存一年后凝结芽孢杆菌存活率不低于95％；该公开文件并没有提及凝结芽孢杆菌的其他性能，该菌的储存稳定性也有待提高。cn112592870a公开的凝结芽孢杆菌cgmcc no.21265具有热稳定性、抑菌性和耐人工胃肠液能力，具有分泌蛋白酶、淀粉酶和乳酸酶等的能力以及降解亚硝酸盐的能力；该公开文件并没有过多关注凝结芽孢杆菌的其他性能。此外，武汉微康益生菌研究院有限公司在cn111548968a中公开了一种凝结芽孢杆菌bc99，具有耐高温、耐胃酸、耐肠碱的高耐受性，同时还具有较好的稳定性和抑菌作用；凝结芽孢杆菌bc99在80℃水浴加热5h后，有50％的存活率，在100℃水浴加热2h后仍有菌存活，但其耐高温性能还有待提升。
7.除了，耐酸、耐胆盐、产乳酸、抑制病原菌生长、耐高温高压等性能外，凝结芽孢杆菌的其他性能也是当前关注的要点，是影响其应用范围和效果的重要因素。比如，针对全世界每年有25％的农作物被霉菌毒素污染，其中受玉米赤霉烯酮zea污染严重，全球畜禽因食用zea污染的饲料使畜牧业每年遭受近百亿美元的经济损失的问题，山西大学研发了适用于饲料行业的zea微生物菌制剂，减少养殖业的经济损失，其在cn111826298a中公开了一株高效降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌及其应用，当zea初始浓度为50μg/ml时，2h后凝结芽孢杆菌asag215对其降解率达95％；可以用在饲料里。中国农业大学研究了低盐发酵香肠
的发酵剂，在cn110724651a中公开了适合发酵食品中使用的凝结芽孢杆菌l
‑
h7，该菌发酵葡糖糖产酸不产气，不产粘，精氨酸不产氨，氨基酸脱羧酶阴性，不产h2s，产蛋白酶和脂肪酶；能够耐受高浓度的氯化钠、亚硝酸钠；能有效抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、蜡样芽孢杆菌的生长；在模拟消化道的环境中存活率较高，能有效发挥益生作用。针对现有的脲酶抑制剂对人畜和环境有毒害和污染、对氨的抑制率不高的技术问题，河北农业大学在cn110699298a中公开了一种产脲酶抑制剂的凝结芽孢杆菌p1
‑
678，其具有高效稳定的降氨能力，通过日粮添加或直接添加到粪便中可以有效控制粪中脲酶的活性，减少粪便中尿素氮或尿酸氮的分解，同时，氨排放的减少还能降低堆肥肥效损失，在资源化、无害化处理畜牧业废弃物和治理环境污染，推进畜牧业健康可持续发展方面具有巨大的应用潜力。此外，据报道，世界各国都在致力于开发显效、无毒副作用、价廉的新溶栓药物，寻找天然来源的纤溶酶也成为了研究的热点。微生物因其物种丰富、繁殖快以及易于应用于工业生产是备受关注的溶栓药物的重要来源；针对这一问题，四川农业大学研究了能在食品中直接使用的菌株，在cn109706092a中公开了一株产纤溶酶的凝结芽孢杆菌hq
‑
1，具有良好的药敏性、抑菌性和对酸碱环境的耐受能力，所产的纤溶酶活性高，可达383.1u/ml，有利于促进具纤溶酶功能性食品的开发。
8.综上，可以看出，目前对凝结芽孢杆菌的关注度越来越高，对凝结芽孢杆菌的性能也是影响其适用范围和效果的关键因素。然而，不同的凝结芽孢杆菌菌株不仅在性能种类和效果上存在明显差异。如何获得兼具各种优良性能的凝结芽孢杆菌是当前研究重点，这将有利于扩大凝结芽孢杆菌的适用范围。


技术实现要素：

9.为了获得兼具各种优良性能的凝结芽孢杆菌、扩大凝结芽孢杆菌的适用范围，本发明提供了凝结芽孢杆菌bc2000，该菌株兼具耐酸、耐胆盐、产乳酸、抑制病原菌生长、耐高温高压的性能，分泌蛋白酶、淀粉酶和乳酸酶等的能力，降解亚硝酸盐的能力，以及降解多种真菌毒素、高产纤溶酶等性能，适用范围广、使用效果好。
10.本发明的第一个目的是提供一株凝结芽孢杆菌bc2000，已于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21621，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
11.该凝结芽孢杆菌bc2000的性能具体如下：
12.(1)耐高温：在湿热条件和干热条件下的耐高温性能均优良；其中，在160℃干热条件下还能保持一定存活，在100℃湿热条件下处理60min的存活率可以达到70％以上；
13.(2)耐胆盐：经0.3％的胆汁盐下处理24h后能保持95％以上的存活率；
14.(3)耐酸性：在ph 1.5下处理6h后能保持50％以上的存活率；
15.(4)储存稳定性：于干燥、避光处保存36个月后能保持96.92％的存活率；
16.(5)产乳酸：发酵36h的发酵上清液中浓度达8.72g/l；
17.(6)产酶丰富：可产蛋白酶、乳酸酶，高产淀粉酶和纤溶酶；淀粉酶活力可达302.43u/mgprot，发酵液中纤溶酶活性高达467.9u/ml；
18.(7)可降解亚硝酸盐：对2.0mg/l的亚硝酸盐进行降解，36h后降解率高达98％；
19.(8)抑制病原菌生长：可以抑制大肠杆菌、粪肠球菌、变异链球菌、金黄色葡萄球
菌、伤寒沙门氏菌的生长；
20.(9)能降解多种真菌毒素：可以高效降解玉米赤霉烯酮，能降解4种黄曲霉毒素。
21.本发明的第二个目的是提供含有bacillus coagulans cgmcc no.21621的微生物菌剂。
22.在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂含有bacillus coagulans cgmcc no.21621菌体的活细胞、冷冻干燥得到的bacillus coagulans cgmcc no.21621干菌体、固定化的bacillus coagulans cgmcc no.21621细胞、bacillus coagulans cgmcc no.21621的液体菌剂、bacillus coagulans cgmcc no.21621的固体菌剂，或者以其他任何形式存在的bacillus coagulans cgmcc no.21621菌株。
23.在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任何可以应用于食品、饲料、药物或者其制备的任意种属的菌株，比如地衣芽孢杆菌、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等等。
24.在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中还含有任意能用于食品、饲料、药物的载体。
25.本发明的第三个目的是提供所述bacillus coagulans cgmcc no.21621的培养方法。
26.在本发明的一种实施方式中，所述培养方法是：先进行斜面菌体活化，活化后先摇瓶培养18
‑
48h，再接种到发酵罐中进行培养。
27.在本发明的一种实施方式中，所述培养方法是
28.(1)斜面菌体活化
29.划线接种于斜面培养基(组成以g/l计为：蛋白胨10，牛肉膏3，nacl 5，麸皮10，琼脂15
‑
20，ph 7.0
‑
7.2)，30℃培养24
‑
48h；
30.(2)摇瓶及种子罐培养
31.用无菌水将斜面上的成熟菌泥刮洗下来，装入内装玻璃珠的无菌三角瓶中振荡分散菌泥，获得均匀的菌悬液，将菌悬液在80℃水浴中加热10分钟，以体积比1％
‑
10％的接种量接入三角瓶摇瓶培养；培养条件为：摇瓶转速200r/min；种子罐搅拌转速≥150r/min，通气量1
‑
2m3/h，培养温度为30
‑
60℃，培养时间为18
‑
48h；
32.培养基组成为以g/l计：麸皮5
‑
20，酵母膏5.0
‑
10，豆粕粉5
‑
10，k2hpo
4 3，nacl 5，mnso4·
h2o 0.3，ph 7.0；
33.(3)发酵罐培养
34.种子培养液以体积比1％
‑
10％的接种量接入发酵罐；发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，以g/l计：碳源5
‑
20，氮源5
‑
20，k2hpo
4 3，nacl 5，mnso4·
h2o 0.3，碳酸钙2
‑
10，ph 6.0
‑
8.0；
35.发酵罐培养条件为：搅拌转速≥150r/min，通气量1
‑
2m3/h，培养温度为30
‑
60℃，培养时间为18
‑
48h；在培养过程中根据泡沫的高涨情况进行消泡；取发酵液进行镜检，当90％以上的菌体已形成芽孢时，即可放罐结束培养。
36.在本发明的一种实施方式中，所述凝结芽孢杆菌的液体发酵的碳源和氮源的选择十分广泛，碳源选用麸皮、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、果糖、阿拉伯糖、玉米糖、大米糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麦淀粉、红薯淀粉或马铃薯淀粉中的一种或几种；氮源选用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米浆粉、豆粕粉、大豆肽、棉籽蛋白、黄豆饼粉或花生饼粉中的
一种或几种。
37.本发明的第四个目的是提供所述bacillus coagulans cgmcc no.21621的菌剂；所述菌剂是将发酵罐培养的凝结芽孢杆菌bacillus coagulans cgmcc no.21621的菌液进行离心，将芽孢与干淀粉以重量比1:1
‑
5混合，在40
‑
50℃干燥20
‑
24h，粉碎机粉碎，过筛，加入配料石粉、麸皮或玉米芯粉或者麦芽糊精中的一种或几种，混合后制成固体菌剂，芽孢含量达1
×
109cfu/g以上。所述菌剂可以应用于畜牧业、水产养殖业、食品以及医药等行业中。
38.本发明的第五个目的是提供所述bacillus coagulans cgmcc no.21621的应用。
39.在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于食品或饲料领域中。
40.在本发明的一种实施方式中，所述食品为在制备过程中涉及高温环境或者高温处理的食品；比如烘焙食品。
41.在本发明的一种实施方式中，所述应用于饲料领域包括：直接将bacillus coagulans cgmcc no.21621添加到常规饲料配方中；或者将bacillus coagulans cgmcc no.21621或其发酵上清液，与饲料配方中的谷物或饼粕成份混合处理24h，然后再与其他饲料组分混合使用。
42.在本发明的一种实施方式中，所述应用是用于降解真菌毒素。所述真菌毒素包括：黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮(zea)。
43.本发明的第六个目的是提供一种降解谷物或饲料或饲料原料中的真菌毒素的方法。
44.在本发明的一种实施方式中，所述方法是向谷物或饲料原料中，接种0.5％
‑
5％w/v(每100g接种1
‑
20ml)浓度107cfu/ml
‑
108cfu/ml的bacillus coagulans cgmcc no.21621悬液或接种0.5％
‑
5％w/w(每100g接种1
‑
20g)浓度107cfu/g
‑
108cfu/g的bacillus coagulans cgmcc no.21621固体菌剂，进行固态发酵。可选地，所述固态发酵在培养温度为40～48℃下进行。可选地，所述固态发酵的时间为12～72h。
45.在本发明的一种实施方式中，所述谷物包括玉米、小麦、花生粕、稻谷或高粱等；所述饲料原料及饲料包括玉米、小麦、花生粕、稻谷、高粱等饲料原料及它们加工而成的饲料。
46.本发明的第七个目的是提供一种生产纤溶酶的方法，所述方法包括将bacillus coagulans cgmcc no.21621接种至培养基中进行发酵培养，至芽孢形成率达到90％以上时结束发酵，取发酵上清液，经纯化后获得纤溶酶。
47.在本发明的一种实施方式中，所述所述培养基为mrs液体培养基；可选地，发酵条件为：温度35
‑
42℃、摇床转速150
‑
250r/min、发酵时间24
‑
48h。
48.本发明的有益效果：
49.本发明提供了一种从泡菜中筛选到的一株凝结芽孢杆菌bacillus coagulans cgmcc no.21621，具有出众的耐高温，耐高压，耐酸，耐胆盐的特性，同时其产乳酸的能力也非常突出，并且可以实现1000亿以上孢子数稳定的大批量的工业化生产。该菌株出众耐高温能力，能够确保在经历复杂的食品加工环境，依然有稳定的活菌数，独特的耐酸能力，需要在5.2左右的酸性环境才会萌发，比市场上其他菌株更耐酸，经过人体胃酸环境(2.0左右)可以有更高的存活率。此外，该菌株能抑制病原菌生长，能产蛋白酶、淀粉酶和乳酸酶，高产纤溶酶，可降解亚硝酸盐、多种真菌毒素。
50.生物材料保藏
51.凝结芽孢杆菌bc2000，分类命名为凝结芽孢杆菌bacillus coagulans，已于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21621，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
52.mrs培养基/发酵培养基：蛋白胨10.0g/l、牛肉粉10.0g/l、酵母粉5.0g/l、葡萄糖20.0g/l、硫酸镁0.1g/l、醋酸钠5.0g/l、柠檬酸铵2.0g/l、磷酸氢二钾2.0g/l、硫酸锰0.05g/l、吐温80 1.0g/l和琼脂粉20.0g/l。
53.实施例1 bacillus coagulans的筛选
54.(1)首先将腌制泡菜碾碎，加入15ml无菌水，剧烈震荡20min，然后80℃水浴作用20min；然后采用浓度梯度稀释法，取稀释液100ul涂布于琼脂培养基平板上(培养基配方为：酵母膏10.0g/l；牛肉膏10.0g/l；蛋白胨10.0g/l；碳酸氢钠1.5g/l；磷酸二氢钾1.5g/l；七水硫酸镁1.0g/l；硫酸锰0.1g/l；氯化钙1.0g/l；去离子水1l)，45℃培养48h，挑选菌落大、生长快的菌株，进一步划线分离纯化。
55.(2)将上一步获得的分离纯化的菌株进行先甘油管保藏；然后取菌液接种于mrs培养基中，培养至菌体浓度为108cfu/ml，然后按照终浓度为107cfu/ml的添加量添加到胆汁盐含量0.5％的溶液中，37℃孵育24h后，涂布于琼脂培养基平板上测定存活率。选取存活率在95％以上的菌株进行下一步筛选。
56.(3)将菌株在人工模拟胃液(ph 3.0)37℃处理2小时，涂布于琼脂培养基平板上测定存活率。获得存活率在70％以上的菌株29株。
57.(4)酶活测定：将上一步获得的凝结芽孢杆菌单菌落分别接种于mrs种子培养基中，37℃下培养36h后转接至发酵培养基，37℃下200r/min培养48h，制得发酵液；取发酵上清液，冰浴条件下向粗酶液中加入60％的硫酸铵粉末，4℃条件下沉淀得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用tris
‑
hcl缓冲液复溶，4℃条件下透析得到浓缩酶液；用淀粉酶试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，货号c016
‑1‑
1,碘
‑
淀粉比色法)、乳糖酶试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，货号a082
‑
1,测乳糖酶)、蛋白酶试剂盒(购自购自上海哈灵生物科技有限公司，货号hl15021.2)分别测定29株菌的淀粉酶活力、乳糖酶活力、蛋白酶活力。获得综合性能较好的菌株15株。
58.(5)将上一步获得的凝结芽孢杆菌单菌落活化后制备种子培养液，然后发酵培养28h获得发酵培养液，于10000rpm离心5min得到发酵上清液。将发酵上清液与玉米赤霉烯酮(或黄曲霉毒素)的标准品混合，测定玉米赤霉烯酮(或黄曲霉毒素)的降解效果。获得性能最好的菌株bacillus coagulans，命名为bacillus coagulans bc2000。
59.实施例2 bacillus coagulans bc2000的鉴定
60.将bacillus coagulans bc2000，采用16srdna测序进行分类学分子鉴定，将测序结果在ncbi中进行blast比对，发现其16srdna碱基序列与芽孢杆菌(bacillus coagulans)的相似性最高，确定鉴定为凝芽孢杆菌。将bacillus coagulans bc2000于2021年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21621，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
61.实施例3 bacillus coagulans cgmcc no.21621菌剂的制备
62.1、液体菌剂的制备
63.方法一：
64.将凝结芽孢杆菌cgmcc no.21621单菌落分别接种于mrs种子培养基中，37℃下培养36h后转接至发酵培养基，37℃下200r/min培养40～56h，制得菌数为1.0
×
108‑
5.0
×
109cfu/ml发酵液。
65.方法二：
66.(1)斜面菌体活化
67.划线接种于斜面培养基(组成以g/l计为：蛋白胨10，牛肉膏3，nacl 5，麸皮10，琼脂15
‑
20，ph 7.0
‑
7.2)，30℃培养24
‑
48h；
68.(2)摇瓶及种子罐培养
69.用无菌水将斜面上的成熟菌泥刮洗下来，装入内装玻璃珠的无菌三角瓶中振荡分散菌泥，获得均匀的菌悬液，将菌悬液在80℃水浴中加热10分钟，以体积比1％
‑
10％的接种量接入三角瓶摇瓶培养；培养条件为：摇瓶转速200r/min；种子罐搅拌转速180r/min，通气量1m3/h，培养温度为40℃，培养时间为24h；培养基组成为以g/l计：麸皮10，酵母膏8，豆粕粉8，k2hpo
4 3，nacl 5，mnso4·
h2o 0.3，ph 7.0；
70.(4)发酵罐培养
71.种子培养液以体积比2％的接种量接入发酵罐；发酵培养基由碳源、氮源和无机盐组成，以g/l计：葡萄糖10，蛋白胨5
‑
20，k2hpo
4 3，nacl 5，mnso4·
h2o 0.3，碳酸钙2
‑
10，ph 7.0；发酵罐培养条件为：搅拌转速200r/min，通气量1m3/h，培养温度为40℃，培养时间为18
‑
48h；在培养过程中根据泡沫的高涨情况进行消泡；取发酵液进行镜检，当90％以上的菌体已形成芽孢时，即可放罐结束培养。
72.2、固体菌剂的制备
73.发酵罐培养的凝结芽孢杆菌bacillus coagulans cgmcc no.21621的菌液进行离心，将芽孢与干淀粉以重量比1:2混合，在40
‑
50℃干燥20
‑
24h，粉碎机粉碎，过筛，加入配料玉米芯粉或麦芽糊精，混合后制成固体菌剂，芽孢含量达1
×
109cfu/g以上。
74.实施例4 bacillus coagulans cgmcc no.21621性能测定
75.1、耐高温性能
76.干热条件下的耐高温性能：将实施例3制备的100g固体菌剂菌粉均匀平铺于托盘中，置于不同温度高温干燥箱中烘烤一定时间后，取出置于干燥器中自然冷却至室温，采用平板涂布法梯度稀释测定芽孢数，并计算存活率(存活率＝处理后的芽孢数/初始芽孢数)。结果如表1。
77.湿热条件下的耐高温性能：将实施例3方法二制备的液体菌剂在不同水浴温度下处理一段时间，进行芽孢计数，计算存活率。结果如表2。
78.结果显示，bacillus coagulans cgmcc no.21621在160℃干热条件下处理60min还能保持一定得存活，在100℃湿热条件下处理60min的存活率可以达到70％以上，在说明cgmcc no.21621的耐热性非常好。
79.表1
80.不同条件100℃40min100℃60min120℃40min140℃15min160℃15min160℃60min存活率98.42％95.07％79.05％82.18％38.16％1.03％
81.表2
[0082][0083]
2、耐胆盐性能
[0084]
人体小肠中胆汁盐的含量在0.03
‑
0.3％之间波动，只有具有较强耐胆汁盐能力的菌株才能顺利通过小肠而到达大肠。
[0085]
为了测定凝结芽孢杆菌cgmcc no.21621孢子在不同胆汁盐浓度下芽孢存活率，分别添加0.03％、0.1％、0.2％和0.3％的牛胆酸钠得mrs培养基，37℃放置24h后，进行芽孢计数。结果如表3所示。
[0086]
表3
[0087]
胆汁盐浓度0.03％0.10％0.20％0.30％芽孢存活率100％100％98.24％94.94％
[0088]
3、耐酸性能
[0089]
胃液ph的大小根据饮食结构不同而波动很大，通常ph为3左右，空腹食用酸性食品可达1.5，食用碱性食品可达4
‑
5。将实施例3方法二制备的凝结芽孢杆菌cgmcc no.21621的液体菌剂的菌体，适量加入到用0.1mol/l的盐酸调至ph分别为1.5、2.5、3.5、4.5的mrs培养基中，于37℃处理一段时间，测定存活率。
[0090]
结果显示，37℃处理2h或6h后，存活率如表4所示。说明凝结芽孢杆菌cgmcc no.21621的耐酸性能优良。
[0091]
表4
[0092]
不同条件ph 4.5ph 3.5ph 2.5ph 1.52h后存活率100.00％99.88％96.29％84.93％6h后存活率95.28％86.24％77.36％54.39％
[0093]
4、储存稳定性能
[0094]
取实施例3制备的固体菌剂，置于干燥、避光处，室温保存。分别于1、2、3、4、5、6、8、12、16、20，24以及36个月进行检测，计算芽孢存活率。结果如表5所示。
[0095]
表5
[0096]
检测时间1个月2个月3个月4个月6个月8个月12个月16个月24个月36个月存活率100.00％100.00％100.00％99.99％99.89％99.59％98.78％98.42％98.02％96.92％
[0097]
实施例5：bacillus coagulans cgmcc no.21621的发酵培养及性能测试
[0098]
将bacillus coagulans cgmcc no.21621活化后制备种子培养液，然后以体积比2％的接种量接入发酵罐；发酵培养基，以g/l计：葡萄糖10，蛋白胨5
‑
20，k2hpo
4 3，nacl 5，mnso4·
h2o 0.3，碳酸钙2
‑
10，ph 7.0；发酵罐培养条件为：搅拌转速200r/min，通气量1m3/h，培养温度为40℃，培养时间为36h。
[0099]
发酵培养结束后，10000rpm离心5min，取发酵上清液，测得发酵上清液中乳酸浓度达8.72g/l。
[0100]
将发酵上清液冷却，在冰浴条件下向其中加入60％的硫酸铵粉末，4℃条件下沉淀得粗酶液中的蛋白，得到沉淀物；所得沉淀物用tris
‑
hcl缓冲液复溶，4℃条件下透析得到浓缩酶液。测定浓缩酶液得淀粉酶、乳糖酶、蛋白酶活力(采用购自南京建成生物工程研究所的试剂盒，货号分别为c016
‑1‑
1、a082
‑
1、hl15021.2)，结果显示，淀粉酶活力可达302.43u/mgprot，乳糖活力28.56u/mgprot，蛋白酶活力为1.28u/mg/min。其中，u/mgprot代表每毫克组织蛋白每分钟水解10mg淀粉或1nmol乳糖定义为1个酶活单位；u/mg/min代表每单位酶每分钟产生0.01吸光值的升高变化。
[0101]
参照astrup等的方法测定发酵上清液中的纤溶酶活性，结果显示纤溶酶活性高达467.9u/ml。
[0102]
测定降解亚硝酸盐能力测定：发酵培养结束的菌液按1％接种量转接到添加了初始浓度为2.0mg/l的亚硝酸盐的mrs培养基中，在0、24、36、48h分别取发酵液1ml，离心。吸取0.4ml上清液至比色管中，加蒸馏水至5ml，加入格里斯试剂a、b等体积混合的显色剂0.2ml，混匀，沸水浴加热1min。于524nm波长处测吸光值，空白管调零。根据标准曲线计算发酵液中亚硝酸钠的浓度，24h、36h后分别测定亚硝酸钠的残留浓度以计算降解率，结果显示24h、36h的降解率达到88.5％、98.2％。
[0103]
实施例6：bacillus coagulans cgmcc no.21621应用于抑制病原菌
[0104]
取bacillus coagulans cgmcc no.21621菌液100μl接种于10ml mrs液体培养基中，于40℃恒温摇床培养24h，转数100rpm，得到指示菌液，备用。
[0105]
取致病菌株(大肠杆菌、粪肠球菌、变异链球菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌)菌液100μl分别接种于10ml液体lb培养基中，于37℃恒温摇床培养24h，转数100rpm，得到致病菌菌液，备用。
[0106]
将培养至对数生长期的致病菌菌液稀释至浓度为105cfu/ml的菌悬液，取菌悬液100μl均匀涂布于mrs固体培养基上，用镊子将无菌牛津杯竖于涂布有致病菌液的mrs固体培养基上，每个牛津杯中加入200μl指示菌液，以200μl无菌水作为空白对照，每个平皿上放置4个牛津杯，3个平行，一个对照，将平皿轻盖后正置于37℃恒温培养箱，培养48h后观察。结果显示，bacillus coagulans cgmcc no.21621对上述致病菌均具有抑制作用，平皿上均出现了明显的抑菌圈。
[0107]
实施例7：bacillus coagulans cgmcc no.21621应用于降解真菌毒素
[0108]
将bacillus coagulans cgmcc no.21621活化后制备种子培养液，然后以体积比2％的接种量接入发酵罐；发酵培养基，以g/l计：葡萄糖10，蛋白胨5
‑
20，k2hpo
4 3，nacl 5，mnso4·
h2o 0.3，碳酸钙2
‑
10，ph 7.0；发酵罐培养条件为：搅拌转速200r/min，通气量1m3/h，培养温度为40℃，培养时间为36h。发酵培养结束后，得到发酵培养液；发酵培养液于10000rpm离心5min得到发酵上清液。
[0109]
降解玉米赤霉烯酮的应用：将900μl发酵上清液与100μl玉米赤霉烯酮(zearalenone，zea)标准品混合，使zea标准品终浓度为50μg/ml；同时，以含相同终浓度zea的培养基作为对照，分别在反应0h、1h、2h、4h、6h、8h取样，测定zea浓度，计算zea的降解率(zea降解率(％)＝(初始zea浓度
‑
取样后测得的zea浓度)/初始zea浓度
×
100％)。结果显示，1h、2h、4h后zea的降解率分别为95.2％、98.6％、100％。
[0110]
降解黄曲霉毒素的应用：将含有黄曲霉毒素的花生粕样品粉碎后过40目筛混合均
匀，采用gb/t 14699.1
‑
2005方法采样并称取5.00g置于玻璃容器中，四层纱布报纸封口经高温高压灭菌锅121℃、20min灭菌处理。将灭菌处理过的花生粕转移至发酵皿中，向上述处理后的样品加入1ml的bacillus coagulans cgmcc no.21621的发酵培养液，再加入适量的无菌蒸馏水，搅拌混合均匀后于38℃下进行恒温固态发酵，在发酵48h后即得固态发酵后脱除四种黄曲霉毒素后样品。收集发酵完成的样品，干燥后分别将每份花生粕导入离心管内，加入乙腈
‑
水溶液(70 30)进行提取并冲洗发酵皿一并导入离心管内，避免因粕中毒素分布不均对实验结果的影响；混匀后超声处理10min，振荡30min，8000r/min下离心10min，取过滤后上清液过固相净化柱，收集液体后进行冷冻浓缩，用甲醇
‑
水溶液(50 50)复溶过滤膜后，上lc
‑
ms/ms检测。色谱条件：色谱柱：beh c18柱(2.1mm
×
100mm，1.7μm)流动相a为乙腈，b为甲酸铵溶液，柱温：45℃，流速：0.3ml/min，进样量：5μl；采用上述方法检测脱除黄曲霉毒素后的样品中四种毒素的残留量，并计算出相应的四种黄曲霉毒素脱除率。结果显示，黄曲霉毒素aftb1、aftb2、aftg1和aftg2的脱除率分别为：72.4％、39.3％、52.82％、56.76％。
[0111]
实施例8：bacillus coagulans cgmcc no.21621应用于饲料
[0112]
向谷物或饲料原料中，接种2％w/v(每100g接种2ml)浓度107cfu/ml
‑
108cfu/ml的bacillus coagulans cgmcc no.21621悬液或接种1％w/w(每100g接种1g)浓度107cfu/g
‑
108cfu/g的bacillus coagulans cgmcc no.21621固体菌剂，在培养温度为42℃下进行固态发酵48h。可有效降低或者避免谷物或饲料原料中的真菌毒素。
[0113]
实施例9：bacillus coagulans cgmcc no.21621应用于仔猪饲料
[0114]
材料与方法如下：
[0115]
(1)对照组ⅰ：未添加任何益生菌的饲料；
[0116]
(2)对照组ⅱ：添加200g/t市售凝结芽孢杆菌产品的饲料；
[0117]
(3)试验组ⅰ：添加200g/t凝结芽孢杆菌bacillus coagulans cgmcc no.21621的饲料；
[0118]
(4)试验组ⅱ：添加200g/t凝结芽孢杆菌bacillus coagulans cgmcc no.21621并减少0.02％酸化剂的饲料。
[0119]
试验对象：仔猪，初始体重22kg。
[0120]
结果如表6所示。结果显示，试验组ⅰ和ⅱ的仔猪生长、料肉比和采食量均显著优于对照组ⅰ。与此同时，减少0.02％酸化剂(试验组ⅱ)后，试验组ⅰ和ⅱ日增重、料肉比和采食量三项指标无显著性差异。
[0121]
表6
[0122][0123]
注：同行数据肩标字母相同表示差异不显著(p>0.05)，不同字母表示差异显著(p<0.05)
[0124]
实施例10：bacillus coagulans cgmcc no.21621应用于肉鸡饲料
[0125]
材料与方法如下：
[0126]
(1)对照组：未添加任何益生菌饲料；
[0127]
(2)试验组：添加150g/t凝结芽孢杆菌bacillus coagulans cgmcc no.21621的饲料；
[0128]
试验对象：白羽肉鸡，初始体重55g。
[0129]
结果如表7所示。结果显示，试验组生长、料肉比、采食量和成活率均优于对照组。
[0130]
表7
[0131][0132][0133]
注：同行数据肩标字母相同表示差异不显著(p>0.05)，不同字母表示差异显著(p<0.05)
[0134]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。