一种光催化生物大分子化学修饰的方法与流程

1.本发明属于生物化学领域，涉及一类巯基
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氧化硫ylide点击反应，具体来说是一种光催化生物大分子化学修饰的方法。


背景技术：

2.生物大分子的化学修饰在化学生物学、分子生物学和药物研发等研究领域中有重要作用。其中，多肽、蛋白质和核酸与有机小分子药物和探针的偶联反应是蛋白质组学、药物化学和生物技术研究的强大实验工具。例如，抗体
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药物偶联物的成功开发有赖于可靠的生物正交反应的研究。传统的蛋白质化学修饰方法主要集中于针对半胱氨酸和赖氨酸残基的化学反应。近年来，新型的蛋白质修饰化学聚焦于传统条件无法实现的氨基酸残基的修饰，或极高效的修饰化学反应。例如，可见光诱导的温和条件下的蛋白质修饰化学反应。这种光氧化还原催化的历程通过产生自由基来构建独特的化学键，提供了非传统的生物大分子功能化的策略。
3.氧化硫ylide是一类电两性分子，在水溶液中可以长期稳定存在。在前人的研究中，通常需要贵金属或质子酸催化其与亲核基团的反应，存在成本较高、反应效率不理想、所需反应条件较苛刻等问题。因此，氧化硫ylide活性基团难以用于在生理条件下蛋白质的高效、选择性化学修饰。


技术实现要素：

4.针对生物大分子的化学选择性修饰技术和应用的需求，本发明提供了一种光催化生物大分子化学修饰的方法，所述的这种光催化生物大分子化学修饰的方法要解决现有技术中氧化硫ylide活性基团难以用于在生理条件下蛋白质的高效、选择性化学修饰的技术问题。
5.本发明提供了一种光催化生物大分子化学修饰的方法，包括如下反应步骤：
6.1)在一个容器中，加入反应溶剂，所述的反应溶剂选自水、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、二甲基亚砜或者n,n
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二甲基甲酰胺中的任意一种或者它们任意两种的混合溶剂，所述的反应溶剂的ph范围为2至13；
7.2)然后加入所修饰的生物大分子，使得生物大分子溶解在反应溶剂中；所述的生物大分子为多肽、蛋白质或者核酸中的任意一种；
8.3)再加入反应底物氧化硫ylide类化合物及其衍生物，所述的氧化硫ylide类化合物及其衍生物的投料量为生物大分子的1当量至100当量；所述的氧化硫ylide类化合物及其衍生物的结构式如下
[0009][0010]
4)加入有机光氧化还原催化剂，所述的催化剂在反应溶剂中的浓度为10微摩尔每升至100微摩尔每升；所述的有机光氧化还原催化剂为核黄素类似物；所述的核黄素类似物有机光氧化还原催化剂，其结构式如下；
[0011][0012]
5)采用蓝光光源光照，波长为430至480nm，功率为10至45w；
[0013]
6)反应时间为1分钟至1小时，反应温度为37摄氏度；完成生物大分子的化学修饰。
[0014]
具体的，所述的乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、二甲基亚砜、n,n
‑
二甲基甲酰胺为有机极性溶剂。
[0015]
本发明的一种光催化生物大分子化学修饰的方法，以氧化硫ylide类化合物为底物，在有机光催化剂存在下，通过合适波长的可见光的照射，用于化学修饰多肽、蛋白质和核酸等生物大分子。本发明使用无毒的有机化合物为催化剂，可见光为光源，适合实验室和工业化多肽、蛋白质和核酸药物的化学修饰和改造。
[0016]
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明适用于生物大分子的离体或细胞内的化学修饰，通过光催化在短时间内实现反应的快速进行。本发明使用的反应底物和光催化剂容易获得并且毒性较小，适合实验室和工业化生产，并适合实验室和工业生物大分子研究应用。
附图说明
[0017]
图1氧化硫ylide化合物的一般合成方法。
[0018]
图2氧化硫ylide与不同蛋白质的离体反应的荧光显色蛋白胶图。
[0019]
图3氧化硫ylide在不同时间和浓度梯度条件下与蛋白质反应的荧光显色蛋白胶图。
[0020]
图4氧化硫ylide与细胞内蛋白质的反应的免疫共沉淀蛋白胶图。
具体实施方式
[0021]
以下实施例用于进一步详细说明本发明，但本发明绝非仅限于此。
[0022]
实施例1
[0023]
1.氧化硫ylide的制备
[0024][0025]
在圆底烧瓶中加入1.38g 4
‑
羟基苯甲酸并用20ml乙醇溶解。将1g氢氧化钠溶于20ml水中，加入反应体系。磁力搅拌10分钟后，加入1.2g 3
‑
溴丙炔，并继续在室温下搅拌反应24小时。反应结束后，旋转蒸发去除有机溶剂，使用2m盐酸水溶液调节ph至3，有大量白色沉淀析出。减压抽滤，水洗滤饼，真空干燥所得白色固体，即为产物4
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炔丙氧基苯甲酸(1.6g，收率91％)。1h nmr(400mhz,methanol
‑
d4)δ8.06
–
7.98(m,2h),7.12
–
7.05(m,2h),4.85(d,j＝2.3hz,2h),3.03(t,j＝2.4hz,1h).
13
c nmr(101mhz,methanol
‑
d4)δ168.26,161.58,131.36,123.43,114.26,77.83,75.91,55.36.
[0026]
氮气保护下，在圆底烧瓶中加入1.5g 4
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炔丙氧基苯甲酸并用20ml二氯甲烷溶解，加入0.5mldmf作为催化剂，冰浴冷却。随后，使用注射器逐滴加入3.2g草酰氯后，使反应体系温度缓慢升至室温，并继续反应3小时。反应结束后，在干燥条件下，减压蒸除反应溶剂，即获得酰氯中间体备用。
[0027]
在另一个圆底烧瓶中加入5.6g三甲基碘化亚砜和5.7g叔丁醇钾。氮气保护下，加入50ml四氢呋喃，并将反应混合溶液加热至回流，保持3小时。反应结束后，将该反应体系冰浴冷却，并使用20ml四氢呋喃溶解上述酰氯中间体，逐滴加入该体系，升至室温后继续反应6小时。反应结束后，旋转蒸发去除溶剂，加入30ml水稀释所得粘稠混合物。使用30ml
×
3二氯甲烷萃取该水溶液。合并有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发浓缩，使用硅胶柱分离得到目标产物4
‑
炔丙氧基苯甲酰硫ylide a(1.7g，收率80％)。1h nmr(400mhz,chloroform
‑
d)δ7.80
–
7.71(m,2h),6.99
–
6.91(m,2h),4.91(s,1h),4.71(d,j＝2.4hz,2h),3.48(s,6h),2.52(t,j＝2.4hz,1h).
13
c nmr(101mhz,chloroform
‑
d)δ181.79,159.75,132.58,128.44,114.44,78.34,75.95,67.67,55.94,42.72.
[0028]
2.氧化硫ylide与离体蛋白质的反应
[0029]
lysozyme(溶菌酶)溶解在pbs中浓度30um，取10μl在0.6ml ep管中，加入ylide a(100um)和催化剂核黄素磷酸酯钠盐(10um)，在440纳米蓝光下照1分钟。之后利用“click”反应给蛋白标记荧光标签，具体做法是在体系中体系加入cuso4(1mm)，tecp(1mm)，tbta(10mm)，5
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tamra
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n3(100um)，整个反应体系在37℃孵育2小时。反应完毕用loading buffer
固定，之后用15％page胶电泳分离，546纳米发射波长观测荧光。同时用经典方法iaa对比，传统的iaa与蛋白孵育2小时可以修饰蛋白。同样的过程用于修饰bsa(牛血清蛋白)。结果如图2所示。在催化剂存在和光照条件下，lysozyme和bsa都有明显的反应条带出现，即修饰反应顺利发生了。并且，相对传统iaa修饰方法，硫ylide光反应体系的反应条带强度更强。证明该方法可以用更短的时间达到更好的蛋白修饰效果，同时蓝光可以作为一个开关控制反应的进行。可以作为一种经典方法的替代进行蛋白修饰。
[0030]
同时用lysozyme作为模板筛选催化剂的浓度与440纳米光照时间，优化蛋白修饰过程的反应时间和浓度。结果如图3所示。反应条带在1分钟时就已经达到饱和，并且会随浓度增高反应条带变强。结果证明了440纳米蓝光照射1分钟就能达到很好的修饰效果，并且ylide的浓度越高反应效果会更好。
[0031]
3.氧化硫ylide与细胞内蛋白质的反应
[0032]
本方法选用较为常用的hela细胞作为模式细胞。用直径10cm培养皿，10％dmem培养基培养hela细胞，初始密度30％，37℃培养12小时。ylide(1mm)分别和核黄素(catalyst a,100um)、核黄素磷酸酯钠盐(catalyst b,100um)、核黄素四丁酯(catalyst c,100um)溶于10％dmem培养基，并用此培养基给细胞换液，37℃培养12小时，之后用440纳米蓝光照射细胞1分钟。
[0033]
收集细胞重悬于pbs中，超声裂解细胞，超速离心取上清液，bca法定浓度。取含蛋白10微克的裂解液，利用“click”反应给蛋白标记biotin标签，具体做法是在体系中体系加入cuso4(1mm)，tecp(1mm)，tbta(10mm)，biotin
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n3(100um)，整个反应体系在37℃孵育2小时。反应完毕用loading buffer固定，之后用10％page胶电泳分离，将page胶中的蛋白转移到pc膜上，将体积百分比浓度为5％的脱脂牛奶溶于tbst中封闭pc膜1小时，之后在4℃将pc膜与anti
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biotin孵育12小时，凝胶成像仪检测。结果如图4所示。在三种不同催化剂存在下，都出现了反应条带，证明硫ylide反应体系在活细胞中的反应顺利发生了。其中，催化剂核黄素磷酸酯钠盐和核黄素四丁酯存在下的反应更为明显。
[0034]
综合以上实验结果可知，光催化的氧化硫ylide点击反应体系只需1分钟的光照反应时间，就可以达到传统蛋白质半胱氨酸修饰方法的理想效果。因此，本发明所述的新反应体系是一类相比传统方法更高效的蛋白质修饰技术。并且细胞内的反应情况也显示了较多的生物素免疫共沉淀的条带，证明了该反应体系良好的生物相容性和应用前景。