TmLPCAT基因用于提高三酰甘油sn-2位超长链脂肪酸含量的应用的制作方法

tmlpcat基因用于提高三酰甘油sn
‑
2位超长链脂肪酸含量的应用
技术领域
1.本发明属于基因功能和作物基因工程领域，具体为一种基因、基因编码的酶在三酰甘油sn
‑
2位脂肪酸合成中的功能及其应用。


背景技术：

2.芥酸，化学名称为顺
‑
13
‑
二十二碳一烯酸(13
‑
docosenoic acid,(13z)
‑
)，是一种超长链单不饱和脂肪酸，主要存在于十字花科(cruciferae)以及金莲花科(tropaeolaceae)的种子储藏油脂中。芥酸以其可再生，用途广泛，附加值高，市场需求量大等特点，在现代工业诸多领域正显示出越发重要的作用。目前，作为芥酸的主要生产国，我国的芥酸年产量可达到世界总产量的三分之一左右。目前芥酸生产主要依赖于从十字花科油料作物种子油中提取，这些作物的种子油中芥酸含量多在30
‑
50％。因此，提高十字花科油料作物中芥酸的百分比对于降低芥酸生产成本，增加种植者及相关加工企业的收入有着极为重要的意义。
3.种子油90％的成分为三酰甘油，甘油骨架上依次有sn
‑
1、sn
‑
2和sn
‑
3三个位置，连接脂肪酸形成三酰甘油(图1)。但在包括油菜在内的十字花科油料作物中，在种子三酰甘油的sn
‑
1和sn
‑
3位置均可积累芥酸，但在sn
‑
2位几乎不能结合包括芥酸等超长链脂肪酸。发明人对甘蓝型油菜种子三酰甘油进行检测，也证明这一点(图2)。这成为通过传统育种手段改良芥酸含量无法突破的瓶颈。曾有研究者从荷包蛋花(limnanthes douglasii)中克隆到溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase，检查lpaat)基因，可以用来提高油菜种子三酰甘油sn
‑
2位芥酸的合成(lassner et al.1995)。溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(lysophosphatidylcholine acyltransferase，简称lpcat)可向溶血磷脂酰胆碱的sn
‑
2位转移酰基形成磷脂酰胆碱，之后经二酰甘油影响三酰甘油的sn
‑
2的酰基种类和含量。在一些植物中，lpcat在三酰甘油的积累中扮演着非常重要的角色。新合成的酰基
‑
coa，绝大部分是通过lpcat形成磷脂酰胆碱，而不是通过肯尼迪途径完成三酰甘油的装配。贮藏组织中新形成的磷脂酰胆碱大部分经二酰甘油最后形成三酰甘油，但至今未见任何关于lpcat可以提高sn
‑
2位芥酸的报道或发明。
4.旱金莲(tropaeolum majus)是一种金莲花科较为稀有的观赏植物，原产于智利。在其种子贮藏的三酰甘油中，芥酸占有非常高的比例。与油菜等无法将芥酸有效装配至甘油sn
‑
2位置不同的是，旱金莲种子贮藏的三酰甘油中sn
‑
1、sn
‑
2以及sn
‑
3三个位置的芥酸含量都十分高，可以形成三芥酰甘油。发明人也证明旱金莲种子三酰甘油sn
‑
2位置的芥酸含量可超过80％(图2)。但之前有研究证明，旱金莲发育种子中lpaat酶不具有芥酸底物偏好性。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，揭示旱金莲种子中tmlpcat基因(旱金莲lpcat基因)及其编码
蛋白在芥酸积累过程中的功能，以及应用于油料作物提高种子三酰甘油中sn
‑
2位上芥酸的含量。
6.为此，本发明提供旱金莲lpcat基因用于提高植物中三酰甘油中sn
‑
2位上超长链脂肪酸含量的应用，所述旱金莲lpcat基因选自以下一种的序列：seq id no.1所示序列；与seq id no.1具有90％以上同源性的基因。
7.本发明还提供了含有所述旱金莲lpcat基因的表达载体。
8.可选的，所述表达载体为pha
‑
tmlpcat
‑
dsred
‑
pk7wg2d，其中，pha为phaseolin启动子，tmlpcat为权利要求1所述旱金莲lpcat基因，dsred为荧光蛋白标记基因表达盒，pk7wg2d为表达载体骨架。
9.本发明同时提供了含有所述旱金莲lpcat基因的细菌细胞。
10.可选的，所提供的细菌细胞为含有所述旱金莲lpcat基因的大肠杆菌和农杆菌细胞。
11.进一步，所述旱金莲lpcat基因编码的酶用于提高作物中三酰甘油中sn
‑
2位上超长链脂肪酸含量的应用，所述旱金莲lpcat基因编码的酶选自以下一种序列：seq id no.2所示序列；与seq id no.2具有90％以上同源性的序列。
12.本发明在模式植物拟南芥高芥酸型株系种子中，揭示了该基因有助于三酰甘油中sn
‑
2芥酸积累的功能。由于同属十字花科，拟南芥与目前主要油料作物甘蓝型油菜的油脂代谢途径十分相似，同时高芥酸品系相较于野生型能更好地反应芥酸在三酰甘油sn
‑
2位置的积累变化。因此在拟南芥高芥酸型品系种子中验证该基因功能，对于提高相应十字花科油料作物三酰甘油sn
‑
2位置的芥酸积累方面有重要的借鉴意义。
13.本发明在大宗油料作物甘蓝型油菜高芥酸品系种子中进一步揭示了该基因有助于三酰甘油中sn
‑
2芥酸积累的功能。本发明首次利用旱金莲tmlpcat基因在甘蓝型油菜三酰甘油sn
‑
2位上装配上大量芥酰基，打破了甘蓝型油菜自然条件下sn
‑
2位上几乎不能装配芥酰基的瓶颈，为油菜高芥酸育种提供了新的方法和种质材料。
14.本发明在新型油料作物亚麻荠种子中验证了该基因有助于三酰甘油sn
‑
2芥酸积累的功能。亚麻荠同属十字花科，其生长周期短，抗性强，耐旱耐盐碱，可在贫瘠土地上广泛种植。本发明首次利用旱金莲tmlpcat基因在亚麻荠三酰甘油sn
‑
2位上装配上芥酰基，打破了亚麻荠自然条件下sn
‑
2位上几乎不能装配芥酰基的瓶颈，为亚麻荠的开发利用提供了新的方向。
附图说明
15.图1三酰甘油的结构和甘油骨架sn位置；甘油骨架有3个羟基可以与脂肪酸通过酯键链接，甘油骨架的3个位置从上到下分别命名为sn
‑
1，sn
‑
2和sn
‑
3，r1、r2、r3分别表示脂肪酸的碳氢链，本发明涉及的tmlpcat基因编码的酶，可以在溶血磷脂酰胆碱sn
‑
2位置转移脂肪酰基，进而影响三酰甘油sn
‑
2的脂肪酸种类和含量。
16.图2为甘蓝型油菜和旱金莲种子三酰甘油sn
‑
2位置上脂肪酸组分(％)；其中：横坐标表示脂肪酸成分，c表示碳链，冒号前的数字代表碳链长度，冒号后的数字代表双键数量(例如c22:1表示碳链长度为22碳、双键数目为1的脂肪酸；c22:1也就是本发明中的芥酸)；纵坐标数值表示脂肪酸百分含量。
17.图3为拟南芥高芥型株系对照(he)和转基因拟南芥植株种子三酰甘油sn
‑
2位置上脂肪酸组分(％)；其中：横坐标表示脂肪酸成分，纵坐标数值表示脂肪酸百分含量。图中灰色柱子表示拟南芥高芥型对照种子三酰甘油sn
‑
2位置上脂肪酸百分比，其它柱子依次为种子特异性phaseolin启动子驱动tmlpcat基因的三个转基因拟南芥株系at1
‑
at3种子三酰甘油sn
‑
2位置的脂肪酸百分比。
18.图4为高芥酸甘蓝型油菜对照(control)和转基因植株种子三酰甘油sn
‑
2位置上脂肪酸组分(％)；其中：横坐标表示脂肪酸成分，纵坐标数值表示脂肪酸百分含量。
19.图5为亚麻荠野生型(wt)和转基因亚麻荠植株种子三酰甘油sn
‑
2位置上脂肪酸组分(％)；其中：横坐标表示脂肪酸成分，纵坐标数值表示脂肪酸百分含量。
20.以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
21.除非另有说明，本文中的术语或方法根据相关领域普通技术人员的常规认识或已知方法实现。
22.以下实施例中，仅对相对特殊的研究方法给以详细介绍。常规的试验方法以及所涉及的常规生化试剂未进行详细描述，具体参考《分子克隆实验指南》(j.莎姆布鲁克等著)等研究方法。
23.以下实施例中所述三酰甘油sn
‑
2位置上脂肪酸组分(％)为三酰甘油sn
‑
2位置上各脂肪酸占该位置上总脂肪酸的百分比。
24.以下实施例所用植物种子来自实验室创建的植物试验材料或馈赠育种材料(见下文说明)。
25.实施例一：植物种子三酰甘油sn
‑
2位置上脂肪酸测定
26.一、甘蓝型油菜和旱金莲种子中总脂的提取及三酰甘油的分离
27.(一)分别取50mg甘蓝型油菜(陕西省杂交油菜中心自交系)、旱金莲种子(商业购买)充分研磨后转移至螺纹口玻璃试管内；加入氯仿:甲醇＝2:1溶液3ml，涡旋震荡30s，静置15min；之后加入1ml 0.9％氯化钠溶液，使试管内液体分层，再次涡旋振荡后离心(1500r，3min)，取下清(氯仿相)并转移至另一试管内，氮气吹干，此时试管底部残余即为种子中所提取的总脂；
28.(二)将提取的总脂溶于50μl氯仿，将其在提前烘干好的g60 tlc硅胶板上进行展样，展样溶剂体系为正己烷:乙醚:乙酸(70:30:1)，展样结束后使用樱草黄进行染色；tlc板自然风干后将其置于紫外灯下，根据标样(大豆油用氯仿稀释1000倍)标出三酰甘油(tag)所对应的条带；回收标出的tag条带，置于试管内，使用600μl正己烷：乙醚(1:1)溶液萃取硅胶粉中的tag，重复2次后合并；
29.二、代表sn
‑
2位置的2
‑
mag的获取
30.(一)取1ml上述步骤获取的tag样品置于试管内，加入0.8ml反应缓冲液(50mm硼砂，5mm cacl2，ph 7.8)和200μl脂肪酶(novocata)，在摇床内(37℃，250r/min)反应4
‑
6h；
31.(二)加入3ml氯仿：甲醇(1:1)以停止反应；涡旋震荡后静置10min，加入1ml 0.9％氯化钠溶液，使试管内液体分层，离心(1500r，3min)取下清(氯仿相)，转移至另一试管内，氮气吹干后加入100μl氯仿溶解；
32.(三)采用原展样溶剂系统正己烷：乙醚：乙酸(70:30:1)，对萃取后的产物进行展样，并使用樱草黄进行染色；将染色后的tlc平板放置在紫外成像仪中，并根据标准品确定相应条带位置(分为4条，从上到下依次为tag，ffa，1.2
‑
dag或2.3
‑
dag，2
‑
mag)并进行标记，用刀片将2
‑
mag条带刮下回收，加入900μl氯仿：甲醇(2:1)溶液，涡旋振荡后加入300μl 0.9％氯化钠溶液使其分层，转移下清液至1.5ml气相色谱进样瓶中并在氮气下吹干。
33.三、脂肪酸组分分析
34.(一)在1.5ml气相进样瓶中加入200μl甲酯化反应液(含有5％浓h2so4的ch3oh溶液)，85℃水浴2h；取出反应后的进样瓶，静置并待其冷却至室温后加入200μl的0.9％nacl溶液以停止反应；加入100μl正己烷，充分混匀后于常温，1500rpm，离心10min；取上清，置于已用正己烷润洗过的衬管中，测定脂肪酸组分；
35.(二)采用毛细管色谱柱db
‑
23(agilent，30m)对fames进行分析，气相色谱分析参数为：毛细管柱箱起始温度50℃，保持60s，随后升温至175℃，升温速率为35℃/min，继续保持60s；升温至230℃，升温速率4℃/min，保持5min；氢气流速40ml/min，空气流速40ml/min，载气分流比n2:h2＝10:1；进样量4μl。
36.甘蓝型油菜种子和旱金莲种子中sn
‑
2位脂肪酸组分分析如图2所示。
37.实施例二：tmlpcat基因在拟南芥种子三酰甘油sn
‑
2位的功能分析
38.一、tmlpcat基因克隆
39.(一)将开花25天后的旱金莲种胚按照trizol
tm
试剂盒(invitrogen)提供的步骤提取总rna，并使用含有gdna消化酶的primescript
tm rt试剂盒(takara)进行反转录成cdna，操作于冰上进行；
40.(二)挖掘旱金莲发育种子的转录组数据，根据筛选到的旱金莲lpcat转录本设计引物，以tmlpcat
‑
f：5
′‑
atggacctcgacatggaa
‑3′
和tmlpcat
‑
r：5
′‑
tcactgttcttttctcgctt
‑3′
为引物，以上述得到的cdna为模板，扩增出tmlpcat基因的编码区；
41.(三)序列连接克隆载体及测序鉴定。扩增片段克隆到含有attl1和attl2的puc57入门载体中，有目的片段的大肠杆菌进行测序，目的片段测序结果见seq id no.1。
42.二、植物种子特异表达载体构建及农杆菌制备
43.该实施例所用载体为pha
‑
dsred
‑
pk7wg2d，由本技术人实验室构建，该载体骨架为通用表达载体pk7wg2d，其自带的35s启动子被替换为种子特异性的phaseolin启动子(pha)，同时连接上dsred荧光蛋白标记基因表达盒。
44.通过lr酶(lrii mix)催化入门载体和目标载体反应，反应条件：25℃反应1h，得到含有tmlpcat序列的表达载体pha
‑
tmlpcat
‑
dsred
‑
pk7wg2d；
45.取1μl表达载体加入到20μl农杆菌感受态细胞中(gv3101，购自唯地生物)，充分混合后冰上静置5min，接着液氮速冻5min，取出后在37℃水浴5min，再置于冰上2min。加入500μl培养基，于28℃摇床中培养4
‑
6h后均匀涂布于含有相应抗生素的固体培养基上，待菌落长出后利用tmlpcat
‑
f/r引物进行鉴定，获得正确菌种培育后保存备用。作为该实施例的替换性方案，也可将上述表达载体加入大肠杆菌中。
46.三、拟南芥高芥株系的转化
47.(一)拟南芥高芥株系(he，由申请人实验室创建)的转化采用花序浸蘸转化法(clough s j,bent a f.floral dip:a simplified method for agrobacterium
‑
mediated transformation of arabidopsis thaliana[j].the plant journal,1998,16(6):735
‑
743)，将含有表达载体的农杆菌在28℃的条件下培养至分光值od600达到0.8
‑
1.0之间，4000r/min离心10min，弃上清后用5％蔗糖溶液重悬并加入0.05％silwetl
‑
77，花序浸蘸农杆菌菌液后，培养约3周后收获种子。
[0048]
(二)利用荧光标记蛋白挑选出转基因阳性种子。由于荧光标记蛋白dsred和目标基因一同构建在表达载体上，且共同在植物体内表达，因此利用波长为543nm的绿色光下透过红色滤光片观察，可将发出红色荧光的阳性种子挑出。
[0049]
四、转化株系种子三酰甘油sn
‑
2位芥酸分析
[0050]
选择转化得到3个纯合转化株系，分别命名为at1，at2，at 3。种子采收后采用实施例一的方法测定三酰甘油sn
‑
2位脂肪酸成分，sn
‑
2位置所含芥酸百分比结果见附图3。结果表明，在tmlpcat拟南芥转化株系种子三酰甘油的sn
‑
2位置的芥酸明显积累，从野生型中的0.3％升高到1％以上，提升最多的株系at1升高至3.8％，提升幅度超过10倍。
[0051]
实施例三：tmlpcat在甘蓝型油菜和亚麻荠中的应用
[0052]
一、甘蓝型油菜转化
[0053]
(一)甘蓝型油菜的转化采用组织培养法，将甘蓝型油菜种子lc(芥酸含量约50％，陕西省杂交油菜中心选育的自交系)消毒灭菌后，播种到培养基上，25℃暗培养5天。切取已萌发的油菜幼苗下胚轴，长度约为1cm；将切好的外植体放到活化完成含有tmlpcat表达载体的农杆菌液培养皿中，侵染15min；转移至愈伤组织诱导期培养基(cim)上，25℃暗培养两天后转到光下培养；3周后转入发芽诱导培养期培养基(sim)中，每2周继代一次，直到出现绿芽；出芽后转入根诱导培养基(rim)中，培养2
‑
4周至生根。
[0054]
(二)利用荧光标记蛋白挑选出转基因阳性种子，在油菜种子的子叶中观测到荧光，以便挑选阳性株系，选择3个油菜转基因t2株系，分别命名为bn1
‑
3，种子用于测定脂肪酸成分。
[0055]
(三)转化株系种子三酰甘油sn
‑
2位芥酸分析
[0056]
采用上述实施例一方法测定三酰甘油sn
‑
2位置所含芥酸百分比，结果见附图4。结果表明，在tmlpcat甘蓝型油菜转化株系种子三酰甘油的sn
‑
2位置的芥酸大量积累，从对照的0.5％提高到2.8％以上，提升最多的株系bn2升高到接近6％，提升近12倍。
[0057]
二、亚麻荠转化
[0058]
(一)亚麻荠品种suneson(美国蒙大拿州立大学馈赠)的转化采用花序浸蘸转化法。将含有表达载体的农杆菌(gv3101)在28℃的条件下培养至分光值od600达到0.8
‑
1.0之间，4000r/min离心10min，弃上清后用5％蔗糖溶液重悬并加入0.05％silwetl
‑
77。花序浸蘸后培养约5
‑
6周即可收获种子。
[0059]
(二)利用荧光标记蛋白挑选出转基因阳性种子
[0060]
选择转化得到转化t2株系，根据红色荧光剔除非转基因种子，转基因种子和野生型种子用于测定脂肪酸成分。
[0061]
(三)转化株系种子三酰甘油sn
‑
2位芥酸分析
[0062]
采用实施例一所述方法测定野生型和转化株系三酰甘油sn
‑
2位置所含芥酸百分比。结果表明，在tmlpcat亚麻荠转化株系种子三酰甘油的sn
‑
2位置的芥酸在检测的几个株系中仅有一株提高，这可能与亚麻荠中芥酸本底含量较低有关，芥酸提高的转基因株系中，
芥酸积累量约为1.1％，与野生型0.7％相比提高约63.8％，如图5所示。图5中的wt和cs分别表示亚麻荠野生型(suneson)和tmlpcat转基因株系。