SFV-helper质粒、pSFVCs-LacZ病毒样颗粒及其制备方法和应用与流程

sfv
‑
helper质粒、psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种sfv
‑
helper质粒、psfvcs
‑
lacz 病毒样颗粒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.糖香酶，亦称糖香水解酶，是一大类可水解糖香键的酶类的总称，可用于寡糖的合成，还可用于炫基糖香以及芳香基糖香的合成，在催化氨基酸、多肽、生物碱和抗生素等物质的糖基化方面也起到重要的作用，在医药和食品领域具有广泛的应用。β
‑
半乳糖香酶是一类重要的糖香酶，由lacz基因编码的β
‑
半乳糖苷酶广泛存在于微生物、动物和植物中。
3.rna复制子是衍生于rna病毒基因组并能自主复制的rna。最常用于开发复制子的病毒是披膜病毒科中的甲病毒(alphavirus),如辛德比斯病毒 (sindbis virus,sin)、塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)以及委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelan equine encephalitis virus,vee)；除甲病毒外，还有黄病毒、小rna病毒、副粘病毒、杯状病毒等。被改造用于rna复制子的表达载体本文以甲病毒(塞姆利基森林病毒)载体为例，阐明rna复制子疫苗的基本原理和特点。甲病毒是一类正链rna病毒(75)，基因组长约11
‑
12kb，5’端有帽子结构，3’有多聚腺苷酸结构，有两个开放阅读框，可以编码4个非结构蛋白(ns1，ns2，ns3，ns4)和5个结构蛋白(core，e3，e2，6k， e1)。甲病毒基因组中位于ns3和ns4间存在一个终止密码子，有时候密码子通读时会产生一个更大的多聚蛋白p1234。但是在某些甲病毒基因组中，如 sinv和o’n yong
‑
nyong virus(onnv)，此终止密码子被arg或cys密码子替换，因此不能产生p123多聚蛋白。而这一现象很有可能是一种潜在的发病机制。多聚蛋白p1234在ns2蛋白的水解作用下，自切割产生p123和ns4 蛋白。同时，p123和ns4蛋白可以作为病毒复制酶，以基因组rna为模板合成负链rna。此后，负链rna亦可以作为模板合成正链的基因组rna和亚基因组rna(subgenomic rna)。随后，p123多聚蛋白被水解产生ns1和p23蛋白，导致负链rna合成减少，而正链基因组rna合成增多。p23多聚蛋白的半衰期极短，仅为数秒，而后被水解形成ns2和ns3蛋白。此时，以单体形式存在的ns1、ns2、ns3、ns4蛋白结合形成复制复合体，进一步促进病毒基因组和亚基因组rna的复制。
4.本发明以塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv)为载体，它包括两个独立的rna分子,一个rna分子是包含插入了rna复制子载体。另一个 rna分子是辅助rna。如何利用塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv) 为载体构建一种包装体系，使其能够高效表达β
‑
半乳糖苷酶，对β
‑
半乳糖香酶在食品领域的应用具有重大的意义。然而，如何利用塞姆利基森林病毒进行高效表达β
‑
半乳糖苷酶，目前尚未文献记载。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于，其以塞姆利基森林病毒为载体，提供一种sfv
‑
helper质粒、psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒及其制备方法，能高效表达β
‑
半乳糖苷酶。
6.本发明还要解决的技术问题还在于，提供sfv
‑
helper质粒、psfvcs
‑
lacz 病毒样颗粒的应用。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒的制备方法，包括：
8.(1)构建sfv
‑
helper质粒；
9.(2)将psfvcs
‑
lacz、sfv
‑
helper质粒体外转录成mrna，然后将mrna 共电转入bhk细胞中，得到psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒；
10.其中，所述sfv
‑
helper质粒是通过构建如seq id no.1所示的重组载体，并合成如seq id no.2所示的插入片段基因，然后将所述插入片段基因克隆入所述重组载体而得。
11.作为上述技术方案的改进，步骤(1)包括：
12.(1.1)构建重组载体，构建得到的重组载体的序列为seq id no.1；
13.(1.2)合成插入片段基因，所述插入片段的序列为seq id no.2；
14.(1.3)将重组载体与插入片段进行同源重组，重组的产物转化dh5α感受态细菌，涂布平板，倒置培养，提取质粒，得到sfv
‑
helper质粒，其中，所述sfv
‑
helper质粒的序列为seq id no.3。
15.作为上述技术方案的改进，步骤(1.3)包括：
16.将重组载体与插入片段进行同源重组，重组的产物转化dh5α感受态细菌，涂布氨苄抗性的lb平板，35
‑
38℃倒置培养10
‑
20小时，将菌落pcr阳性的菌落进行小摇，保菌，提取质粒；
17.然后将提取的质粒酶切鉴定及测序。
18.作为上述技术方案的改进，步骤(1.1)包括：
19.设计与合成引物，所述引物包括第一段
‑
f、第一段
‑
r、及第二段
‑
f、第二段
ꢀ‑
r：
20.以psfvcs
‑
lacz为模板，分别以第一段
‑
f、第一段
‑
r为引物扩增片段1，以第二段
‑
f、第二段
‑
r为引物扩增片段2进行扩增，得到载体片段1和载体片段2；
21.将所述载体片段1和载体片段2同源重组，得到重组产物；
22.将重组产物加入到感受态细胞dh5α细胞，进行重组产物转化；
23.将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
24.将鉴定后的重组产物提取质粒；
25.对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
26.作为上述技术方案的改进，所述引物的序列设计如下：
27.第一段
‑
f的序列为seq id no.4；
28.第一段
‑
r的序列为seq id no.5；
29.第二段
‑
f的序列为seq id no.6；
30.第二段
‑
r的序列为seq id no.7。
31.作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：
32.线性化所述psfvcs
‑
lacz和sfv
‑
helper；
33.将线性化后的psfvcs
‑
lacz及sfv
‑
heleper进行体外转录；
34.将psfvcs
‑
lacz及psfvcs
‑
heleper质粒体外转录的mrna共电转入bhk 细胞中，得到psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒。
35.相应的，本发明还提供一种sfv
‑
helper质粒，所述sfv
‑
helper质粒是通过构建如seq id no.1所示的重组载体，并合成如seq id no.2所示的插入片段基因，然后将所述插入片段基因克隆入所述重组载体而得。
36.相应的，本发明还提供了一种psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒，其由上述制备方法制成。
37.相应的，本发明还公开了一种sfv
‑
helper辅助质粒、psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒以及psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒的制备方法在β
‑
半乳糖苷酶的表达中的应用。
38.相应的，本发明还公开了一种sfv
‑
helper辅助质粒、psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒以及psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒的制备方法在食品、治疗药物、动物模型中的应用。
39.实施本发明，具有如下有益效果：
40.本发明通过构建辅助质粒sfv
‑
helper,然后将psfvcs
‑
lacz、sfv
‑
helper体外转录成mrna，再将mrna共电转入bhk细胞中，可以成功表达了β
‑
半乳糖苷酶。而且，所述psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒由于缺乏编码病毒核衣壳的基因，为复制缺陷型病毒，具有较高的生物安全性。
附图说明
41.图1是扩增载体片段1、2的模板质粒psfvcs
‑
lacz图谱；
42.图2是载体片段1、2扩增结果示意图；
43.图3是重组产物鉴定结果示意图；
44.图4是sfv
‑
helper重组质粒图谱；
45.图5是重组质粒sfv
‑
helper ncol酶切鉴定结果示意图；
46.图6是spei酶切psfvcs
‑
lacz及sfv
‑
heleper示意图；
47.图7是线性化psfvcs
‑
lacz体外转录示意图；
48.图8是线性化sfv
‑
heleper体外转录示意图；
49.图9是β
‑
半乳糖苷酶的检测表达(
×
200)示意图。
具体实施方式
50.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
51.本发明提供了一种psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒的制备方法，包括：
52.(1)构建sfv
‑
helper质粒；
53.所述sfv
‑
helper质粒是通过构建如seq id no.1所示的重组载体，并合成如seq id no.2所示的插入片段基因，然后将所述插入片段基因克隆入所述重组载体而得。
54.具体的，步骤(1)包括：
55.(1.1)构建重组载体，构建得到的重组载体的序列为seq id no.1；
56.(1.2)合成插入片段基因，所述插入片段的序列为seq id no.2；
57.(1.3)将重组载体与插入片段进行同源重组，重组的产物转化dh5α感受态细菌，涂布平板，倒置培养，提取质粒，得到sfv
‑
helper质粒，其中，所述 sfv
‑
helper质粒的序列为seq id no.3。
58.优选的，步骤(1.1)包括：
59.设计与合成引物，所述引物包括第一段
‑
f、第一段
‑
r、及第二段
‑
f、第二段
ꢀ‑
r：所述引物的序列设计如下：第一段
‑
f的序列为seq id no.4；第一段
‑
r的序列为seq id no.5；第二段
‑
f的序列为seq id no.6；第二段
‑
r的序列为seqid no.7。
60.以psfvcs
‑
lacz为模板，分别以第一段
‑
f、第一段
‑
r为引物扩增片段1，以第二段
‑
f、第二段
‑
r为引物扩增片段2进行扩增，得到载体片段1和载体片段2；
61.将所述载体片段1和载体片段2同源重组，得到重组产物；
62.将重组产物加入到感受态细胞dh5α细胞，进行重组产物转化；
63.将转化后的重组产物进行重组产物鉴定；
64.将鉴定后的重组产物提取质粒；
65.对所述质粒进行酶切鉴定及测序。
66.优选的，步骤(1.3)包括：
67.将重组载体与插入片段进行同源重组，重组的产物转化dh5α感受态细菌，涂布氨苄抗性的lb平板，35
‑
38℃倒置培养10
‑
20小时，将菌落pcr阳性的菌落进行小摇，保菌，提取质粒；
68.然后将提取的质粒酶切鉴定及测序。
69.更佳的，步骤(1.3)包括：
70.将重组载体与插入片段进行同源重组，重组的产物转化dh5α感受态细菌，涂布氨苄抗性的lb平板，37℃倒置培养10
‑
20小时，将菌落pcr阳性的菌落进行小摇，保菌，提取质粒；然后将提取的质粒酶切鉴定及测序。
71.下面以优选的具体实施例进一步阐述步骤(1)
72.(1.1)构建重组载体：
73.(a)引物设计与合成
74.根据snapgene软件，采用同源重组技术设计引物第一段
‑
f、第一段
‑
r、及第二段
‑
f、第二段
‑
r，在金唯智科技有限公司(苏州)合成，设计引物如下表1：
75.表1扩增载体片段的引物
[0076][0077]
(b)载体片段的扩增
[0078]
以psfvcs
‑
lacz(#92076)购自addgene为模板，分别以第一段
‑
f,第一段
‑
r 为引物扩增片段1；以第二段
‑
f,第二段
‑
r为引物扩增片段2，pcr体系和条件分别如下：
[0079]
表2片段1扩增pcr体系
[0080][0081]
表3片段1扩增pcr程序
[0082][0083][0084]
表4片段2扩增pcr体系
[0085][0086]
表5片段2扩增pcr程序
[0087][0088]
pcr扩增结束后进行1％核酸凝胶电泳鉴定，分别在3042bp、1665bp左右出现明显目的条带，于紫外光线下将含有目的条带的凝胶切下，尽量使切下的凝胶大小恰好包含所有目的条带，不要过大，切胶时要快速，切完立刻关闭紫外线，防止目的片段受到紫外线过度照射而降解。将切好的凝胶转移到2ml的 ep管中，进行胶回收，并测定dna浓度。
[0089]
(c)载体片段1、2同源重组
[0090]
胶回收结束后将载体片段1、片段2按照合适的体积，于冰上配置以下反应体系，体系如下表6：
[0091]
表6同源重组体系
[0092][0093][0094]
轻轻摇匀后，在37℃水浴锅中孵育30min中，然后放置4℃或冰上冷却。
[0095]
(d)重组产物转化
[0096]
在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞dh5α细胞，取10μl重组产物加入到 100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2
‑
3min。加入900μl soc，37℃摇菌1h (转速200
‑
250rpm)。将相应含氯霉素抗性的lb平板固体培养基在37℃培养箱中预热。5,000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒涂在有含氯霉素抗性的平板上轻轻涂匀。37℃培养箱中倒置培养 12
‑
16h。
[0097]
(e)重组产物鉴定
[0098]
过夜培养后，查看平板的菌落并挑取其中菌落进行菌液鉴定，至于加有含氯霉素抗性的lp培养基的2ml ep管中，在37℃的摇床中培养约5个小时，然后进行菌液鉴定,鉴定片段为4691bp，鉴定pcr体系如下表7：
[0099]
表7菌液鉴定pcr体系
[0100][0101]
取鉴定阳性的菌液100ul于加有含氯霉素抗性的lp培养基的50ml离心管中进行大摇，过夜培养。
[0102]
(f)提取质粒
[0103]
柱平衡步骤：向吸附柱cp3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液bl，12,000rpm(～13,400
×
g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0104]
取15ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm (～13,400
×
g)离心1min，尽量吸除上清。
[0105]
向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl溶液p1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
[0106]
向离心管中加入500μl溶液p2，温和地上下翻转6
‑
8次使菌体充分裂解。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组dna，造成提取的质粒中混有基因组dna片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
[0107]
向离心管中加入700μl溶液p3，立即温和地上下翻转6
‑
8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400
×
g)离心10min。注意：p3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
[0108]
将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱cp3中12,000rpm (～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0109]
向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw(请先检查是否已加入无水乙醇)， 12,000rpm(～13,400
×
g)离心30
‑
60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cp3放入收集管中。
[0110]
重复操作步骤7。
[0111]
将吸附柱cp3放入收集管中,12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱cp3开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
[0112]
将吸附柱cp3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50
‑
100 μl洗脱缓冲液eb，室温放置2min，12,000rpm(～13,400
×
g)离心2min将质粒溶液收集到离心管中。
[0113]
(g)重组载体测序
[0114]
提取的质粒进行酶切，经鉴定正确后，送去金唯智生物科技有限公司进行测序。
[0115]
(1.2)合成插入片段基因，
[0116]
需要插入的sfv
‑
heper基因的序列如seq id no.2所示，将其进行基因合成。
[0117]
(1.3)将重组载体与插入片段进行同源重组，
[0118]
(a)同源重组、转化及提取质粒
[0119]
将重组载体与插入片段进行同源重组。重组的产物转化dh5α感受态细菌，涂布氨苄抗性的lb平板，37℃倒置培养16小时。将菌落pcr阳性的菌落进行小摇，保菌，参照omega质粒小量提取试剂盒说明书提取质粒
[0120]
(b)质粒酶切鉴定及测序
[0121]
将提取的质粒酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；将验证正确的结果送到金唯智生物科技有限公司进行测序。
[0122]
(2)将psfvcs
‑
lacz、sfv
‑
helper质粒体外转录成mrna，然后将mrna 共电转入bhk细胞中，得到psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒；
[0123]
具体的，步骤(2)包括：
[0124]
(2.1)线性化所述psfvcs
‑
lacz和sfv
‑
helper；
[0125]
用spei分别酶切psfvcs
‑
lacz及sfv
‑
heleper，体系均为300ul，如下表8、 9。
[0126]
表8 spei酶切psfvcs
‑
lacz
[0127][0128]
表9 spei酶切复制质粒sfv
‑
heleper
[0129][0130]
(2.2)将线性化后的psfvcs
‑
lacz及sfv
‑
heleper进行体外转录；
[0131]
根据mmessage mmachine
tm
sp6转录试剂盒(am1340，购自赛默飞) 所述方法进行体外转录，体系如下：
[0132]
表10 psfvcs
‑
lacz体外转录体系
[0133]
[0134][0135]
表11 sfv
‑
heleper体外转录体系
[0136][0137]
上述体系配好后37℃转录40min，然后加入1ul gtp 37℃继续转录2h,随后再加入1ul turbo dnase37℃、15min。转录结束后分别吸取1ul转录产物，加入4ul的nuclease
‑
free water及6
×
loading buffer进行稀释，注意无菌操作及防止rna降解，然后在1％sds
‑
page中进行电泳实验，验证条带正确与否。
[0138]
(2.3)将psfvcs
‑
lacz及psfvcs
‑
heleper质粒体外转录的mrna共电转入bhk细胞中，得到psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒。
[0139]
具体，可以按如下步骤操作：
[0140]
1.细胞提前传至t75方瓶中，当细胞汇合度达到80％时，进行实验；
[0141]
2.在冰上预冷1.5ml ep管和pbs。在
‑
20℃冰箱中预冷4mm比色杯(电极杯)；
[0142]
3. 37℃预热6毫升培养基(含1％fbs dmem)；
[0143]
4.胰蛋白酶消化t75方瓶中细胞并用5毫升完全培养基重新悬浮；
[0144]
5. 500g、4℃离心5分钟；
[0145]
6.弃去上清液，并用10ml冰冷pbs清洗细胞颗粒；
[0146]
7. 500g、4℃离心5分钟，再次重复pbs清洗；
[0147]
8.弃去上清液并完全去除残留的pbs,并用遇冷的520ul pbs重悬细胞，均分成二等份，每份含260ul的pbs细胞重悬液别置于预冷的1.5mlep管；
[0148]
9.第一份pbs细胞重悬液分别加入10ul的psfvcs
‑
sp6
‑
lacz及psfvcs
‑
heleper转录产物；第二份pbs细胞重悬液不加入任何物质，也放置冰上；
[0149]
10.将上述三种混合物分别转移到3个预冷的电极杯(4mm)中，设置电转仪条件同为100v，25ms，电击一次，电击后置于冰上1min；
[0150]
11.然后分别向电极杯中加入约400ul的含1％fbs dmem吹打混匀，随即转至t25方瓶中，并加入6ml含1％fbs dmem,放置37℃5％co2培养箱中进行培养；
[0151]
12.电穿孔后8h至36h后，用倒置荧光显微镜进行观测，待36h后收取上清液；
[0152]
1.3.3β
‑
半乳糖苷酶的检测表达；
[0153]
按照β
‑
半乳糖苷酶原位染色试剂盒(碧云天)，将上述收取上清液后的细胞，进行原位β
‑
半乳糖苷酶的检测表达，阴性细胞去除上清液后作为对照。
[0154]
相应的，本发明还提供一种sfv
‑
helper质粒，所述sfv
‑
helper质粒是通过构建如seq id no.1所示的重组载体，并合成如seq id no.2所示的插入片段基因，然后将所述插入片段基因克隆入所述重组载体而得。所述sfv
‑
helper质粒的序列为seq id no.3。
[0155]
相应的，本发明还提供了一种psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒，其由上述制备方法制成。所示psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒可以成功表达了β
‑
半乳糖苷酶。而且，所述psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒由于缺乏编码病毒核衣壳的基因，为复制缺陷型病毒，具有较高的生物安全性。
[0156]
相应的，本发明还公开了一种sfv
‑
helper辅助质粒、psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒以及psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒的制备方法在β
‑
半乳糖苷酶的表达中的应用。
[0157]
相应的，本发明还公开了一种sfv
‑
helper辅助质粒、psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒以及psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒的制备方法在食品、治疗药物、动物模型中的应用。
[0158]
实验结果：将上述sfv
‑
helper辅助质粒、psfvcs
‑
lacz病毒样颗粒进行实验结果校验，具体如下；
[0159]
一、sfv
‑
helper辅助质粒
[0160]
(1)载体片段1、2的扩增
[0161]
结合图1和图2，图1是扩增载体片段1、2的模板质粒psfvcs
‑
lacz图谱，图2是载体片段1、2扩增结果，如图2所示，扩增的载体片段1、2分别是3042bp、 1665bp，与理论值相符合。
[0162]
需要说明的是，图2中，m由上至下分别为8000、5000、3000、1500、1000、 500bp，1至5均是扩增的载体片段2，6至10均是扩增的载体片段1。
[0163]
(2)重组产物鉴定
[0164]
分别挑取10个菌落，进行鉴定，如图3的1
‑
10大小均为4691bp左右，与理论值大小相符合。
[0165]
需要说明的是，图3中，m由上至下分别为8000、5000、3000、1500、1000、 500bp，1至10分别是单菌落鉴定片段。
[0166]
(3)重组载体测序
[0167]
将鉴定正确的质粒送至金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果完全相同。
[0168]
(4)将基因合成的插入片段克隆入重组载体
[0169]
重组质粒ncol酶切后，进行1％核酸凝胶电泳鉴定。结合图4和图5，图4 是sfv
‑
helper重组质粒图谱，图5是重组质粒sfv
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helper ncol酶切鉴定图。由图5可知，目标条带分别在1407bp、6785bp左右与理论值完全符合，送至金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果与原序列完全相同。
[0170]
二、psfvcs
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lacz病毒样颗粒
[0171]
(1)线性化psfvcs
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lacz及sfv
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heleper
[0172]
用spei分别酶切psfvcs
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lacz及sfv
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heleper，结果如图6所示，其中， m1由上至下分别是:15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp； m2由上至下分别是:8000、5000、3000、1500、1000、500bp，1是spei酶切 psfvcs
‑
lacz；2是spei酶切sfv
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heleper。线性
化后的目的条带大小与理论值相符。
[0173]
线性化后的psfvcs
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lacz及sfv
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heleper进行体外转录
[0174]
根据mmessage mmachine
tm
sp6转录试剂盒(am1340，购自赛默飞) 所述方法对psfvcs
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lacz和辅助质粒sfv
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heleper进行体外转录结果如图7、 8。图7中，m由上至下分别为：8000、5000、3000、1500、1000、500bp；1 为psfvcs
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lacz体外转录。图8中，m由上至下分别为：10000、7000、4000、2000、1000、500、200bp，2为sfv
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heleper体外转录。由7、8可知，体外转录后目的条带大小与理论值相符合。
[0175]
三、β
‑
半乳糖苷酶的检测表达
[0176]
按照β
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半乳糖苷酶原位染色试剂盒(碧云天)，将上述电转培养36h收取上清液后的细胞，进行原位β
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半乳糖苷酶的检测表达，同时将去除上清液的阴性细胞作为对照，如图9：阴性细胞未见有深蓝色变化，而有大量实验组细胞变成深蓝色，证明实验组有大量β
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半乳糖苷酶的表达。同时证明psfvcs
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lacz 病毒样颗粒的制备成功。
[0177]
综上所述，本发明通过构建辅助质粒sfv
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helper,将psfvcs
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lacz、 sfv
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helper体外转录成mrna，然后将mrna共电转入bhk细胞中，36h收获上清及对β
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半乳糖苷酶原位检测表达，结果有大量细胞变成深蓝色，而阴性细胞未出现颜色变化。因此，本发明采用塞姆利基森林病毒(semliki forest virus, sfv)为载体构建了一种病毒包装体系,成功表达了β
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半乳糖苷酶。
[0178]
以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
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