与胡萝卜中番茄红素主效QTL紧密连锁的KASP标记及其引物和应用的制作方法

与胡萝卜中番茄红素主效qtl紧密连锁的kasp标记及其引物和应用
技术领域
1.本发明属于分子标记辅助育种技术领域，具体涉及与胡萝卜中番茄红素主效qtl紧密连锁的kasp标记及其引物和应用。


背景技术：

2.胡萝卜是全球十大蔬菜作物之一，2019年全世界栽培面积达114.7万公顷，中国的种植面积为40.5万公顷，占全世界的35％，是世界上最大的胡萝卜生产国和主要出口国。在长期的栽培驯化过程中，胡萝卜的肉质根颜色发生了丰富的变异，有白色、黄色、橙色和红色等，这些颜色的形成主要与肉质根中类胡萝卜素的种类和含量有关。其中红色胡萝卜起源于中国和印度，是胡萝卜的主要类型之一，由于其肉质根中主要含有红色类胡萝卜素——番茄红素(可高达1000μg/g)，使肉质根的颜色呈红色，而其他颜色的肉质根中番茄红素含量极低或不含。番茄红素具有极强的抗氧化活性，其清除自由基的功效远胜于其它类胡萝卜素和维生素e，淬灭单线态氧的速率常数是维生素e的100倍，是迄今为止自然界中发现的最强抗氧化剂之一，具有明显的防癌抗癌作用。因此，番茄红素含量是胡萝卜重要的营养品质性状，是胡萝卜品种选育的目标性状之一。
3.目前，番茄红素富集的红色胡萝卜品种选育主要依靠观察成熟期肉质根的颜色来进行表型鉴定，该方法耗时较长，且胡萝卜肉质根形成期如遇高温会影响表型鉴定的准确性，而利用分子标记辅助选择可以较好地解决以上问题。kasp即竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr)，可在广泛的基因组dna样品中对snps和特定位点上的indels进行精准的双等位基因判断。由于snpline具有高度灵活性，其适合于各种基因的分型研究，具有成本低、通量高、实验操作安全和荧光信号采集数据准确等优势。因此，开发与红色胡萝卜中番茄红素含量相关主效qtl紧密连锁的kasp标记，在苗期可实现高通量快速鉴定番茄红素富集的红色胡萝卜类型，为番茄红素富集的红色胡萝卜品种选育提供新型、高效、实用的分子标记。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了与胡萝卜中番茄红素主效qtl紧密连锁的kasp标记，该标记可用于对胡萝卜高番茄红素种质材料进行鉴定，番茄红素富集的红色胡萝卜品种选育提供技术支持。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.本发明提供了与胡萝卜中番茄红素主效qtl紧密连锁的kasp标记，所述kasp标记包括如seq id no.1所示的dc_chr1.02725和如seq id no.2所示的dc_chr3.10274，所述dc_chr1.02725的snp变异位点为a/c，位于dc_chr1.02725的第100nt位碱基处，且位于1号染色体全长序列的第31078407位；所述dc_chr3.10274的snp变异位点为a/t，位于dc_chr3.10274的第100nt位碱基处，且位于3号染色体全长序列的第4222832位。
7.本发明经研究发现，胡萝卜红色自交系
‘
red1’中控制番茄红素的2个主效qtl lyco1.1和lyco3.1分别位于1号和3号染色体上，与lyco1.1紧密连锁的kasp标记为dc_chr1.02725，与lyco3.1紧密连锁的ksap标记为dc_chr3.10274。dc_chr1.02725标记位于胡萝卜1号染色体，序列如seq id no.1所示，其中第100nt位碱基处的碱基为a或c，dc_chr3.10274标记位于胡萝卜3号染色体，序列如seq id no.2所示，第100nt位点处的碱基为a或t。亲本材料
‘
red1’在dc_chr1.02725和dc_chr3.10274的测试位点的基因型为c:c/t:t，表现为红色，番茄红素含量高。
‘
fn29’的测试位点基因型为a:a/a:a，表现为橙色，不含番茄红素。
8.通过利用dc_chr1.02725和dc_chr3.10274标记对10份高番茄红素材料和20份低番茄红素材料的重测序数据分析，在1号染色体31078407位置查找到1个snp位点变异a/c，3号染色体4222832位置找到1个snp位点变异a/t，这两个位点的突变表现出两个位点同时为c:c和t:t组合时与高番茄红素紧密连锁。
9.此外，利用dc_chr1.02725和dc_chr3.10274标记对54份胡萝卜种质材料(28份红色高番茄红素材料和26份非红色低番茄红素胡萝卜种质材料)进行检测发现，dc_chr1.02725标记和dc_chr3.10274标记基因型为c:c/t:t的有31份，其中红色的高番茄红素材料28份，dc_chr1.02725和dc_chr3.10274标记基因型为c:c/a:a或a:a/a:a或a:a/t:t的种质材料共26份，都为非红色的低番茄红素材料，表明这组kasp标记鉴定的准确率达94.4％。表明该组kasp标记检测能用来筛选胡萝卜高番茄红素性状，在苗期可实现高通量快速鉴定胡萝卜高番茄红素类型，为胡萝卜品质育种提供有效的技术支持，具有重要的应用价值。
10.其中，dc_chr1.02725的序列(seq id no.1)为：
11.aaaaaacaagattctagagccataagtcttgataatccaaaggagcaaggacaagtttcatctacccgggtacgtcatgctcttgacatgggagatatga[a/c]atatgtctcagagttattgggtcgaaaacatcgtcttatgttgatgtggaatgctggggaaaagtttactagggaaaataataggatatcagcttcaaag(下划线部分为snp变异位点)；
[0012]
dc_chr3.10274的序列(seqidno.2)为：
[0013]
ttttggtccacattgtaagaattcaagaaggagcagctgaaagtgcaaattagcaatttaagagttctgaaaatatcaggggaaaggcctctgagtgcag[a/t]gaaacagagtcgattttacaaggaagtaaaggtggcaaaggagtgcaatgcaaatgacatccgtgcaaagtttgttaatgggcttctctatgttgtaatg(下划线部分为snp变异位点)。
[0014]
本发明还提供了用于扩增上述kasp标记的分子标记引物，所述分子标记引物包括分别与dc_chr1.02725和dc_chr3.10274相对应的两对引物组合，每对引物组合包括特异引物f、特异引物h和通用引物c，且特异引物f的5’端连接有fam基团的荧光标签序列，特异引物h的5'端连接有hex基团的荧光标签序列。
[0015]
具体地，所述fam基团的荧光标签序列为5'
‑
gaaggtgaccaagttcatgct
‑
3'(seq id no.9)，所述hex基团的荧光标签序列为5'
‑
gaaggtcggagtcaacggatt
‑3’
(seq id no.10)。
[0016]
优选地，所述分子标记引物包括dc_chr1.02725标记的引物组合dc_chr1.02725f、dc_chr1.02725h和dc_chr1.02725c以及dc_chr3.10274标记的引物组合dc_chr3.10274f、dc_chr3.10274h和dc_chr3.10274c，所述dc_chr1.02725f的核苷酸序列如seq id no.3所
示，所述dc_chr1.02725h的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述dc_chr1.02725c的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述dc_chr3.10274f的核苷酸序列如seq id no.6所示，所述dc_chr3.10274h的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述dc_chr3.10274c的核苷酸序列如seq id no.8所示。
[0017]
本发明还提供了含有上述分子标记引物的检测产品，所述检测产品包括检测试剂盒和检测试剂。
[0018]
本发明还提供了上述的kasp标记或者分子标记引物或者检测产品在以下任一方面中的应用：
[0019]
(1)检测胡萝卜高番茄红素性状；
[0020]
(2)胡萝卜种质资源改良；
[0021]
(3)培育高番茄红素胡萝卜；
[0022]
(4)胡萝卜种质材料的基因分型。
[0023]
优选地，上述应用的具体方法包括以下步骤：
[0024]
s1、提取待测胡萝卜基因组dna；
[0025]
s2、采用权利要求2或3所述的分子标记引物进行pcr扩增，并使用abi qs3荧光定量pcr仪读取荧光信号；
[0026]
s3、当dc_chr1.02725聚合在x轴且荧光信号呈红色及dc_chr3.10274聚集在x轴且荧光信号也呈红色时为红色高番茄红素基因型；当dc_chr1.02725聚合在x轴且荧光信号呈红色及dc_chr3.10274聚集在y轴且荧光信号呈蓝色时，或dc_chr1.02725聚合在y轴且荧光信号呈蓝色及dc_chr3.10274聚集在y轴且荧光信号蓝色时，或dc_chr1.02725聚合在y轴且荧光信号呈蓝色及dc_chr3.10274聚集在x轴且荧光信号红色时，为非红色低番茄红素基因型。
[0027]
进一步地，pcr的反应体系为30μl，包含2
×
kasp master mix 5μl，特异引物f 0.3μl，特异引物h 0.1μl，通用引物c 0.1μl，dna(10
‑
100ng)5μl，ddh2o 5μl。
[0028]
进一步地，pcr的反应程序为：95℃10min；95℃15sec，65
‑
55℃60sec，每个循环退火延伸温度降低1℃，共10个循环；95℃15sec，55℃60sec，共36个循环。
[0029]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0030]
本发明公开了胡萝卜中控制番茄红素含量的两个主效qtl，即1号染色体的lyco1.1和3号染色体的lyco3.1。并同时在1号染色体的31078407位置处查找到1个snp变异位点a/c，在3号染色体的4222832位置处找到1个snp变异位点a/t，当这两个位点同时突变为c:c和t:t组合时与高番茄红素紧密连锁。
[0031]
本发明基于上述变异位点成功开发了一组kasp标记，dc_chr1.02725和dc_chr3.10274，这组标记为胡萝卜上首次报道的与番茄红素紧密连锁的分子标记，所述分子标记dc_chr1.02725和dc_chr3.10274分别与控制番茄红素的2个主效qtl位点lyco1.1和lyco3.1紧密连锁，其中，dc_chr1.02725位于1号染色体上，dc_chr3.10274位于3号染色体上，当dc_chr1.02725的第36732764位碱基为c，且dc_chr3.10274的第4128452位碱基为t时，与番茄红素性状紧密连锁。该kasp标记组合在胡萝卜自然种质中检测的准确率为94.4％，充分表明该标记组合在胡萝卜中能够用来筛选红色高番茄红素性状，在苗期即可实现高通量快速鉴定红色胡萝卜类型，为番茄红素富集的红色胡萝卜育种提供了有效的技
术支持，具有重要的应用价值。
附图说明
[0032]
图1为亲本材料和f1材料；
[0033]
图2为番茄红素含量基于分离群体关联分析的manhattan图；
[0034]
图3为dc_chr1.02725和dc_chr3.10274标记在54份胡萝卜材料中的基因分型图。
[0035]
图3中，a表示dc_chr1.02725标记的基因分型；b表示dc_chr3.10274标记的基因分型；表示空白对照。
具体实施方式
[0036]
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0037]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
[0038]
实施例1与胡萝卜中番茄红素主效qtl紧密连锁的kasp标记及其应用
[0039]
1、实验材料
[0040]
红色高番茄红素胡萝卜材料
‘
red1’和橙色低番茄红素材料
‘
fn26’及用于分子标记应用的52份胡萝卜种质材料(27份红色高番茄红素材料和25份非红色低番茄红素胡萝卜种质材料，如表1所示)，由山西农业大学园艺学院收集和创制。
[0041]
表1 54份胡萝卜种质材料信息
[0042]
[0043][0044][0045]
2、实验步骤及实验结果
[0046]
(1)红色胡萝卜中番茄红素性状的基因定位
[0047]
以
‘
red1’(母本)和
‘
fn26’(父本)杂交构建f1代(图1)和f2代，由部分f2代典型单株(红色根色)自交获得f3家系，并由部分典型f3代单株(红色根色)自交获得f4代家系。2017年通过glm模型对95个f2群体的番茄红素含量性状进行关联分析(图2a)，所有染色体上都检测到显著相关的snp位点(p<1.33e
‑
06)，其中1号和3号染色体上分别检测到1697个和1696个，其余染色体上检测到1～10个不等。1号染色体上单个snp可解释的表型变异率(r2)为25.6％～52.5％，3号染色体上单个snp可解释的表型变异率(r2)为25.2％～65.2％，其余染色体上的snp可解释的表型变异率(r2)为25.5％～47.1％。将1号和3号染色体上的这两个显著关联区域命名为lyco1.1和lyco3.1，lyco1.1内最显著的snp位置为31845645bp，lyco3.1内最显著的snp位置为4807080bp。2018年利用mlm模型对285个f2、f3和f4联合群体单株番茄红素含量性状进行关联分析，也分别在1号和3号染色体上检测到显著相关的snp位点(p<7.47e
‑
07)110个和35个，且这些位点分别位于lyco1.1和lyco3.1区域内(图2b)，lyco1.1内最显著的snp位置为31740562bp，lyco3.1内最显著的snp位置为4842544bp，1号染色体上单个snp可解释的表型变异率(r2)为8.8％～9.1％，3号染色体上单个snp可解释的表型变异率(r2)为10.0％～12.8％。两个群体不同年份都检测到lyco1.1和lyco3.1两个主效的qtl位点，且最显著的snp位点较近。
[0048]
(2)lyco1.1和lyco3.1区域内kasp标记的引物设计
[0049]
对2个亲本进行全基因组重测序，在lyco1.1包含最显著snp位点的35.6mb
‑
37.5mb区间内和lyco3.1包含最显著snp位点的3.9mb
‑
5.9mb区间内筛选红色高番茄红素材料编码区的变异位点，在lyco1.1的区间内有5个基因编码区的6个位点(表2)，在lyco3.1的区间内有33个基因编码区的106个位点引起了非同义突变(表3)。并且在1号染色体31078407位置查找到1个snp位点变异a/c，3号染色体4222832位置找到1个snp位点变异a/t，这两个位点的突变表现出两个位点同时为c:c和t:t组合时与高番茄红素紧密连锁。利用primerpickerlite针对每个位点设计kasp引物，每对引物包括特异引物f、特异引物h和通用引物c。其中，特异引物f的5’端连接有fam基团的荧光标签序列5'
‑
gaaggtgaccaagttcatgct
‑
3'(seq id no.9)，特异引物h的5'端连接有hex基团的荧光标签序列5'
‑
gaaggtcggagtcaacggatt
‑3’
(seq id no.10)。
[0050]
表2 lyco1.1区间内的变异信息(基因id为ncbi的数据)
[0051][0052]
表3 lyco3.1区间内的变异信息
[0053]
[0054]
[0055]
[0056][0057]
(3)与lyco1.1和lyco3.1紧密连锁的kasp标记筛选及在自然群体中的应用
[0058]
将步骤(2)中设计的kasp引物在28份红色高番茄红素材料和26份非红色低番茄红素胡萝卜种质材料中进行基因分型。具体操作方法为；
[0059]
取54份种质材料的幼叶，通过ctab提取法获得胡萝卜的基因组dna，利用步骤(2)设计的kasp引物进行pcr扩增，pcr反应体系为30μl，其中包含2
×
kasp master mix 5μl，正向引物c 0.3μl，反向引物x 0.1μl，反向引物y 0.1μl，dna(10
‑
100ng)5μl，ddh2o 5μl。pcr反应程序为：95℃10min；95℃15sec，65
‑
55℃60sec，每个循环退火延伸温度降低1℃，共10个循环；95℃15sec，55℃60sec，共36个循环。使用abi qs3荧光定量pcr仪读取荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据不同的颜色输出基因型检测结果。其中，lyco1.1区间内的kasp标记dc_chr1.02725(如seq id no.1所示)和lyco3.1区间内的标记dc_chr3.10274(如seq id no.2所示)具有明显的基因分型效果。dc_chr1.02725标记的引物序列为：
[0060]
dc_chr1.02725f(特异引物f，seq id no.3)：gaaggtgaccaagttcatgcttcgacccaataactctgagacatatt；
[0061]
dc_chr1.02725h(特异引物h，seq id no.4)：gaaggtcggagtcaacggattcgacccaataactctgagacatatg；
[0062]
dc_chr1.02725c(通用引物c，seq id no.5)：ctacccgggtacgtcatgctctt；
[0063]
dc_chr3.10274标记的引物序列为：
[0064]
dc_chr3.10274f(特异引物f，seq id no.6)：gaaggtgaccaagttcatgctggaaaggcctctgagtgcaga；
[0065]
dc_chr3.10274h(特异引物h，seq id no.7)：gaaggtcggagtcaacggattggaaaggcctctgagtgcagt；
[0066]
dc_chr3.10274c(通用引物c，seq id no.8)：tcctttgccacctttacttccttgtaaa。
[0067]
当dc_chr1.02725聚合在x轴且荧光信号呈红色及dc_chr3.10274聚集在x轴且荧光信号也呈红色时(c:c/t:t基因型)为红色高番茄红素基因型；当dc_chr1.02725聚合在x轴且荧光信号呈红色及dc_chr3.10274聚集在y轴且荧光信号呈蓝色(c:c/a:a基因型)时，或dc_chr1.02725聚合在y轴且荧光信号呈蓝色及dc_chr3.10274聚集在y轴且荧光信号蓝色(a:a/a:a基因型)时，或dc_chr1.02725聚合在y轴且荧光信号呈蓝色及dc_chr3.10274聚
集在x轴且荧光信号红色(a:a/t:t基因型)时，为非红色低番茄红素基因型(具体见表4和图3)。
[0068]
结合被检测材料的表型与基因型分析发现，54份来源和类型不同的胡萝卜资源中，只有3株c:c/t:t基因型表现为非红色，表型与基因型不吻合，检测准确率达到94.4％。因此，当1号染色体上的snp变异位点为c及3号染色体上的snp变异位点为t时与番茄红素性状紧密连锁，与其对应的dc_chr1.02725和dc_chr3.10274为分别与lyco1.1和lyco3.1紧密连锁的kasp标记，该标记组合能够有效地检测胡萝卜高番茄红素性状。
[0069]
表4 dc_chr1.02725和dc_chr3.10274标记在胡萝卜自然群体中的检测结果
[0070]
[0071][0072]
(4)kasp标记组合基因型和表型的相关性分析
[0073]
对胡萝卜自然群体中dc_chr1.02725和dc_chr3.10274标记的基因型和表型进行pearson相关性分析，相关系数为0.544(p<0.01)，显示该标记组合与胡萝卜番茄红素性状紧密相关。
[0074]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。